Biblioteka sekwencyjna: fragmentacja, adaptery, indeksy i amplifikacja

Streszczenie

Biblioteka sekwencyjna jest zbiorem cząsteczek DNA albo cDNA przystosowanych do odczytu na konkretnej platformie. Zwykle zawiera badany insert oraz sekwencje techniczne potrzebne do przyłączenia do powierzchni lub pora, rozpoczęcia odczytu, rozdzielenia próbek i — w niektórych projektach — rozpoznania pierwotnych cząsteczek.

Przygotowanie biblioteki nie jest neutralnym „opakowaniem DNA”. Każdy krok wybiera część materiału:

próbka → ekstrakcja → fragmentacja lub selekcja → naprawa końców → adapter → indeks/UMI → amplifikacja → selekcja rozmiaru → pula → sekwenator.

Na końcu nie odczytujemy już próbki biologicznej bezpośrednio. Odczytujemy cząsteczki, które:

• przetrwały ekstrakcję;
• miały odpowiedni rozmiar i końce;
• przyjęły adaptery;
• nie zginęły podczas oczyszczania;
• zostały powielone albo zachowane w bibliotece PCR-free;
• trafiły do puli;
• mogły zostać zarejestrowane przez instrument.

Dobry projekt biblioteki zaczyna się od pytania biologicznego i przewidywanej klasy wariantu. Innej konstrukcji wymaga genom diploidalny, transkryptom, cfDNA, materiał FFPE, pojedyncza komórka, dawny DNA, amplicon, długi odczyt i wykrywanie wariantu o udziale 0,1%.

Najważniejsze rozróżnienia:

• indeks próbki mówi, z której próbki pochodzi odczyt;
• UMI ma identyfikować pierwotną cząsteczkę;
• duplikat PCR jest kopią wytworzoną po dołączeniu identyfikatora;
• insert jest badanym fragmentem między adapterami;
• read length nie jest tym samym co długość insertu;
• masa biblioteki nie jest liczbą cząsteczek bez uwzględnienia rozmiaru;
• wysoki uzysk nie gwarantuje reprezentatywności.

Artykuł rozszerza ogólny łańcuch Od próbki do sekwencji i przygotowuje do wyboru technologii w Sanger, krótkie i długie odczyty.

Warstwę genetyczną i diagnostyczną porządkują również rozdziały o sekwencjonowaniu i genomice w podręcznikach Ricki Lewis oraz pod redakcją Jerzego Bala.^7,8

Biblioteka jest produktem pomiarowym

W klasycznym klonowaniu molekularnym biblioteka może oznaczać zbiór insertów w wektorach. W sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym oznacza pulę cząsteczek gotowych do odczytu. Oba znaczenia łączy reprezentacja materiału wejściowego, ale architektura i sposób użycia są inne.

Biblioteka ma trzy zadania:

1. zachować informację biologiczną potrzebną do pytania;
2. dodać funkcje techniczne wymagane przez platformę;
3. umożliwić przypisanie sygnału do próbki i cząsteczki.

Nie musi zachować wszystkiego. Biblioteka panelowa celowo wybiera kilkaset regionów, RNA-seq usuwa lub pomija część RNA, a ATAC-seq wzbogaca fragmenty dostępnej chromatyny.

Jednostką nie zawsze jest cząsteczka wejściowa

W bibliotece shotgun jednostką może być fragment genomowego DNA. W RNA-seq — cząsteczka cDNA reprezentująca RNA. W ampliconach wiele odczytów może pochodzić z jednego produktu PCR, a nie z niezależnych genomów.

Przed analizą trzeba nazwać:

• jednostkę biologiczną: osoba, organizm, tkanka, komórka;
• jednostkę ekstrakcji;
• jednostkę biblioteki;
• jednostkę indeksowania;
• jednostkę odczytu;
• niezależne powtórzenie.

Trzy biblioteki z jednego ekstraktu są powtórzeniami technicznymi, nie trzema osobami.

Materiał wejściowy wyznacza możliwą bibliotekę

Przed rozpoczęciem trzeba ocenić:

• DNA, RNA czy mieszanina;
• ilość;
• stężenie i objętość;
• rozkład długości;
• integralność;
• czystość;
• obecność inhibitorów;
• proporcję materiału docelowego;
• oczekiwaną heterogeniczność;
• możliwość ponownego pobrania.

Sama wartość absorbancji nie wystarcza. Spektrofotometr może zaliczyć do „kwasu nukleinowego” krótkie fragmenty, nukleotydy i zanieczyszczenia absorbujące podobnie.

Masa nie mówi, ile jest genomów

Dla ludzkiego genomu diploidalnego jedna komórka zawiera około kilku pikogramów DNA jądrowego. Przeliczenie masy na liczbę ekwiwalentów genomu daje granicę liczby niezależnych kopii, ale nie uwzględnia:

• aneuploidii;
• komórek w S/G2;
• fragmentacji;
• DNA mitochondrialnego;
• DNA mikroorganizmów;
• strat;
• nierównomiernego odzysku.

Jeżeli na wejściu jest tylko kilkaset użytecznych genomów, nawet nieskończenie głębokie sekwencjonowanie nie stworzy nowych niezależnych cząsteczek.

Aliquot jest decyzją o ryzyku

Zużycie całej próbki może zwiększyć uzysk jednego eksperymentu, ale uniemożliwić:

• powtórzenie biblioteki;
• metodę ortogonalną;
• potwierdzenie tożsamości;
• badanie nową technologią;
• analizę przyczyny awarii.

Dla materiału nieodnawialnego plan zachowania części próbki powinien powstać przed biblioteką.

Fragmentacja ustala skalę obserwacji

Krótkie odczyty wymagają zwykle fragmentów mieszczących się w zakresie platformy i projektu. Długie odczyty często wymagają ochrony cząsteczek o dziesiątkach kilobaz lub więcej.

Fragment można uzyskać przez:

• mechaniczne ścinanie;
• sonikację;
• nebulizację lub hydrodynamiczne ścinanie;
• enzymy;
• transpozazę łączącą cięcie z dołączaniem sekwencji;
• naturalną degradację;
• PCR wyznaczający końce ampliconu.

Metody nie są równoważne.

Fragmentacja mechaniczna

Kontrolowane ścinanie może dać szeroki lub stosunkowo wąski rozkład. Wynik zależy od:

• energii;
• czasu;
• objętości;
• lepkości;
• stężenia;
• temperatury;
• geometrii naczynia;
• jakości początkowego DNA.

„Ten sam program” nie gwarantuje identycznego rozkładu przy innej objętości lub urządzeniu.

Fragmentacja enzymatyczna

Enzym może działać przy małym wejściu i bez specjalnego aparatu, ale jego preferencje sekwencyjne mogą wpływać na reprezentację. Czas, stosunek enzymu do DNA i temperatura zmieniają długość.

Przetrzymanie reakcji nie tylko skraca średnią. Może usunąć długi ogon rozkładu potrzebny do spanning repeat lub fazowania.

Tagmentacja

Transpozaza Tn5 może jednocześnie ciąć DNA i wprowadzać sekwencje adapterowe. Rozwiązanie skraca protokół i zmniejsza liczbę oczyszczeń; pierwotna praca wykazała wydajne tworzenie bibliotek shotgun z małego wejścia.¹

Tagmentacja nadal podlega:

• preferencjom insercji;
• zależności od stosunku enzym–DNA;
• ograniczeniu przy bardzo zdegradowanym materiale;
• problemom normalizacji;
• niepełnej informacji o obu końcach przed późniejszym PCR.

Nie należy utożsamiać szybkości z brakiem biasu.

Naturalna długość próbki może być sygnałem

cfDNA ma rozkład związany między innymi z ochroną nukleosomalną. Dawny DNA i materiał FFPE mają krótkie fragmenty oraz uszkodzone końce. Mechaniczne ścinanie takich próbek może zniszczyć informację o:

• pierwotnej długości;
• miejscach końców;
• wzorze ochrony;
• jakości materiału;
• autentyczności dawnego DNA.

W tych projektach biblioteka powinna dostosować się do istniejących fragmentów, a nie wymuszać standardowy rozmiar.

Długi odczyt zaczyna się przy pobraniu

Nie można odzyskać cząsteczki 100 kb, jeśli tkankę homogenizowano agresywnie, DNA wielokrotnie pipetowano wąską końcówką albo zamrażano w nieodpowiednich warunkach.

Przy wysokocząsteczkowym DNA kontroluje się:

• delikatną lizę;
• ograniczenie mieszania;
• szerokie końcówki;
• brak vortexu;
• transport i temperaturę;
• czas przechowywania;
• rozkład długości po ekstrakcji.

Parametr biblioteki jest często konsekwencją zdarzeń sprzed kilku dni.

Końce fragmentu trzeba przystosować do adaptera

Mechaniczne ścinanie tworzy mieszaninę końców. Typowy protokół ligacyjny może obejmować:

• naprawę uszkodzeń;
• wyrównanie końców;
• fosforylację 5′;
• usunięcie lub wypełnienie nadwieszeń;
• dodanie pojedynczego A na końcu 3′;
• ligację adaptera z komplementarnym T.

Dokładny zestaw zależy od systemu.

Naprawa może zmienić informację

Naprawa uszkodzonego DNA zwiększa liczbę ligowalnych cząsteczek, ale może:

• usuwać charakterystyczne uszkodzenia;
• zmieniać końce;
• utrudniać ocenę autentyczności;
• wprowadzać błędy zależne od enzymu.

W dawnym DNA częściowa i pełna naprawa odpowiadają na inne kompromisy między uzyskiem a zachowaniem sygnatury uszkodzeń.

Ligacja ma wydajność mniejszą niż 100%

Cząsteczka bez obu wymaganych adapterów może:

• nie przyłączyć się do powierzchni;
• nie zostać powielona;
• dać odczyt tylko z jednej strony;
• zniknąć w późniejszym oczyszczaniu.

Wydajność ligacji zależy od stężenia końców, czystości, geometrii adaptera, ATP, temperatury i aktywności ligazy.

Adapter jest modułem funkcjonalnym

Adapter może zawierać:

• sekwencję przyłączenia do flow cell;
• miejsce startera odczytu;
• indeks próbki;
• drugi indeks;
• UMI;
• miejsce startera do amplifikacji;
• sekwencję motora dla nanoporu;
• strukturę hairpin lub dumbbell;
• znacznik kontroli.

Rysunek „adapter–insert–adapter” jest uproszczeniem. Część sekwencji może zostać ukończona dopiero podczas PCR lub reakcji na platformie.

Adapter dimers są prawidłowym produktem złej pary

Jeśli dwa adaptery połączą się bez insertu, powstaje krótka cząsteczka. Może być preferencyjnie amplifikowana i klastrowana, zużywając odczyty.

Ryzyko rośnie przy:

• niskim wejściu;
• nadmiarze adaptera;
• niepełnym oczyszczaniu;
• złym doborze kulek;
• zbyt wielu cyklach PCR.

Pik krótkiego produktu w elektroforezie nie jest wyłącznie problemem estetycznym.

Indeks próbki służy demultipleksowaniu

Indeks, barcode próbki, to znana sekwencja przypisana do biblioteki. Po wspólnym runie odczyty są rozdzielane na próbki.

Układy mogą używać:

• jednego indeksu;
• dwóch indeksów;
• indeksów kombinatorycznych;
• unique dual indexes, UDI;
• inline barcode w początku odczytu.

Trzeba wiedzieć, gdzie indeks jest odczytywany i w jakiej orientacji zapisuje go oprogramowanie.

Indeks nie identyfikuje pierwotnej cząsteczki

Milion fragmentów tej samej próbki ma ten sam indeks. Indeks mówi „próbka A”, a nie „cząsteczka numer 582”.

Mylenie indeksu z UMI prowadzi do błędnego usuwania duplikatów i fałszywego przekonania o niezależności.

Podwójne indeksowanie ogranicza pomyłki

Zastosowanie indeksów po obu stronach pomaga wykrywać nieoczekiwane kombinacje. Praca Kircher, Sawyer i Meyer pokazała, że double indexing ogranicza błędne przypisania w multiplexie.²

W układzie UDI każda próbka ma unikalną parę, a nie parę zbudowaną z indeksów używanych również w innych próbkach. Ułatwia to odrzucanie kombinacji powstałych przez index hopping.

Index hopping i bleed-through

Odczyt może zostać przypisany do niewłaściwego indeksu przez:

• wolny adapter;
• zamianę indeksu na flow cell;
• niedokładność odczytu;
• zbyt małą odległość między sekwencjami indeksów;
• błąd arkusza próbek;
• kontaminację podczas pipetowania.

Problem jest szczególnie istotny, gdy bardzo obfita próbka dzieli run z próbką, w której szuka się rzadkiego sygnału.

UMI ma opisać cząsteczkę przed kopiowaniem

Unique molecular identifier jest krótką, zwykle częściowo losową sekwencją dołączaną przed amplifikacją. Odczyty o zgodnej pozycji, insercie i UMI można zgrupować w rodzinę pochodzącą od jednej cząsteczki.

UMI umożliwia:

• ocenę liczby pierwotnych cząsteczek;
• rozpoznanie kopii PCR;
• budowę konsensusu;
• zmniejszenie wpływu błędów późnych;
• oszacowanie nasycenia biblioteki.

Kivioja i współpracownicy pokazali użycie UMI do ilościowego liczenia cząsteczek DNA i RNA.³

UMI musi powstać dostatecznie wcześnie

Jeśli barcode dodano po kilku cyklach PCR, kopie jednej cząsteczki mogą otrzymać różne UMI. Nie można już odzyskać liczby wejściowych molekuł.

W RNA-seq znaczenie ma również moment względem odwrotnej transkrypcji. UMI na cDNA może liczyć produkty RT, niekoniecznie wszystkie pierwotne RNA.

Przestrzeń kodów jest skończona

Losowy UMI długości L ma teoretycznie 4^L sekwencji. Dla 8 nt jest to 65 536, dla 12 nt ponad 16 milionów.

Kody nie są wykorzystywane idealnie równomiernie. Przy wielu cząsteczkach pojawiają się kolizje: dwie niezależne molekuły dostają ten sam UMI. Analiza musi uwzględnić:

• długość kodu;
• złożoność biblioteki;
• błędy w UMI;
• pozycję mapowania;
• dopuszczalną odległość między kodami.

UMI nie naprawia błędu sprzed znakowania

Uszkodzenie próbki, błąd odwrotnej transkrypcji przed UMI albo wczesna mutacja PCR obecna we wszystkich potomkach może przetrwać konsensus.

UMI poprawia określony odcinek łańcucha pomiarowego, nie całą metodę.

Duplex sequencing wykorzystuje obie nici

W klasycznym konsensusie rodzina pochodzi z jednej nici. Błąd chemiczny obecny przed kopiowaniem może wyglądać jak prawdziwy wariant.

Duplex sequencing wiąże informację z obu komplementarnych nici pierwotnej cząsteczki. Prawdziwa zmiana powinna być zgodna po właściwym przekształceniu na obu niciach, a wiele uszkodzeń i błędów pojawi się tylko po jednej stronie.

Pierwotna metoda Schmitta i współpracowników została zaprojektowana do wykrywania niezwykle rzadkich mutacji w heterogenicznych próbkach.⁴

Czułość kosztuje cząsteczki i odczyty

Aby uzyskać duplex consensus, trzeba odczytać wystarczająco wiele kopii obu nici. Część rodzin pozostaje simplex. Surowa głębokość może być ogromna, a efektywne pokrycie duplex znacznie mniejsze.

Granica wykrywania zależy od:

• liczby niezależnych duplexów;
• utraty przy ligacji;
• równomierności;
• wymaganego minimum rodziny;
• błędów specyficznych dla locus;
• dostępnej masy wejściowej.

Amplifikacja zwiększa materiał, nie różnorodność

PCR biblioteki:

• uzupełnia sekwencje adapterów;
• wzbogaca cząsteczki z prawidłowymi końcami;
• daje ilość potrzebną do sekwencjonowania;
• może wprowadzać indeksy.

Nie tworzy nowych niezależnych fragmentów genomu.

Każdy cykl zmienia proporcje

Fragmenty różnią się:

• zawartością GC;
• długością;
• strukturą drugorzędową;
• dostępnością końców;
• zgodnością z starterami.

Aird i współpracownicy wykazali, że etap PCR był głównym źródłem silnego biasu GC w badanym protokole bibliotecznym, a wynik zależał również od polimerazy i parametrów termocyklera.⁵

Zbyt wiele cykli zwiększa:

• duplikację;
• jackpotting;
• heterodupleksy;
• chimery;
• błędy;
• nierównomierność.

Jackpot PCR

Jeśli jedna cząsteczka zostanie skopiowana skutecznie w pierwszym cyklu, jej potomstwo może stanowić dużą część końcowej biblioteki. Wysoki pik nie musi oznaczać wysokiej częstości w próbce.

UMI może rozpoznać rodzinę jako jedną cząsteczkę, o ile został dodany wcześniej.

Biblioteka PCR-free

Pominięcie PCR ogranicza część biasu i artefaktów, ale wymaga zwykle większego wejścia oraz wydajnej ligacji. Nadal pozostają bias:

• ekstrakcji;
• fragmentacji;
• selekcji rozmiaru;
• ligacji;
• klastrowania lub przejścia przez por;
• analizy.

PCR-free nie oznacza „bez biasu”.

Selekcja rozmiaru jest filtrem biologicznym

Selekcja może używać:

• kulek paramagnetycznych;
• żelu;
• kasety elektroforetycznej;
• filtracji;
• warunków ligacji;
• oczyszczania krótkich produktów.

Może być jednostronna, usuwająca krótkie fragmenty, albo dwustronna, tworząca okno.

Stosunek kulek nie jest jednostką długości

Rezultat zależy od:

• konkretnej chemii;
• stężenia PEG i soli;
• objętości;
• czasu wiązania;
• temperatury;
• mieszania;
• dokładności pipetowania;
• rozkładu wejściowego.

Warto zweryfikować wynik na rzeczywistej próbce, a nie traktować nominalnego cut-off jako ostrej granicy.

Wąskie okno może poprawić run i pogorszyć reprezentację

Jednorodny rozmiar pomaga klastrowaniu i składaniu par odczytów, ale usuwa:

• krótkie allele;
• bardzo długie inserty;
• zdegradowane fragmenty;
• określone produkty zmian strukturalnych.

W badaniu cfDNA lub dawnych próbek selekcja rozmiaru może zmienić skład biologiczny.

Paired-end zachowuje dwa końce insertu

W paired-end odczytuje się oba końce tej samej cząsteczki. Jeśli insert ma 350 bp, a odczyty 2×150, pozostaje luka około 50 bp. Jeśli insert jest krótszy niż suma długości odczytów, pary nakładają się i mogą wejść w adapter.

Informacja pary pomaga:

• mapować powtórzenia;
• wykrywać małe insercje i delecje;
• oceniać rozmiar insertu;
• wskazywać niezgodne orientacje;
• rozpoznawać część zmian strukturalnych.

Read length nie jest insert size

„Biblioteka 500 bp” często opisuje rozkład całej cząsteczki z adapterami albo insert, zależnie od laboratorium i aparatu. Raport powinien jawnie podać:

• czy długość obejmuje adaptery;
• medianę lub modalną długość insertu;
• pełny rozkład;
• długość odczytu;
• tryb single-end lub paired-end.

Biblioteka genomowa, panelowa i ampliconowa

Shotgun whole-genome

Fragmentacja ma dążyć do szerokiej reprezentacji genomu. Nie ma etapu celowego wzbogacania regionów, choć analiza może później ograniczyć się do części.

Zaletą jest możliwość ponownej analizy. Kosztem — odczyty wydane na regiony poza bieżącym pytaniem.

Capture

Sondy hybrydyzacyjne wybierają regiony komplementarne. Biblioteka powstaje przed lub częściowo podczas wzbogacania.

Bias zależy od:

• projektu sond;
• GC;
• podobieństwa paralogów;
• długości fragmentów;
• hybrydyzacji;
• liczby cykli;
• wersji panelu.

Brak odczytów poza targetem nie dowodzi delecji.

Hybrydyzacja jest konkurencją

Podczas capture fragment biblioteki konkuruje o sondę z innymi cząsteczkami. Skuteczność zależy od:

• temperatury i czasu;
• długości sondy;
• liczby sond na region;
• GC i struktur;
• podobieństwa paralogów;
• stężenia biblioteki;
• blokerów adapterów;
• obecności wariantu w miejscu wiązania.

Wariant lub duża delecja obejmująca miejsce sondy może obniżyć wychwyt właśnie badanego allelu. To capture dropout, którego nie należy mylić z homozygotycznością.

On-target nie jest kompletnością

Wysoki procent odczytów w celu może współistnieć z dziurami. Dwie biblioteki po 80% on-target mogą różnić się:

• odsetkiem zasad targetu pokrytych co najmniej 20×;
• równomiernością;
• duplikacją;
• pokryciem GC-rich;
• zdolnością wykrycia CNV;
• liczbą niezależnych cząsteczek.

Raport powinien pokazać rozkład pokrycia per region, nie tylko jedną średnią.

Amplicon sequencing

Startery PCR wyznaczają regiony. Metoda jest czuła i oszczędna, ale:

• allele dropout może ukryć wariant pod starterem;
• każdy amplicon ma inną wydajność;
• duplikaty są trudne do rozpoznania bez UMI;
• duże rearanżacje mogą nie amplifikować się;
• kontaminacja produktem PCR jest szczególnie groźna.

Liczba odczytów ampliconu nie jest automatycznie liczbą genomów.

Biblioteka RNA wymaga dodatkowych decyzji

RNA jest zwykle przepisywane na cDNA. Przedtem trzeba zdecydować:

• total RNA;
• selekcja poly(A);
• depletion rRNA;
• małe RNA;
• RNA bez poly(A);
• pełna długość czy końce;
• zachowanie kierunku;
• wykrywanie fuzji;
• degradacja.

Każda decyzja zmienia obserwowany transkryptom.

Poly(A) selection i rRNA depletion

Selekcja poly(A) wzbogaca dojrzałe mRNA z ogonem, ale pomija wiele niekodujących RNA i gorzej działa przy zdegradowanym materiale.

Usuwanie rRNA zachowuje szerszy zakres, lecz skuteczność zależy od sond, gatunku i jakości. Resztkowy rRNA może zużyć znaczną część runu.

Kierunkowość

Stranded library zachowuje informację, z której nici pochodzi transkrypt. Jest ważna przy:

• nakładających się genach;
• antysensownych RNA;
• precyzyjnej adnotacji;
• transkrypcji z obu stron regionu.

Kierunkowość zależy od chemii, a program analityczny musi otrzymać poprawną konwencję.

Odwrotna transkrypcja ma własny bias

Reverse transcriptase może:

• zatrzymać się na strukturze;
• preferować określone startery;
• przełączać matrycę;
• wprowadzać błędy;
• słabiej kopiować końce;
• tworzyć różną liczbę cDNA z RNA.

UMI w RNA-seq nie usuwa wszystkich tych efektów.

Indeksy komórkowe i UMI w single-cell

W typowym droplet scRNA-seq oligonukleotyd może zawierać:

• sekwencję techniczną;
• cell barcode;
• UMI;
• odcinek wiążący poly(A).

RNA z jednej kropli powinny otrzymać wspólny barcode komórki, a poszczególne cząsteczki różne UMI.

Kropla nie zawsze zawiera jedną komórkę

Możliwe są:

• empty droplets;
• doublets i multiplets;
• RNA ambient;
• uszkodzone komórki;
• różna liczba RNA;
• pęknięcie komórki przed zamknięciem.

Cell barcode identyfikuje przedział reakcji, nie gwarantuje biologicznej pojedynczej komórki.

UMI nasyca się lokalnie

W bardzo obfitym genie wiele cząsteczek konkuruje o skończony zestaw UMI. Korekta błędów barcode i kolizji jest częścią modelu obliczeniowego.

Macierz UMI nie jest absolutną liczbą wszystkich RNA w komórce, lecz liczbą wykrytych rodzin po stratach i filtrach.

Długie odczyty wymagają innej architektury

Biblioteka ligacyjna nanopore

Adapter może zawierać białko motorowe kontrolujące przejście nici przez por. Długość odczytu jest silnie zależna od długości cząsteczki wejściowej i jakości końców.

Agresywna selekcja krótkich fragmentów może zwiększyć N50, lecz usunąć biologicznie ważne krótkie cząsteczki. N50 nie jest jedynym kryterium.

Adaptery z wbudowanymi kontrolami mogą dostarczać wewnętrznej informacji o jakości i biasie; eksperymentalne CAPTORs pokazano dla nanopore i innych zastosowań.⁶

Rapid library

Transpozazowa szybka biblioteka upraszcza przygotowanie i może działać przy mniejszej liczbie kroków. Ceną może być inny rozkład długości, brak części funkcji ligacyjnych lub mniejsza kontrola.

„Rapid” opisuje workflow, nie automatycznie jakość dla każdego pytania.

SMRTbell

W platformie PacBio insert może zostać zamknięty hairpinami w kolistą cząsteczkę. Polimeraza wielokrotnie przechodzi przez ten sam insert, a powtórzenia tworzą konsensus HiFi.

Krótki insert daje więcej przejść, długi mniej. Projekt równoważy długość potrzebną do fazowania z liczbą powtórzeń potrzebnych do konsensusu.

Direct RNA

Bezpośredni odczyt RNA omija cDNA i część PCR, ale nadal wymaga adaptera, cząsteczki o odpowiednim końcu, motoru i algorytmicznego basecallingu. Obserwowany zbiór zależy od konstrukcji protokołu.

„Direct” nie znaczy, że każda cząsteczka RNA w próbce ma równą szansę odczytu.

Pula bibliotek musi być liczona molowo

Sekwenator przyjmuje cząsteczki, nie nanogramy jako takie. Przy tej samej masie biblioteka krótsza zawiera więcej molekuł niż dłuższa.

Przybliżona molarność dwuniciowego DNA:

n [mol] = masa [g] / (długość [bp] × 660 g/mol/bp).

Do obliczenia potrzebna jest reprezentatywna długość i stężenie specyficzne dla cząsteczek zdolnych do sekwencjonowania.

Qubit, elektroforeza i qPCR mierzą inne rzeczy

• fluorometr szacuje masę określonej klasy kwasu;
• elektroforeza pokazuje rozkład długości i część zanieczyszczeń;
• qPCR biblioteki mierzy cząsteczki z wymaganymi sekwencjami amplifikowalnymi;
• ddPCR może policzyć określone konstrukcje;
• sekwencjonowanie testowe pokazuje zachowanie na platformie.

Zgodna masa nie gwarantuje zgodnej molarności aktywnej biblioteki.

Pooling równomolowy nie zawsze daje równe odczyty

Biblioteki różnią się:

• rozmiarem;
• GC;
• wydajnością klastrowania;
• jakością;
• typem insertu;
• indeksami;
• obecnością adapter dimers.

Po pierwszym runie można skorygować proporcje re-poolingiem, ale plan powinien określić docelową liczbę niezależnych cząsteczek i odczytów, nie tylko procent puli.

Różnorodność pierwszych cykli wpływa na pomiar

W systemach obrazujących wiele klastrów równocześnie pierwsze cykle służą między innymi do lokalizacji i rozróżnienia sygnałów. Jeśli wszystkie inserty zaczynają się identycznie, jak w części bibliotek ampliconowych, instrument może mieć trudność z prawidłowym rozdzieleniem klastrów i kalibracją barw.

Rozwiązania zależą od platformy i mogą obejmować:

• dodanie biblioteki o zróżnicowanej sekwencji;
• heterogeneity spacers w starterach;
• zrównoważenie próbek;
• odpowiedni dobór indeksów;
• inne stężenie załadowania.

Dodanie kontroli o zróżnicowanej sekwencji poprawia zachowanie runu, ale zużywa część odczytów. Jej udział powinien wynikać z walidacji, a nie ze stałej wartości kopiowanej między projektami.

Zrównoważenie indeksów jest zależne od chemii

Zestaw indeksów powinien dostarczać dostateczne zróżnicowanie sygnału w każdym cyklu indeksowym. Przypadkowy wybór kilku indeksów z dużego zestawu może dać nierównowagę.

Przed poolingiem trzeba sprawdzić:

• zgodność zestawu z instrumentem;
• liczbę kanałów barwnych;
• orientację i5;
• wymagane kombinacje;
• minimalną odległość Hamminga;
• tolerancję demultipleksowania.

Problem projektu indeksów może wyglądać jak awaria całej biblioteki.

QC powinno prowadzić do decyzji

Pomiar bez wcześniej ustalonego kryterium łatwo racjonalizować po wyniku. Dla każdego typu biblioteki warto zapisać:

Pytanie	Przykładowy pomiar	Możliwa decyzja
Czy jest dość materiału?	masa, molarność, amplifikowalne cząsteczki	kontynuuj, powtórz, zmień pulę
Czy długość jest właściwa?	elektroforeza, modalna długość, ogon rozkładu	selekcja, ponowna fragmentacja, odrzucenie
Czy są dimery?	pik krótkiego produktu	dodatkowe oczyszczenie
Czy biblioteka jest złożona?	UMI, duplikaty, nasycenie testowego runu	nie pogłębiaj, powtórz od wejścia
Czy indeksy są poprawne?	arkusz, odczyt indeksów, nieoczekiwane pary	popraw demultipleksowanie lub bibliotekę
Czy kontrola jest czysta?	odczyty w blanku, profil taksonomiczny	analiza źródła, unieważnienie partii

Progi muszą być specyficzne dla zastosowania. Biblioteka do genotypu germinalnego i do wariantu 0,1% nie może mieć tych samych wymagań molekularnego pokrycia.

Powtórzyć bibliotekę czy pogłębić run

Pogłębienie ma sens, gdy biblioteka zawiera niewyczerpaną różnorodność. Jeśli krzywa nasycenia jest płaska, dodatkowe odczyty wytworzą głównie kolejne kopie tych samych fragmentów.

Nowa biblioteka z zachowanego ekstraktu może:

• odzyskać inne cząsteczki;
• ujawnić powtarzalność;
• zmniejszyć jackpot;
• sprawdzić błąd partii.

Nowa biblioteka z tego samego ekstraktu nadal nie naprawi biasu pobrania lub ekstrakcji.

Pilot może oszczędzić próbkę i cały run

Mały test pozwala ocenić:

• rozkład długości;
• liczbę aktywnych cząsteczek;
• złożoność;
• odsetek on-target;
• duplikację;
• zachowanie indeksów;
• poziom kontaminacji.

Pilot powinien mieć z góry określoną decyzję: jakie parametry prowadzą do skalowania, korekty albo zatrzymania.

Kontrole powinny przejść przez właściwy etap

Kontrola dodana po ekstrakcji nie wykrywa błędu ekstrakcji. Dodana po ligacji nie kontroluje ligacji.

Możliwe kontrole:

• blank pobrania;
• blank ekstrakcji;
• blank biblioteki;
• no-template control;
• materiał referencyjny;
• spike-in przed ekstrakcją;
• spike-in przed biblioteką;
• kontrola indeksu;
• niezależna biblioteka;
• replikat runu.

Każda ma własny zakres.

Kontrola negatywna może wymagać sekwencjonowania

Brak piku po PCR nie znaczy brak cząsteczek. Głęboki odczyt może ujawnić niską kontaminację, która ma znaczenie przy dawnym DNA, mikrobiomie, genetyce sądowej i rzadkich wariantach.

Blank nie powinien być automatycznie odrzucany jako „za mało DNA”.

Spike-in zużywa przepustowość

Za dużo kontroli może ograniczyć odczyt próbki, za mało — dać zbyt duży błąd losowy. Stężenie powinno być uzasadnione zakresem dynamicznym i celem.

Kontrola syntetyczna może zachowywać się inaczej niż chromatyna, RNA w komórce lub uszkodzone DNA.

Batch powstaje przy stole laboratoryjnym

Partią może być:

• dzień ekstrakcji;
• operator;
• lot odczynnika;
• płytka;
• pozycja studzienki;
• termocykler;
• zestaw indeksów;
• pula;
• flow cell;
• lane;
• instrument.

Jeśli wszystkie przypadki przygotowano w poniedziałek, a kontrole we wtorek, efekt biologiczny jest nierozdzielny od partii.

Randomizacja i blokowanie

Próbki należy rozłożyć tak, aby grupy biologiczne występowały w wielu partiach. Blokowanie może uwzględniać:

• grupę;
• płeć;
• wiek;
• jakość;
• miejsce pobrania;
• oczekiwaną ilość;
• operatora.

Nie zawsze da się wyrównać wszystko. Wtedy metadane muszą pozwolić modelować pozostałe różnice.

Układ płytki ma znaczenie

Brzegi mogą parować szybciej, wielokanałowa pipeta może przenieść błąd w kolumnie, a splash lub aerozol tworzyć lokalną kontaminację.

Mapa płytki jest częścią danych pierwotnych.

Wydajność biblioteki ma kilka mianowników

Można raportować:

• masę wejściową;
• masę po ligacji;
• masę po PCR;
• liczbę cząsteczek aktywnych;
• liczbę klastrów;
• odczyty przypisane do indeksu;
• odczyty po filtrze;
• unikalne fragmenty;
• rodziny UMI;
• pokrycie celu.

Wysoka masa po PCR może pochodzić z małej liczby nadmiernie skopiowanych cząsteczek.

Złożoność biblioteki

Złożoność opisuje liczbę różnych fragmentów zdolnych do odczytu. Można ją oceniać przez:

• odsetek duplikatów przy danej głębokości;
• krzywą nasycenia;
• preseq i podobne modele;
• liczbę rodzin UMI;
• rozkład startów i końców;
• niezależne molekularne pokrycie.

Duplikaty w ampliconie i RNA z bardzo obfitego genu mają inne znaczenie niż w losowej bibliotece genomowej.

Materiał trudny wymaga jawnych kompromisów

FFPE

Utrwalanie formaliną może powodować:

• fragmentację;
• wiązania krzyżowe;
• modyfikacje zasad;
• artefakty C>T;
• trudniejszą amplifikację;
• zmienną odzyskiwalność.

Krótki insert zwiększa odzysk, ale ogranicza informację o fazie i rearanżacjach. UMI i potwierdzenie mogą zmniejszyć część błędów, nie odtworzą utraconych molekuł.

cfDNA

Mała ilość, naturalny rozkład fragmentów i niski udział sygnału wymagają:

• osocza oddzielonego bez rozpadu leukocytów;
• kontroli czasu;
• UMI lub duplex dla bardzo rzadkich wariantów;
• dużej liczby niezależnych cząsteczek;
• ochrony przed kontaminacją genomowym DNA;
• raportowania molecular depth.

Surowe 50 000× może odpowiadać znacznie mniejszej liczbie unikalnych cząsteczek.

Dawny i śladowy DNA

Priorytetem są:

• krótkie fragmenty;
• uszkodzone końce;
• blanki;
• podwójne indeksy;
• minimalizacja transferu;
• niezależna replikacja;
• zachowanie sygnatury autentyczności.

Protokół dla świeżej krwi może całkowicie zgubić taki materiał.

Dokumentacja biblioteki jest częścią wyniku

Minimalny zapis obejmuje:

• identyfikator próbki i ekstraktu;
• datę, operatora i partię;
• ilość oraz jakość wejścia;
• metodę fragmentacji i parametry;
• protokół oraz wersję zestawu;
• numery lotów;
• adaptery, indeksy i orientację;
• moment dołączenia UMI;
• liczbę cykli PCR;
• selekcję rozmiaru;
• wyniki QC;
• skład puli;
• kontrole;
• odchylenia od protokołu;
• decyzję accept/reject.

Nazwa kitu bez wersji nie wystarcza, bo producent może zmieniać odczynniki, indeksy i warunki.

Arkusz indeksów jest danymi krytycznymi

Powinien zawierać:

• oczekiwaną sekwencję i7;
• oczekiwaną sekwencję i5;
• orientację dla instrumentu;
• identyfikator próbki;
• unikalność par;
• dozwoloną liczbę niedopasowań;
• kontrolę kolizji.

Błąd w arkuszu może zmieszać próbki mimo poprawnej chemii.

Pięć projektów, pięć bibliotek

Wariant germinalny w panelu

Cel: heterozygota około 50%.

Potrzeby:

• równomierne pokrycie targetu;
• kontrola allele dropout;
• odpowiedni insert;
• umiarkowana głębokość;
• potwierdzenie regionów trudnych.

UMI może pomóc, ale nie zawsze jest konieczne.

Mozaika 1%

Cel: odróżnić wariant od błędu.

Potrzeby:

• duża liczba genomów wejściowych;
• wczesny UMI;
• konsensus;
• najlepiej informacja duplex;
• blanki i kontrola pozytywna;
• metoda ortogonalna o odpowiedniej czułości.

Dziesięć tysięcy kopii PCR z pięciu cząsteczek nie daje granicy 1%.

Fuzja RNA

Cel: zachować połączenie transkryptów.

Potrzeby:

• RNA wystarczającej jakości;
• biblioteka kierunkowa;
• insert obejmujący junction lub paired-end;
• decyzja poly(A) kontra rRNA depletion;
• kontrola chimery RT/PCR;
• potwierdzenie na RNA i — gdy istotne — DNA.

Składanie de novo

Cel: długie ciągłe odcinki i faza.

Potrzeby:

• wysokocząsteczkowe DNA;
• łagodna ekstrakcja;
• długa biblioteka;
• ocena rozkładu, nie samego N50;
• krótkie odczyty lub HiFi do polerowania zależnie od projektu;
• Hi-C lub mapowanie do scaffoldingu, jeśli potrzebne.

scRNA-seq organoidu

Cel: proporcje stanów i heterogeniczność.

Potrzeby:

• żywa reprezentatywna zawiesina albo jądra;
• kontrola stresu dysocjacji;
• cell barcode i UMI;
• właściwa liczba komórek;
• kontrola doubletów i ambient RNA;
• replikaty biologiczne w różnych partiach.

Więcej komórek z jednego organoidu nie zastępuje kilku niezależnych organoidów.

Jak audytować gotową bibliotekę

1. Czy insert odpowiada pytaniu?
2. Czy rozkład długości jest zgodny z platformą?
3. Czy są adapter dimers?
4. Czy stężenie dotyczy aktywnych cząsteczek?
5. Czy indeksy są unikalne i poprawnie zorientowane?
6. Kiedy dodano UMI?
7. Ile cykli PCR wykonano?
8. Jak wygląda blank?
9. Czy próbki są zrandomizowane między partie?
10. Jakie są kryteria dopuszczenia?
11. Czy pozostał materiał do powtórzenia?
12. Jak będzie potwierdzony wynik?

Po runie wraca się do biblioteki

Objawy wskazujące na problem przygotowania:

• niski odsetek przypisanych indeksów;
• wysoki udział adaptera;
• skrajna duplikacja;
• nierówny GC;
• spadek jakości na końcu krótkiego insertu;
• wiele nieoczekiwanych par indeksów;
• brak określonych ampliconów;
• niska złożoność UMI;
• podobny sygnał w blankach i próbkach.

Analiza bioinformatyczna nie powinna maskować przyczyny laboratoryjnej.

Najczęstsze błędy

1. „Biblioteka jest wierną kopią próbki.” Jest wybranym zbiorem cząsteczek po stratach i biasach.
2. „Więcej PCR daje więcej informacji.” Daje więcej kopii istniejącej informacji.
3. „Indeks i UMI to to samo.” Pierwszy oznacza próbkę, drugi cząsteczkę.
4. „PCR-free nie ma biasu.” Usuwa tylko część źródeł.
5. „Read length to długość biblioteki.” Odczyt może obejmować tylko końce insertu.
6. „Równomolowy pooling daje równe odczyty.” Biblioteki różnią się zachowaniem.
7. „Qubit potwierdza gotowość do sekwencjonowania.” Mierzy masę, nie wszystkie funkcje adaptera.
8. „UMI usuwa wszystkie błędy.” Nie naprawia zdarzeń sprzed znakowania ani utraconych molekuł.
9. „Wysoka głębokość oznacza wiele genomów.” Duplikaty mogą pochodzić z małego wejścia.
10. „Jedna kontrola negatywna wystarczy.” Kontrole dodane na różnych etapach mają inny zakres.
11. „Standardowy insert pasuje każdej próbce.” cfDNA, FFPE, dawny DNA i long-read wymagają innych decyzji.
12. „Kit definiuje metodę.” Liczą się wersja, parametry i rzeczywisty produkt.

Co warto umieć po przeczytaniu

Czytelnik powinien potrafić:

• zdefiniować bibliotekę, insert, adapter, indeks i UMI;
• wyjaśnić, jak fragmentacja zmienia skalę obserwacji;
• porównać mechaniczne ścinanie, enzymy i tagmentację;
• opisać end repair, A-tailing i ligację bez traktowania ich jako neutralnych;
• odróżnić indeks pojedynczy, podwójny, kombinatoryczny i UDI;
• wyjaśnić index hopping;
• ocenić, kiedy UMI i duplex są uzasadnione;
• rozpoznać bias PCR i znaczenie złożoności;
• przeliczyć masę oraz długość na molarność;
• dobrać RNA poly(A), rRNA depletion i strandedness;
• opisać różnice bibliotek krótkich, nanopore i SMRTbell;
• zaprojektować kontrole, randomizację i dokumentację;
• powiązać objawy po runie z etapem biblioteki.

Literatura i źródła