Sekwencjonowanie nanoporowe

Streszczenie

Sekwencjonowanie nanoporowe mierzy zmiany prądu jonowego, gdy pojedyncza nić DNA albo RNA przechodzi przez białkowy por osadzony w błonie. Aparat nie rozpoznaje jednej zasady w izolacji. Zwężenie pora obejmuje kilka nukleotydów, dlatego sygnał zależy od lokalnego k-meru, modyfikacji, szybkości ruchu i stanu pora.

Łańcuch pomiarowy:

natywna cząsteczka → adapter i motor → por → prąd w czasie → segmentacja sygnału → basecalling → read → mapowanie/assembly → wariant lub modyfikacja.

Najważniejsze zalety:

• reads od kilku do setek tysięcy zasad, a w specjalnych przygotowaniach dłuższe;
• zachowanie haplotypu i punktów rearanżacji;
• natywny DNA z sygnałem modyfikacji;
• bezpośredni odczyt RNA;
• dane w czasie rzeczywistym;
• możliwość selekcji cząsteczek podczas runu;
• skalowanie od małych do wysokoprzepustowych urządzeń.

Najważniejsze ograniczenia:

• długość zależy od integralności materiału;
• dokładność zależy od chemii, trybu i basecallera;
• część błędów jest systematyczna dla kontekstu;
• wydajność porów zmienia się w czasie;
• ultradługi read nie gwarantuje reprezentatywnej biblioteki;
• sygnał modyfikacji wymaga osobnego modelu i kontroli;
• realtime nie skraca automatycznie ekstrakcji, interpretacji i walidacji.

Artykuł skupia się na nanopore. Porównanie z Sangerem, krótkimi reads i HiFi znajduje się w Sanger, krótkie i długie odczyty, a konstrukcję adapterów rozwija Biblioteka sekwencyjna.

Por jest czujnikiem w obwodzie jonowym

Błona oddziela dwa roztwory elektrolitu. Przyłożone napięcie wywołuje przepływ jonów przez por. Gdy kanał jest otwarty, prąd ma określony poziom. Cząsteczka kwasu nukleinowego w zwężeniu częściowo blokuje przepływ.

Wartość prądu zależy od:

• zasad w najwęższym obszarze;
• orientacji nici;
• modyfikacji chemicznych;
• konformacji;
• temperatury;
• napięcia;
• buforu;
• konkretnego pora;
• szybkości translokacji.

Sekwencja jest wnioskowana z trajektorii, nie z jednego idealnego poziomu.

Kilka zasad wpływa jednocześnie

Jeżeli sensor obejmuje k-mer, zmiana jednej zasady wpływa na kilka kolejnych próbek sygnału. Sąsiedztwo ma znaczenie. To różni pomiar od prostego odczytu „jedna zasada — jedna barwa”.

Homopolimer nie składa się z łatwo policzalnych osobnych impulsów. Długość trzeba wywnioskować z czasu, dynamiki i modelu.

Motor zamienia swobodny ruch w mierzalny proces

Bez kontroli nić przeszłaby zbyt szybko i nieregularnie. Białko motorowe przy adapterze:

• chwyta cząsteczkę;
• doprowadza ją do pora;
• przesuwa krokami;
• reguluje szybkość;
• wpływa na kierunek odczytu.

Nie każda cząsteczka z adapterem dociera do aktywnego pora. Nie każda, która zacznie, zostanie odczytana do końca.

Zatrzymanie readu ma wiele przyczyn

• pęknięcie cząsteczki;
• odłączenie motoru;
• zablokowanie pora;
• koniec DNA;
• zmiana napięcia;
• decyzja adaptive sampling;
• utrata stabilności błony;
• interwencja software.

Read length jest właściwością całego procesu.

Flow cell jest populacją sensorów

Urządzenie zawiera wiele kanałów z porami. Elektronika mierzy je równolegle. Nie wszystkie pozycje są aktywne, a część może zawierać:

• pojedynczy użyteczny por;
• kilka porów;
• por niedostępny;
• por zablokowany;
• niestabilną błonę;
• sygnał poza zakresem.

Przed runem i podczas niego wykonywane są testy oraz wybór kanałów.

Aktywne pory nie są stałą liczbą

Liczba może maleć wskutek zużycia i zablokowania. Procedury mux scan lub podobne przełączają elektronikę między dostępnymi sensorami.

Yield zależy od:

• liczby aktywnych porów;
• szybkości;
• czasu;
• zajętości;
• długości cząsteczek;
• przerw;
• jakości biblioteki.

Occupancy ma optimum

Za małe stężenie daje idle pores. Za duże może:

• zwiększyć agregaty;
• zatykać;
• podnieść udział krótkich fragmentów;
• pogorszyć stabilność;
• marnować bibliotekę.

Optymalne loading nie jest tym samym dla szybkiej i ultradługiej biblioteki.

Biblioteka ligacyjna zachowuje długi insert

Typowy workflow DNA może obejmować:

1. HMW extraction;
2. opcjonalną selekcję rozmiaru;
3. naprawę końców i uszkodzeń;
4. end-prep;
5. ligację adaptera;
6. oczyszczanie;
7. loading.

Adapter zapewnia przyłączenie motoru i funkcje platformy.

Ligation efficiency ogranicza odzysk

DNA bez właściwego adaptera nie będzie produktywnie sekwencjonowane. Przy małej liczbie końców, inhibitorach albo niewłaściwym stanie DNA część materiału znika funkcjonalnie mimo obecności masy.

Molarność aktywnej biblioteki może różnić się od wartości fluorometru.

Rapid library zamienia część kontroli na szybkość

Transpozazowe przygotowanie może równocześnie ciąć i dołączać sekwencje techniczne. Jest szybkie i użyteczne w zastosowaniach realtime.

Może jednak:

• skracać cząsteczki;
• mieć bias insercji;
• dawać inny rozkład;
• ograniczać funkcje adaptera;
• gorzej odpowiadać projektowi ultralong.

Ultradługie reads zaczynają się przed ekstrakcją

Jain i współpracownicy wykorzystali nanopore ultralong reads do złożenia genomu człowieka i rozwiązania regionów trudnych dla krótkich danych.¹

Uzyskanie takiego materiału wymaga:

• świeżej lub odpowiednio zabezpieczonej tkanki;
• łagodnej lizy;
• ograniczenia pipetowania;
• szerokich końcówek;
• braku vortexu;
• unikania wielokrotnego zamrażania;
• delikatnego oczyszczania;
• kontroli nuclease.

N50 nie zastępuje rozkładu

Read N50 to długość, powyżej której leży połowa wszystkich odczytanych baz. Dwa zbiory o tym samym N50 mogą mieć inny:

• udział ultralong;
• liczbę krótkich reads;
• medianę;
• maksymalną długość;
• yield;
• pokrycie targetu.

Do powtórzenia 100 kb ważny jest udział reads przechodzących cały region, nie tylko N50.

Size selection zmienia pytanie

Usunięcie krótkich fragmentów może zwiększyć udział długich baz, ale usuwa:

• małe plazmidy;
• mtDNA;
• zdegradowane allele;
• część breakpointów;
• krótkie organizmy w metagenomie.

Selekcję trzeba uzasadnić biologicznie.

Prąd jest próbkowany w czasie

Elektronika rejestruje kolejne wartości. Raw signal wymaga:

• skalowania;
• oceny open pore;
• wykrycia początku i końca;
• segmentacji;
• filtracji;
• przypisania kanału i czasu.

Format danych może przechowywać sygnał, basecalle, metadane i modyfikacje w różnych warstwach.

Event nie zawsze odpowiada krokowi jednej zasady

Starsze pipeline’y dzieliły sygnał na events. Współczesne modele mogą pracować bardziej bezpośrednio na szeregu czasowym.

Nie należy interpretować liczby próbek sygnału jako liczby nukleotydów bez modelu prędkości.

Basecalling jest zależny od modelu

Model otrzymuje sekwencję prądu i przewiduje:

• zasady;
• jakość;
• granice;
• czasem modyfikacje;
• informacje duplex.

Zmiana modelu może poprawić wynik z tego samego raw signal.

Model musi pasować do chemii

Pore, motor, szybkość i kit zmieniają relację sygnał–sekwencja. Model dla innej konfiguracji może dać systematyczne błędy.

Raport powinien zawierać:

• wersję flow cell;
• kit;
• basecaller;
• model;
• tryb szybkości/jakości;
• datę;
• parametry.

Fast, high-accuracy i super-accuracy są kompromisem

Szybszy model skraca czas i może działać realtime. Dokładniejszy wymaga większych zasobów. Wybór wpływa na:

• czas do wyniku;
• GPU/CPU;
• koszt;
• accuracy;
• późniejszy variant calling.

Najlepszy model nie naprawi biblioteki o małej złożoności.

Simplex, duplex i consensus to różne dowody

Simplex read pochodzi z jednej nici. Duplex read łączy sygnał obu komplementarnych nici tego samego dupleksu, jeśli obie zostały poprawnie rozpoznane i odczytane.

Prawdziwa zmiana jest komplementarna na obu niciach. Część błędów i uszkodzeń jest jednostronna.

Duplex zmniejsza yield efektywny

Nie każdy dupleks dostarczy obie nici. Wymaganie duplex:

• odrzuca simplex;
• potrzebuje odpowiedniej biblioteki;
• zmienia przepustowość;
• zwiększa compute;
• może skrócić dostępny kontekst.

Wynik należy raportować oddzielnie.

Consensus z wielu molekuł

Polishing i variant calling integrują niezależne reads. To inny consensus niż duplex jednej cząsteczki.

Wysokie pokrycie pomaga błędom losowym, lecz błąd systematyczny w tym samym k-merze może pozostać.

Profil błędu jest zależny od kontekstu

Typowe trudności:

• homopolimery;
• krótkie tandem repeats;
• konkretne k-mery;
• modified bases;
• szybko zmieniający się sygnał;
• przerwy i skoki;
• chimery;
• słaby początek lub koniec;
• strand-specific bias.

Nie można opisać platformy jedną średnią accuracy.

Quality score wymaga kalibracji

Q-score jest prognozą błędu basecallu. Warto sprawdzić:

• rozkład;
• accuracy po mapowaniu;
• zależność od długości;
• kontekst;
• model;
• próg filtrowania.

Q nie jest mapping quality ani variant quality.

Modyfikacja może wyglądać jak błąd

Jeżeli model zakłada niezmodyfikowany DNA, zmieniony sygnał może zostać błędnie przypisany. Demodyfikacja przez WGA może poprawić sekwencję, ale usuwa natywny epigenom.

Trzeba wybrać priorytet.

Natywna metylacja jest informacją z tego samego sygnału

Simpson i współpracownicy pokazali wykrywanie 5-metylocytozyny CpG z prądu nanopore przy użyciu danych kontrolnych.²

Call modyfikacji zależy od:

• typu modyfikacji;
• motywu;
• modelu;
• pokrycia;
• jakości;
• strand;
• próbki kontrolnej.

Procent metylacji jest estymatą cząsteczek

Jeśli 7 z 10 reads ma call methylated, wartość 70% ma dużą niepewność. Reads mogą pochodzić z różnych:

• komórek;
• alleli;
• tkanek;
• duplikatów;
• jakości.

Long read pozwala badać współwystępowanie modyfikacji na jednej cząsteczce, ale nie identyfikuje komórki bez dodatkowego barcode.

Allele-specific methylation

Jeżeli read zawiera heterozygotyczne warianty i CpG, można przypisać modyfikację do haplotypu. Jest to przydatne w imprintingu i chromosomie X.

Wymaga poprawnej fazy i kontroli biasu allelicznego.

Direct RNA omija cDNA, ale nie wszystkie filtry

Garalde i współpracownicy zademonstrowali równoległy bezpośredni odczyt RNA w nanopore bez etapu RT/PCR jako podstawowego pomiaru sekwencji.³

Direct RNA może zachować:

• pełne kombinacje splice junction;
• poly(A);
• orientację;
• część sygnału modyfikacji;
• pojedyncze cząsteczki.

Direct nie oznacza pełnego transkryptomu

Biblioteka zwykle selekcjonuje określony koniec lub klasę RNA. Przeszkody:

• degradacja;
• małe wejście;
• niepełne reads;
• bias końca;
• słabsza dokładność;
• mniejszy yield;
• brak części RNA bez odpowiedniej konstrukcji.

W badaniu systematycznym aktualnych direct RNA reads nadal obserwowano powtarzalne błędy zależne od kontekstu.⁴

cDNA i direct RNA odpowiadają na różne pytania

cDNA może dać więcej molekuł i wyższą dokładność konsensusu, ale wprowadza:

• RT bias;
• template switching;
• PCR;
• utratę części modyfikacji.

Projekt może używać obu.

Dane pojawiają się podczas runu

Basecalling i analiza mogą działać strumieniowo. Pozwala to:

• rozpoznać patogen;
• ocenić pokrycie;
• zakończyć po osiągnięciu endpointu;
• zmienić decyzję operacyjną;
• monitorować kontaminację.

Realtime obejmuje więcej niż szybki pierwszy read. Potrzebne są:

• szybka ekstrakcja;
• gotowy workflow;
• referencja;
• compute;
• kryterium stop;
• walidacja.

Time to first answer i time to final answer

Pierwsze dopasowanie może pojawić się w minutach. Wiarygodny wynik może wymagać:

• wielu reads;
• kontroli;
• pełnego targetu;
• konsensusu;
• niezależnego potwierdzenia.

Raportowanie obu czasów zapobiega marketingowemu skrótowi.

Read Until steruje cząsteczką po rozpoczęciu

Urządzenie może basecallować początek readu, mapować go i odwrócić napięcie, aby wyrzucić niepożądaną cząsteczkę. Loose, Malla i Stout pokazali real-time selective sequencing oraz normalizację ampliconów.⁵

Adaptive sampling nie wychwytuje targetu przed porem. Zużywa czas na decyzję.

Efektywność zależy od czasu rozpoznania

Dla bardzo krótkich fragmentów duża część może przejść przed decyzją. Dla długich genomowych molekuł odrzucenie po kilkuset zasadach oszczędza znacznie więcej czasu.

Znaczenie mają:

• szybkość basecallingu;
• długość unikalnej kotwicy;
• referencja;
• liczba targetów;
• compute;
• latency;
• rozkład długości.

Enrichment i depletion

Można:

• zatrzymywać reads targetu;
• odrzucać host;
• równoważyć regiony;
• kończyć dobrze pokryte cele.

Depletion host może zachować mikroorganizmy, ale sekwencje podobne do hosta mogą zostać błędnie odrzucone.

Mapowanie długiego readu ma własne problemy

Dłuższa kotwica pomaga, lecz aligner musi obsłużyć:

• dużą liczbę błędów;
• długie indels;
• split alignment;
• rearanżacje;
• chimery;
• duplikacje;
• alternatywne haplotypy.

Mapping quality zależy od referencji i programu.

Pangenom może zmniejszyć bias referencji

Graf z alternatywnymi haplotypami lepiej reprezentuje sekwencje nieobecne w liniowej referencji. Zwiększa jednak złożoność reprezentacji i porównania wariantów.

Raw read pozostaje ten sam; zmienia się interpretacja położenia.

Nanopore jest silny dla wariantów strukturalnych

Read może bezpośrednio przechodzić przez:

• delecję;
• insercję;
• inwersję;
• translokację;
• ekspansję;
• mobilny element;
• tandem duplication.

Ultralong reads pozwoliły rozwiązać części genomu wcześniej niedostępne, ale pojedynczy read nie wystarcza.

Dowód SV powinien mieć kilka warstw

• kilka niezależnych reads;
• zgodne breakpointy;
• obie orientacje;
• depth;
• assembly lokalne;
• brak podobnego sygnału w kontroli;
• potwierdzenie ortogonalne.

Chimery biblioteczne mogą wyglądać jak translokacje.

De novo assembly korzysta z kontekstu

Długie reads upraszczają graf, bo przechodzą przez powtórzenia. Workflow:

1. QC i filtrowanie;
2. korekta lub odpowiedni assembler;
3. graf;
4. rozwiązywanie haplotypów;
5. polishing;
6. scaffolding;
7. kontrola kompletności i struktury;
8. adnotacja.

Nanopore może dostarczyć ultralong szkielet, a HiFi lub krótkie reads pomóc w dokładności.

Polishing może zmienić biologiczny allel

Jeśli consensus zakłada jeden haplotyp, heterozygotyczność może zostać spłaszczona. Krótkie reads z biasem referencji mogą „naprawić” prawidłową sekwencję alternatywną.

Assemblies diploidalne wymagają fazowania.

Metagenom i małe genomy korzystają z realtime

Długie reads mogą łączyć:

• gen oporności z plazmidem;
• wyspę genomową z gospodarzem;
• operon z kontekstem;
• pełny genom małego wirusa;
• szczep z wariantami.

Bias ekstrakcji nadal dominuje

Łatwa liza jednej bakterii i trudna drugiej zmienia proporcje przed nanopore. Długi odczyt nie naprawia utraconych komórek.

Kontrole ekstrakcji i spike-in są konieczne.

Kontaminacja w low biomass

Odczynniki i środowisko mogą dostarczyć DNA. Realtime identyfikacja nie odróżnia automatycznie patogenu od kontaminantu.

Potrzebne są blanki i kontekst kliniczny.

Przenośność ma warunki brzegowe

Mały sekwenator może działać poza centrum, ale workflow potrzebuje:

• stabilnego zasilania;
• chłodzenia odczynników;
• czystej ekstrakcji;
• pipet;
• komputera lub akceleratora;
• storage;
• internetu albo lokalnych baz;
• kontroli jakości;
• bezpiecznych odpadów.

„Kieszonkowy sekwenator” nie oznacza kieszonkowego laboratorium.

Warunki środowiska wpływają na wynik

Temperatura, kurz, wstrząsy, wilgotność i opóźnienie transportu próbki mogą zmienić ekstrakcję, pory i compute.

Walidacja terenowa musi odtwarzać realne warunki.

Metryki runu trzeba interpretować razem

Warto śledzić:

• yield baz;
• liczbę reads;
• read N50;
• medianę długości;
• Q-score;
• aktywne pory;
• occupancy;
• szybkość;
• channel health;
• udział simplex/duplex;
• czas;
• odsetek mapowania;
• coverage;
• kontaminację.

Wysoki yield krótkich reads może nie rozwiązać powtórzenia. Wysokie N50 przy małej liczbie baz może nie wystarczyć do genomu.

Wykres yield w czasie

Plateau może wynikać z:

• wyczerpania biblioteki;
• spadku porów;
• blokad;
• złego loading;
• pauzy software;
• temperatury.

Pojedyncza końcowa liczba ukrywa mechanizm.

Kontrole są zależne od tezy

Kontrola sekwencji

Znany genom pozwala ocenić:

• accuracy;
• indels;
• homopolimery;
• mapping;
• model.

Nie kontroluje HMW extraction badanej tkanki, jeśli jest gotową biblioteką.

Kontrola modyfikacji

Potrzebne są próbki:

• methylated;
• unmethylated;
• najlepiej o tym samym kontekście;
• z niezależnym pomiarem.

Model może różnie działać w innym gatunku.

Kontrola adaptive sampling

Trzeba mierzyć:

• on-target yield;
• depletion;
• czas decyzji;
• straty targetu;
• długość odrzuconych;
• koszt pora;
• regiony bez unikalnej kotwicy.

Multipleksowanie nanopore ma własny bilans

Barcode można dołączyć ligacyjnie, przez PCR albo w innym etapie biblioteki. Po runie read jest przypisywany na podstawie sekwencji przy jednym lub obu końcach.

Jeden i dwa końce dają inną pewność

Wymaganie zgodnego barcode po obu stronach:

• zmniejsza część błędnych przypisań;
• wymaga pełniejszego readu;
• odrzuca cząsteczki bez drugiego końca;
• zmniejsza yield po demultipleksowaniu.

W projekcie low-frequency wariant priorytetem może być swoistość. W szybkim screeningu drobnoustroju — liczba reads.

Barcode bleeding

Błędne przypisanie może wynikać z:

• wolnego adaptera;
• chimery;
• niepełnej sekwencji;
• basecall error w kodzie;
• podobnych barcode;
• kontaminacji pipetą;
• ponownego użycia zestawu bez pełnego czyszczenia.

Sygnał rzadkiego patogenu w próbce obok bardzo dodatniej wymaga porównania macierzy barcode i kontroli.

Pooling po masie faworyzuje krótkie cząsteczki

Ta sama masa krótkiej biblioteki zawiera więcej molekuł. Ponadto krótsze cząsteczki szybciej zwalniają por i mogą dać więcej readów.

Równa masa nie gwarantuje równego yield per sample. Trzeba monitorować bases, reads i długość dla każdego barcode.

Nanopore może wzbogacać cel kilkoma drogami

Amplicon

Zalety:

• wysoki udział celu;
• małe wejście;
• szybki wynik;
• wiele barcode.

Ograniczenia:

• allele dropout;
• PCR bias;
• chimery;
• utrata natywnej metylacji;
• długość wyznaczona przez amplifikację;
• problem z bardzo dużym targetem.

Capture

Sondy mogą wybierać dłuższe fragmenty. Wydajność zależy od hybrydyzacji, GC, paralogów i jakości końców.

Wzbogacanie poza instrumentem zużywa materiał, lecz nie zajmuje czasu pora na odrzucone molekuły.

Cas-mediated enrichment

Cięcie w wybranych miejscach może kierować adaptery do końców targetu i zachować natywne DNA. Projekt wymaga:

• unikalnych miejsc;
• kontroli off-target;
• właściwej orientacji;
• wydajnego dephosphorylation lub blokowania tła;
• dostatecznie długiego DNA.

Brak readów może oznaczać problem cięcia, nie brak locus.

Adaptive sampling

Nie wymaga sondy ani PCR i można zmieniać listę in silico. Wzbogacenie spada dla krótkich fragmentów i bardzo szerokiego celu.

Te metody można łączyć, ale każdy dodatkowy etap tworzy własny bias.

Przepustowość można rozpisać na czynniki

Przybliżenie:

yield ≈ aktywne pory × occupancy × szybkość [baz/s] × czas × sprawność.

Sprawność obejmuje przerwy, odrzucone reads i filtr jakości.

Długi read zajmuje por dłużej

Przy stałej szybkości 100 kb zużywa około dziesięć razy więcej czasu niż 10 kb. Dostarcza kontekst, ale zmniejsza liczbę niezależnych startów.

Dla rzadkiego VAF można preferować więcej molekuł. Dla powtórzenia potrzebne są długie spanning reads.

Yield teoretyczny i użyteczny

Od końcowych baz odejmuje się:

• niezmapowane;
• host w metagenomie;
• off-target;
• reads poniżej Q;
• duplikaty;
• chimery;
• brak barcode;
• simplex, jeśli wymagano duplex.

Plan powinien używać efektywnego yield.

Stan pora można diagnozować

Kanał może być:

• strand — produktywnie odczytuje;
• pore — otwarty;
• unavailable;
• multiple;
• saturated;
• zero current;
• adapter-only;
• recovery.

Nazwy zależą od software, ale idea pozostaje: czas kanału nie jest równy czasowi sekwencjonowania.

Blokada ma sygnaturę

Długie zatrzymanie prądu, nagły zero current albo niestabilny baseline może wskazywać:

• agregat;
• zanieczyszczenie;
• uszkodzenie błony;
• problem buforu;
• niewłaściwe napięcie.

Automatyczne odblokowanie próbuje odzyskać por, ale częste interwencje zmniejszają yield.

Reload

Jeśli pory pozostają aktywne, a occupancy spadła przez wyczerpanie biblioteki, można doładować. Przedtem trzeba ustalić:

• czy biblioteka jest stabilna;
• czy nie narasta osad;
• czy objętość mieści się w zakresie;
• czy potrzebne jest nuclease flush;
• czy batch reload będzie rozpoznawalny.

Reload zmienia oś czasu i powinien być metadanym zdarzeniem.

Wash i ponowne użycie wymagają kontroli carry-over

Płukanie może usunąć część biblioteki i udostępnić pory, ale nie gwarantuje zera cząsteczek poprzedniej próbki.

Ryzyko jest szczególnie ważne dla:

• pathogen detection;
• genetyki sądowej;
• low biomass;
• wariantów rzadkich;
• próbek o podobnych barcode.

Blank po wash

Krótki run blanku pozwala ocenić carry-over. Jego czułość zależy od liczby aktywnych porów i czasu.

Brak odczytu w krótkim blanku nie dowodzi absolutnej czystości.

Ponowne użycie a identyfikowalność

Trzeba zapisać:

• poprzedni materiał;
• procedurę wash;
• kolejność;
• pozostałe pory;
• barcode;
• blank;
• kryterium akceptacji.

Oszczędność flow cell może być niewarta utraty pewności.

Raw signal jest zasobem obliczeniowym

Przechowywanie pełnego sygnału umożliwia:

• re-basecalling;
• nowe modele modyfikacji;
• kontrolę anomalii;
• badanie czasu;
• audyt.

Kosztuje jednak znaczące storage i transfer.

POD5, BAM i raporty mają różne role

Niezależnie od zmieniających się formatów trzeba rozdzielać:

• raw current;
• basecalled sequence;
• alignments;
• modified-base tags;
• summary per read;
• run report;
• sample sheet.

FASTQ sam nie zachowuje pełnej informacji o sygnale ani modyfikacjach.

Re-basecalling zmienia wersję danych

Nowy model może zmienić:

• sekwencję;
• Q;
• długość;
• barcode;
• modified-base probability;
• liczbę reads przechodzących filtr.

Nowy FASTQ powinien mieć nowy identyfikator i lineage.

Compute może być wąskim gardłem

Jeśli basecaller nie nadąża, adaptive sampling i realtime tracą skuteczność. Wymagania zależą od:

• liczby porów;
• szybkości;
• modelu;
• GPU;
• batch size;
• równoległego mapowania;
• zapisu dysku.

Test wydajności trzeba wykonać przed krytycznym runem.

Bezpieczeństwo danych zaczyna się przy urządzeniu

Human reads są danymi identyfikowalnymi. Lokalne urządzenie i laptop terenowy muszą mieć:

• szyfrowanie;
• kontrolę kont;
• aktualizacje;
• kopię zapasową;
• bezpieczny transfer;
• log dostępu;
• politykę usuwania.

Realtime upload do chmury jest zewnętrznym transferem danych genomowych.

Modele i telemetria

Przed użyciem trzeba ustalić:

• skąd pobierany jest model;
• czy software wysyła telemetry;
• gdzie działa basecalling;
• czy dane opuszczają urządzenie;
• jak wersjonuje się aktualizacje.

W środowisku regulowanym automatyczna zmiana modelu może wymagać rewalidacji.

Nanopore w diagnostyce wymaga zakresu zwalidowanego

Możliwość technologiczna nie jest równoznaczna z testem diagnostycznym. Walidacja obejmuje:

• accuracy;
• precision;
• czułość;
• swoistość;
• LOD;
• reportable range;
• callable region;
• rodzaje próbki;
• interferences;
• wersje software;
• kontrolę zmian.

Każda klasa wariantu osobno

Test dobry dla SNV może być słabszy dla homopolimerów. Test SV może wykrywać breakpoint, ale nie niską mozaikę. Modified-base call ma osobną walidację.

Nie przenosi się jednej wartości accuracy na wszystko.

Potwierdzenie

Dla wyniku krytycznego dobiera się:

• Sanger;
• short-read;
• ddPCR;
• MLPA;
• PCR junction;
• optical mapping;
• trio;
• drugą tkankę;
• drugi model sygnału.

Metoda powinna zmieniać dominujące źródło błędu.

Troubleshooting po wzorze danych

Dużo krótkich reads

Sprawdź:

• ścinanie ekstrakcji;
• vortex;
• freeze–thaw;
• transpozazę;
• nuclease;
• pipetowanie;
• adapter-only;
• obecność cfDNA.

Mało aktywnych porów na starcie

Sprawdź:

• kontrolę flow cell przed użyciem;
• przechowywanie;
• temperaturę;
• transport;
• bubbles;
• czas od priming;
• numer partii.

Pory są aktywne, occupancy niska

Sprawdź:

• stężenie aktywnej biblioteki;
• ligację;
• motor;
• objętość;
• loading;
• czystość.

Occupancy wysoka, yield niskiej jakości

Sprawdź:

• agregaty;
• krótkie produkty;
• zły model;
• niekompatybilny kit;
• kontaminację;
• multiple pores;
• niestabilny prąd.

Wysoki yield, mało targetu

Sprawdź:

• projekt enrichment;
• referencję;
• adaptive sampling latency;
• listę BED;
• orientation;
• host contamination;
• długość molekuł.

Jak raportować eksperyment

Minimalnie:

• próbka i ekstrakcja;
• masa, długość i czystość;
• fragmentacja/size selection;
• kit i barcode;
• flow cell i pore;
• liczba aktywnych porów;
• loading i reload;
• czas;
• software;
• basecaller/model;
• simplex/duplex;
• filtry Q;
• yield, N50 i rozkład;
• mapping/coverage;
• modified-base model;
• adaptive sampling;
• kontrole;
• walidacja.

Wersja platformy jest częścią metody

Opis „zsekwencjonowano na MinION” jest zbyt ogólny. Ta sama nazwa urządzenia może pracować z innym:

• porem;
• kitem;
• szybkością;
• basecallerem;
• flow cell;
• konfiguracją.

Reprodukcja wymaga całego zestawu.

Ten zestaw działa w trzech różnych skalach organizacyjnych. Przenośny sekwenator nanoporowy obsługuje jedną MinION Flow Cell i korzysta z komputera gospodarza; system wielostanowiskowy uruchamia kilka niezależnych MinION Flow Cells dla różnych projektów; klasa wysokoprzepustowa używa większych PromethION Flow Cells dla dużych genomów i kohort. Mechanizm sygnału jest wspólny, lecz workflow, pojemność i ryzyko operacyjne nie są.

Materiał biologiczny narzuca granicę długości

Nanopor nie „produkuje” długiej cząsteczki. Może jedynie nie przerwać tej, którą udało się zachować podczas pobrania, przechowywania, lizy, oczyszczania i pipetowania. Dlatego pytanie o długość odczytów powinno zaczynać się od historii próbki, a nie od katalogu urządzenia.

Świeża krew, hodowla komórkowa, zamrożona tkanka, bloczek parafinowy, wymaz i preparat środowiskowy różnią się nie tylko ilością DNA. Różnią się:

• stopniem fragmentacji;
• zawartością inhibitorów;
• udziałem DNA gospodarza i mikroorganizmów;
• dostępnością jąder;
• utlenieniem oraz innymi uszkodzeniami zasad;
• możliwością zachowania natywnych modyfikacji;
• ryzykiem, że nieliczne długie cząsteczki nie reprezentują całej próbki.

DNA z materiału FFPE może być wystarczające do wielu analiz małych wariantów, lecz obietnica ultradługich reads jest zwykle sprzeczna z jego historią chemiczną. Z kolei bardzo lepki ekstrakt HMW może wyglądać imponująco, ale być trudny do równomiernego pobrania. Porcja pobrana z powierzchni probówki nie musi mieć tego samego rozkładu cząsteczek co porcja z dna.

Ocena ilości i jakości wymaga kilku pomiarów

Jeden odczyt absorbancji nie odpowiada na wszystkie pytania. Projekt długich reads zwykle potrzebuje osobno:

• pomiaru stężenia metodą fluorometryczną;
• oceny czystości lub obecności inhibitorów;
• pomiaru rozkładu długości, jeśli długość jest częścią tezy;
• próby zgodności z reakcją przygotowania biblioteki;
• informacji o całkowitej masie dostępnej dla ekstrakcji i replikacji.

Stosunek absorbancji może ostrzec o zanieczyszczeniu, ale nie powie, ile cząsteczek rzeczywiście nadaje się do ligacji i translokacji. Elektroforeza może pokazać rozmaz, lecz agresywne przygotowanie próbki do samego pomiaru może zaniżyć obserwowaną długość. Wynik kontroli wejścia jest więc częścią modelu dowodu, nie ceremonialnym załącznikiem.

Naprawa i amplifikacja zmieniają to, co wolno wnioskować

Niektóre workflow obejmują naprawę uszkodzeń DNA. Może ona zwiększyć odzysk biblioteki, lecz nie odtwarza całej informacji utraconej w zdegradowanej próbce. Whole-genome amplification zwiększa masę materiału, ale tworzy kopie o własnym rozkładzie i biasie. Co szczególnie ważne, przestaje się wtedy mierzyć natywną cząsteczkę wraz z jej naturalnym wzorem modyfikacji.

Raport powinien jednoznacznie rozróżniać:

• sekwencjonowanie natywnego DNA;
• DNA naprawione enzymatycznie;
• DNA amplifikowane;
• amplicony PCR;
• materiał wzbogacony bez PCR.

Te określenia nie są detalami laboratoryjnymi. Wyznaczają zakres biologicznych wniosków.

Pokrycie długimi reads ma strukturę

Średnie pokrycie 20× może powstać na wiele sposobów. Dwadzieścia krótkich odczytów, z których żaden nie obejmuje całego powtórzenia, nie daje tego samego dowodu co kilka cząsteczek spanning z unikalnymi kotwicami po obu stronach. Z drugiej strony dwie bardzo długie cząsteczki nie wystarczą do wiarygodnego oszacowania frakcji mozaiki na poziomie kilku procent.

Dla technologii nanopore trzeba rozdzielać co najmniej:

1. Pokrycie bazowe — ile razy obserwowano daną pozycję.
2. Pokrycie fizyczne — jak duży region łączą cząsteczki.
3. Pokrycie spanning — ile reads obejmuje cały badany element i wymagane kotwice.
4. Pokrycie cząsteczkowe — ile niezależnych molekuł wnosi dowód.
5. Pokrycie haplotypowe — ile dowodu przypada na każdy haplotyp.
6. Pokrycie po filtrach — ile zostaje po jakości, mapowaniu i usunięciu chimer.
7. Pokrycie informacyjne — ile reads rzeczywiście rozróżnia konkurencyjne hipotezy.

Ostatnia kategoria jest najważniejsza. Read pokrywający region, ale pozbawiony wariantu lub informacyjnych markerów fazy, zwiększa licznik pokrycia i jednocześnie może nie zmienić odpowiedzi.

Niezależna cząsteczka nie zawsze znaczy niezależny dowód

Duplikaty PCR są oczywistym problemem w bibliotekach amplikonowych. W bibliotece natywnej brak PCR nie gwarantuje jednak pełnej niezależności interpretacyjnej. Oba końce tego samego fragmentu, odczyty konsensusowe wyprowadzone z tych samych molekuł albo kilka wtórnych alignments jednego readu nie mogą być liczone jak osobne zdarzenia biologiczne.

Przy analizie mozaiki lub rzadkiego wariantu trzeba określić jednostkę zliczania. Może nią być read, molekuła, rodzina konsensusowa albo próbka. Bez tej deklaracji frakcja wariantowa wygląda precyzyjniej, niż jest w rzeczywistości.

Pokrycie obu haplotypów może być asymetryczne

Bias ekstrakcji, długości allelu, mapowania i selekcji może sprawić, że jeden haplotyp jest obserwowany częściej. Dłuższa ekspansja powtórzenia może pękać lub translokować się gorzej. Allel bardziej podobny do referencji może mapować się łatwiej. Dlatego brak reads alternatywnego haplotypu nie jest automatycznie dowodem jego braku.

W praktyce należy sprawdzić markery heterozygotyczne wokół celu. Jeśli wszystkie długie reads przypisują się tylko do jednego haplotypu, problem może dotyczyć zarówno biologii, jak i niewidoczności drugiego allelu.

Fazowanie jest osobnym zadaniem analitycznym

Długi read może fizycznie połączyć dwa warianty, ale dopiero analiza określa, czy połączenie jest wiarygodne. Fazowanie read-backed wymaga informacyjnych markerów, poprawnego mapowania i odrzucenia chimer. Statystyczne fazowanie populacyjne odpowiada na inne pytanie: wybiera prawdopodobny układ na podstawie częstości haplotypów, nawet gdy jedna cząsteczka nie łączy loci.

Wynik należy opisywać precyzyjnie:

• phased directly — warianty obserwowano na tej samej cząsteczce lub spójnym zbiorze cząsteczek;
• phased by pedigree — fazę wyprowadzono z transmisji rodzinnej;
• statistically phased — fazę estymowano z panelu populacyjnego;
• unphased — dane nie rozstrzygają konfiguracji.

Mieszanie tych kategorii prowadzi do nadinterpretacji, szczególnie w diagnostyce wariantów złożonych i analizie cis/trans.

Faza wariantu i modyfikacji wymaga wspólnej osi

Jedną z mocnych stron natywnego sekwencjonowania jest możliwość przypisania wariantu i sygnału modyfikacji do tej samej cząsteczki. Aby jednak mówić o allele-specific methylation, trzeba:

1. wskazać informacyjny wariant lub haplotyp;
2. przypisać read do haplotypu z określoną pewnością;
3. sklasyfikować modyfikację w tych samych reads;
4. wykluczyć różnicę pokrycia i mapowalności;
5. oszacować niepewność przy liczbie niezależnych cząsteczek;
6. w razie pytania o pochodzenie rodzicielskie dodać dane rodzinne albo inny dowód.

Sam kolor na wykresie przeglądarki genomowej nie realizuje tych kroków.

Projekt należy liczyć od decyzji końcowej

Zakup flow cell i wybór zestawu bibliotecznego są konsekwencją, nie początkiem projektu. Najpierw trzeba sformułować decyzję końcową: czy chodzi o wykrycie SV, zamknięcie genomu, fazowanie wariantu, pomiar modyfikacji, identyfikację patogenu czy szybkie wykluczenie określonej klasy hipotez.

Dopiero potem można wyprowadzić:

• minimalną długość informacyjnego readu;
• minimalną liczbę niezależnych molekuł;
• wymaganą czułość oraz granicę detekcji;
• dopuszczalny czas do pierwszej i końcowej odpowiedzi;
• poziom multipleksowania;
• kontrolę pozytywną, negatywną i procesową;
• zasady zatrzymania runu;
• metodę potwierdzenia wyniku granicznego.

Przy szacowaniu skali projektu warto liczyć od ilości danych po filtrach, a nie od nominalnego maksimum platformy. Jeśli tylko połowa baz trafia do odpowiedniej próbki, przechodzi próg jakości i mapuje się informacyjnie, efektywna przepustowość dla tezy wynosi połowę całkowitego yield — jeszcze przed uwzględnieniem nierównomierności genomowej.

Jak zaprojektować run nanopore

1. Zdefiniuj endpoint: assembly, SV, faza, RNA, modyfikacja czy realtime.
2. Określ minimalną długość obejmującą niejednoznaczność.
3. Zmierz ilość i rozkład HMW.
4. Wybierz ligation, rapid, PCR, cDNA lub direct RNA.
5. Zdecyduj o size selection.
6. Dobierz flow cell i czas.
7. Wybierz simplex/duplex i model basecallingu.
8. Zaplanuj compute oraz storage raw signal.
9. Ustal adaptive sampling, jeśli daje realny zysk.
10. Dodaj kontrolę sekwencji i modyfikacji.
11. Zdefiniuj minimalne pokrycie molekularne.
12. Zaplanuj walidację.

Kryterium stop

Może dotyczyć:

• liczby baz;
• pokrycia targetu;
• liczby reads spanning;
• kompletności assembly;
• liczby duplex;
• pewności taksonu;
• czasu.

Stop nie powinien wynikać wyłącznie z końca nominalnego czasu runu.

Studium 1: ekspansja powtórzenia

Wymagany dowód:

• unikalny lewy brzeg;
• całe repeat;
• unikalny prawy brzeg;
• kilka niezależnych reads;
• zgodność długości;
• faza z sąsiednim wariantem.

Read kończący się w repeat daje lower bound. Mapping do referencji z krótkim allelem może miękko przyciąć nadmiar.

Ortogonalny test długości może potwierdzić rozmiar, ale nie zawsze motyw i przerwania.

Studium 2: mozaika strukturalna

Jeśli SV występuje w 5% komórek, potrzeba:

• wielu niezależnych molekuł;
• kontroli chimer;
• dwukierunkowych breakpointów;
• właściwej tkanki;
• dokładnego mianownika;
• drugiej biblioteki.

Jedna ultradługa chimera nie jest dowodem. Długość i rzadkość to osobne osie.

Studium 3: imprinting

Projekt łączy:

• heterozygotyczne SNV do fazy;
• natywne CpG;
• długie reads;
• rodziców lub inny dowód pochodzenia;
• kontrolę modyfikacji.

Wynik „haplotyp A jest methylated” nie mówi jeszcze, czy to allel matczyny.

Najczęstsze błędy

1. „Por czyta jedną zasadę.” Sygnał zależy od k-meru.
2. „Długość jest właściwością urządzenia.” Zaczyna się w próbce.
3. „N50 mówi, czy target jest spanning.” Potrzebny jest rozkład i kotwice.
4. „Więcej porów gwarantuje yield.” Liczy się occupancy i biblioteka.
5. „Realtime oznacza gotową odpowiedź.” Interpretacja ma własny czas.
6. „Direct RNA obejmuje wszystkie RNA.” Biblioteka nadal selekcjonuje.
7. „Modyfikacja jest dodatkową literą.” Jest klasyfikacją zmiany sygnału.
8. „Duplex to dwa niezależne genomy.” To dwie nici jednej cząsteczki.
9. „Adaptive sampling to capture.” Decyzja następuje po wejściu do pora.
10. „Ultralong read potwierdza SV sam.” Chimery wymagają replikacji.
11. „WGA poprawia wszystko.” Usuwa natywną modyfikację.
12. „Przenośny instrument nie potrzebuje infrastruktury.” Workflow nadal jej wymaga.

Co warto umieć po przeczytaniu

Czytelnik powinien potrafić:

• opisać obwód jonowy, por, motor i k-mer;
• wyjaśnić zależność sygnału od kontekstu i modyfikacji;
• odróżnić flow cell, kanał, por i read;
• zaplanować HMW extraction;
• porównać ligation i rapid;
• rozdzielić simplex, duplex i consensus;
• wersjonować chemię oraz basecaller;
• interpretować N50, yield, occupancy i Q razem;
• ocenić direct RNA i modified-base calling;
• wyjaśnić Read Until;
• zaplanować assembly, SV i fazę;
• dobrać kontrole;
• ustalić kryterium stop i walidację.

Literatura i źródła