Dolly: co naprawdę było przełomem

Streszczenie

Dolly nie była pierwszym zwierzęciem ani nawet pierwszą owcą uzyskaną przez transfer jądra. Była pierwszym ssakiem urodzonym po przeniesieniu jądra komórki wyprowadzonej z dorosłej tkanki somatycznej. To sformułowanie jest celowo ostrożniejsze niż popularne „z terminalnie zróżnicowanej komórki gruczołu mlekowego”: źródło dorosłej tkanki wykazano, lecz dokładny typ i stopień zróżnicowania pojedynczej skutecznej komórki nie zostały wtedy oznaczone.

Przełom miał trzy warstwy. Biologicznie pokazał, że genom komórki dorosłego ssaka może zostać przeprogramowany przez oocyt na tyle, aby kierował rozwojem, ciążą, urodzeniem i płodnym życiem zwierzęcia. Technicznie połączył hodowlę komórek dawcy z kontrolą cyklu, enukleacją, elektrofuzją i transferem zarodków. Użytkowo otworzył drogę do modyfikowania komórek przed transferem jądra, a następnie wytwarzania zwierząt produkujących białka lecznicze.

Dolly nie była pierwszym klonem

Słowo „pierwsza” wymaga podania kategorii. Przed Dolly znano:

• naturalne bliźnięta monozygotyczne i sztuczne dzielenie zarodków;
• transfer jąder komórek zarodkowych u płazów;
• transfer jąder ze zróżnicowanych tkanek płazów;
• ssaki uzyskane z blastomerów wczesnego zarodka;
• owce uzyskane z hodowanych komórek wyprowadzonych z zarodka.

Transfer jądra jako metoda ma korzenie w latach 50. XX wieku. W 1952 roku Robert Briggs i Thomas King przenieśli jądra z komórek blastuli żaby do pozbawionych jądra jaj i uzyskali rozwijające się zarodki.⁴ John Gurdon pokazał następnie, że jądra pobrane ze zróżnicowanego nabłonka jelitowego kijanki potrafią wesprzeć rozwój wielu tkanek — o czym więcej w artykule Gurdon i transfer jądra.

U ssaków zasadniczą trudnością było połączenie przeprogramowania z rozwojem przedimplantacyjnym, transferem do nosicielki i łożyskiem. W 1986 roku Steen Willadsen uzyskał owce po przeniesieniu jąder z blastomerów wczesnych zarodków.⁵ Jądro blastomeru ma już za sobą kilka podziałów, ale pozostaje blisko naturalnego początku rozwoju. Wynik nie rozstrzygał jeszcze, czy jądro dorosłej tkanki ssaka można cofnąć funkcjonalnie o całą drogę.

Megan i Morag: brakujące ogniwo

Rok przed narodzinami Dolly zespół Roslin opisał Megan i Morag — owce powstałe z hodowanej linii komórek wyprowadzonej z zarodka.⁶ To było ważniejsze niż kolejny transfer blastomeru. Komórki można było przez pewien czas utrzymywać poza organizmem, namnażać i poddawać selekcji. Hodowla zmieniała jednak ich cykl, stan chromatyny i skład populacji.

Eksperyment ustanowił pomost:

blastomer pobrany bezpośrednio z zarodka
→ komórki zarodkowe utrzymywane w hodowli
→ komórki płodowe w hodowli
→ komórki z dorosłej tkanki w hodowli

Dolly była ostatnią strzałką, nie skokiem wykonanym bez zaplecza. Jej narodziny korzystały z procedury zbudowanej i przetestowanej wcześniej na materiale zarodkowym.

Granica, której nikt nie przekroczył przed Dolly, brzmiała: czy jądro w pełni wyspecjalizowanej komórki dorosłego ssaka wciąż zawiera kompletny, dający się uruchomić program rozwojowy? Wielu badaczy zakładało, że różnicowanie jest jednokierunkowe i nieodwracalne. Dolly obaliła to założenie.

Ostatnie zdanie trzeba doprecyzować. Dolly obaliła mocną tezę, że wiek dorosły dawcy albo pochodzenie z dorosłej tkanki somatycznej czyni pełny rozwój biologicznie niemożliwym. Nie rozstrzygnęła sama, czy jej skutecznym dawcą była dojrzała komórka wydzielnicza, komórka mioepitelialna, progenitor czy rzadka komórka macierzysta obecna w kulturze.⁸ Późniejsze doświadczenia z komórkami o trwałych znacznikach różnicowania, na przykład przeorganizowanymi loci limfocytów, dały ostrzejszy dowód terminalnego pochodzenia.

Trzy różne pytania ukryte w jednym eksperymencie

Praca z 1997 roku odpowiadała jednocześnie na trzy pytania:

1. Równoważność genomu: czy jądro z dorosłej tkanki zachowuje informację potrzebną do całego rozwoju?
2. Zgodność cyklu: czy można tak połączyć donor i oocyt, aby uniknąć dodatkowej albo brakującej replikacji DNA?
3. Platforma inżynierska: czy hodowane komórki można będzie najpierw zmienić i wybrać, a dopiero potem użyć do uzyskania zwierzęcia?

Pierwsze pytanie uczyniło Dolly ikoną biologii. Drugie tłumaczy, dlaczego kluczowy był wkład Keitha Campbella. Trzecie wyjaśnia zainteresowanie PPL Therapeutics i późniejsze narodziny transgenicznej Polly.

Co badacze chcieli sprawdzić

W latach 80. i 90. transfer jąder komórkowych dawał już potomstwo u ssaków, ale jądra pochodziły głównie z komórek zarodkowych. Nie było jasne, czy jądro komórki pobranej od dorosłego zwierzęcia nadal zawiera pełną informację rozwojową i czy cytoplazma oocytu potrafi skutecznie zmienić jego program.

Zespół z Roslin Institute, kierowany przez Iana Wilmuta i korzystający z kluczowej wiedzy Keitha Campbella o cyklu komórkowym, pracował równolegle z trzema populacjami: wyprowadzoną z zarodka, z płodu oraz z gruczołu mlekowego dorosłej owcy.¹ Taki układ był ważniejszy niż proste „spróbowano komórki dorosłej”. Pozwalał porównać kolejne odległości rozwojowe od zygoty w tej samej ogólnej procedurze.

Skąd pochodziła kultura dawcy

Kulturę założono z gruczołu mlekowego sześcioletniej owcy Finn Dorset w ostatnim trymestrze ciąży. Powstała pierwotnie do badań ekspresji białek mleka.²¹ Fakt ten pozwala sformułować dwa twierdzenia o różnej sile:

• dobrze wykazane: linia pochodziła z dorosłej tkanki somatycznej;
• niewykazane dla skutecznej pojedynczej komórki: dokładny typ, stan i terminalny stopień zróżnicowania dawcy.

Kultura z tkanki jest populacją. Mogła zawierać komórki nabłonkowe o różnym stanie, komórki mioepitelialne, stromalne albo progenitorowe. Sama nazwa narządu nie jest markerem komórki. To nie zmniejsza przełomu „dorosła tkanka → żywy ssak”, ale ogranicza przełom „konkretna terminalnie zróżnicowana komórka → żywy ssak”.

Dlaczego cykl komórkowy był problemem

Oocyt biorcy zatrzymany w metafazie II ma wysoką aktywność MPF. Po wprowadzeniu jądra może doprowadzić do rozpadu jego otoczki i kondensacji chromosomów. Następnie aktywacja uruchamia przejście do interfazowego programu i replikację.

Jeżeli jądro dawcy ma zawartość DNA typową dla G1 lub G0, pojedyncza następna replikacja może prowadzić do prawidłowego układu. Jeżeli dawca był już po replikacji w G2, nieodpowiednia sekwencja zdarzeń może zwiększyć ryzyko ponownego skopiowania DNA albo nieprawidłowej segregacji. Problem nie sprowadza się do „uśpienia genów”; chodzi o zgodność historii DNA z zegarem cytoplazmy.

Komórki dawcy hodowano przy obniżonym stężeniu surowicy, aby wzbogacić populację w komórki nieproliferujące, opisywane jako G0.¹⁹ Serum dostarcza mieszaninę czynników wzrostowych. Jego ograniczenie zmniejsza sygnały proliferacyjne, ale nie tworzy idealnie jednorodnego stanu. G0 i wczesne G1 mają tę samą ilość DNA, a granica między nimi zależy od użytych markerów.

Idea Campbella obejmowała więc dwa założenia:

1. diploidalne, niezreplikowane jądro będzie zgodniejsze z biorcą MII;
2. ograniczona aktywność transkrypcyjna i zmieniona chromatyna komórki spoczynkowej mogą ułatwić przeprogramowanie.

Pierwsze jest problemem bilansu cyklu. Drugie było hipotezą o dostępności jądra. Później wykazano, że żywe klony można uzyskiwać także z komórek proliferujących, jeśli właściwie dopasuje się fazę dawcy i biorcy. G0 okazało się skuteczną strategią, a nie jedyną biologicznie dopuszczalną fazą.⁹

Trzy owce, trzy rodzaje wkładu

W uproszczonym opisie mówi się o „trzech matkach” Dolly:

Rola	Rasa	Wkład
dawczyni tkanki	Finn Dorset	zasadnicza część genomu jądrowego
dawczyni oocytu	Scottish Blackface	cytoplazma, mitochondria i czynniki matczyne
nosicielka	Scottish Blackface	macica, łożyskowe otoczenie matczyne, fizjologia ciąży

Rasy o odmiennym fenotypie pomagały wizualnie, ale biała głowa nie była dowodem wystarczającym. O pochodzeniu trzeba wnioskować z markerów DNA. Dawczyni oocytu pozostawia dodatkowo mitochondrialny genom, więc Dolly nie była kopią całego DNA owcy Finn Dorset.¹⁴

Rekonstrukcja etap po etapie — jako logika, nie instrukcja

Z niezapłodnionego oocytu Scottish Blackface usuwano materiał chromosomowy. Całą komórkę dawcy umieszczano przy oocycie, a impuls elektryczny wywoływał fuzję błon. Oznacza to, że nazwa „transfer jądra” opisuje wynik biologiczny, choć fizycznie w tej wersji przenoszono komórkę i pozwalano jej jądru wejść do cytoplazmy.

Aktywacja zastępowała sygnał, który normalnie wiąże się z zapłodnieniem. Nie dostarczała plemnika ani genomu ojcowskiego. Miała przestawić metabolizm, wapń i cykl oocytu z zatrzymania mejotycznego na program podziałów.

Wczesne zarodki owcy nie były po prostu przez tydzień trzymane na płytce. W procedurze Roslin korzystano z tymczasowych biorczyń jako środowiska rozwoju przed odzyskaniem i oceną morul lub blastocyst.²² Dopiero wybrane zarodki przenoszono do ostatecznych nosicielek. Pełna sekwencja obejmowała zatem:

hodowla dawcy
→ enukleacja oocytu
→ elektrofuzja
→ aktywacja
→ wczesny rozwój w biorczyni tymczasowej
→ odzyskanie i ocena
→ transfer do nosicielki
→ implantacja
→ ciąża
→ urodzenie

Każdy etap miał osobny mianownik i mógł selekcjonować inne właściwości zarodka.

Jeden wynik po wielu niepowodzeniach

W serii z dorosłą linią gruczołu mlekowego uzyskano 277 zrekonstruowanych oocytów. Po rozwoju i selekcji 29 morul lub blastocyst przeniesiono do 13 ostatecznych nosicielek. Rozpoznano jedną ciążę, która zakończyła się urodzeniem Dolly.¹⁶

Etap	Liczba	Odsetek względem poprzedniego widocznego etapu
rekonstrukcje z dorosłą linią dawcy	277	punkt startowy
morule lub blastocysty wybrane do transferu	29	około 10,5% rekonstrukcji
ostateczne nosicielki	13	kilka zarodków mogło trafić do jednej samicy
rozpoznane ciąże prowadzące do porodu	1	około 7,7% nosicielek
żywe jagnięta	1	około 3,4% przeniesionych zarodków; około 0,36% rekonstrukcji

Procent „skuteczności Dolly” nie ma jednej wartości. 1/277 mierzy cały lejek od rekonstrukcji. 1/29 zaczyna dopiero od zarodków, które przeszły wcześniejszą selekcję. 1/13 dotyczy samic, nie zarodków. Użycie najmniejszego mianownika może wyglądać korzystniej, ale pomija materiał utracony wcześniej.

W publikacji były także serie z komórkami wyprowadzonymi z zarodka i płodu. Dorosła linia dawała morule lub blastocysty rzadziej niż te wcześniejsze rozwojowo populacje.²³ Porównanie wspierało ideę, że odległość od stanu zarodkowego i historia hodowli wpływają na podatność jądra. Nie identyfikowało jednak jednego mechanizmu odpowiedzialnego za różnicę.

Dlaczego „jedno jagnię” wystarczało do przełomu

Twierdzenie „jądro z dorosłej tkanki ssaka nigdy nie może kierować pełnym rozwojem” jest twierdzeniem absolutnym. Jeden prawidłowo udokumentowany wyjątek je obala. Dlatego niska wydajność nie usuwa znaczenia biologicznego.

Inaczej jest z twierdzeniem technologicznym: „procedura jest wydajna, powtarzalna i bezpieczna”. Tu jedno zwierzę nie wystarcza. Potrzebne byłyby duże, niezależne serie obejmujące:

• różne linie i osobniki dawcy;
• pełne mianowniki od oocytu do zdrowego dorosłego potomstwa;
• ciąże przerwane i zgony okołoporodowe;
• dopasowane kontrole uzyskane rozrodem płciowym;
• płodność i obserwację długoterminową;
• wyniki potomstwa następnego pokolenia.

Ten sam eksperyment był zatem mocnym proof of principle i bardzo słabym oszacowaniem rutynowego bezpieczeństwa.

Skąd wiadomo, że Dolly była Dolly

Dolly urodziła się 5 lipca 1996 roku, a publikację ogłoszono w lutym 1997 roku. Biała twarz odpowiadała rasie Finn Dorset dawczyni tkanki, a nie czarnogłowym Scottish Blackface związanym z oocytem i ciążą. Fenotyp był wskazówką, ale nie dowodem.

Najważniejsze alternatywne wyjaśnienia brzmiały:

1. w hodowli pomylono linie i użyto komórek zarodkowych lub płodowych;
2. ponieważ owca dawczyni była ciężarna, w tkance albo kulturze znalazła się komórka płodu;
3. materiał jądrowy oocytu nie został skutecznie usunięty;
4. Dolly była zwykłym potomkiem powstałym przez niezauważone zapłodnienie.

Pierwotna praca przedstawiła typowanie markerów, lecz pojawiły się pytania, czy liczba markerów wystarcza. W 1998 roku dwie niezależne analizy pogłębiły dowód: badanie mikrosatelitów oraz wielolokusowy DNA fingerprint.^10,11 Profile Dolly zgadzały się z dorosłą tkanką i wyprowadzoną z niej kulturą, a nie z przypadkowymi Finn Dorset.

Co genotypowanie potwierdziło, a czego nie

Genotypowanie potwierdziło pochodzenie genomu jądrowego od właściwej dorosłej linii. Wykluczało prostą zamianę z inną linią oraz przypadkowe pochodzenie od nosicielki.

Nie oznaczało sekwencjonowania całego genomu pojedynczej komórki dawcy. Nie można było sprawdzić każdej nowej mutacji powstałej podczas hodowli i rozwoju. Analiza nie identyfikowała też typu komórki w obrębie gruczołu. Odpowiadała na pytanie genealogiczne, nie na wszystkie pytania o stan.

To modelowy przykład warstw dowodu:

wygląd rasy
< kilka markerów
< rozszerzone mikrosatelity
< wielolokusowy fingerprint
< współczesne sekwencjonowanie genomowe

Każdy szczebel zmniejsza zakres możliwych pomyłek, ale powinien być dopasowany do konkretnego zarzutu.

Genom jądrowy i mitochondrialny mają różnych dawców

Późniejsza analiza mitochondrialnego DNA wykazała, że Dolly i inne sklonowane owce miały genom jądrowy odpowiadający komórkom somatycznym, a mtDNA pochodzące od oocytu.²⁵ Fuzja całej komórki dawcy może wnieść niewielką liczbę jej mitochondriów, lecz w powstałym zwierzęciu dominuje zwykle populacja biorcy.

Dlatego „genetycznie identyczna z dawczynią” jest skrótem dotyczącym przede wszystkim genomu jądrowego. Pełne zdanie powinno wskazywać:

• zgodność jądrowego DNA z linią dorosłej dawczyni;
• mitochondrialne pochodzenie od dawczyni oocytu;
• nowe mutacje i mozaicyzm powstające po rekonstrukcji;
• odmienny epigenom i środowisko prenatalne.

Na czym polegał przełom

Komórki dorosłej tkanki korzystają tylko z części genów i utrzymują charakterystyczny stan chromatyny. Powstanie Dolly oznaczało, że przynajmniej jedno jądro z dorosłej kultury zachowało informację, którą oocyt potrafił wykorzystać do przeprowadzenia całego rozwoju ssaka.

Nie wynika z tego, że genom jest jedynym potrzebnym składnikiem. Przeciwnie: eksperyment ujawnił niezwykłą aktywność cytoplazmy oocytu. To znajdujące się w niej RNA, białka i układy przebudowy chromatyny przeprowadziły jądro z programu komórki dorosłej do programu wczesnego zarodka.

Przeprogramowanie nie jest cofnięciem zegara jednym ruchem

Po fuzji jądro dawcy trafiało do cytoplazmy MII, która mogła rozbić jego otoczkę, skondensować chromatynę i wymienić część związanych z nią białek. Po aktywacji jądro musiało wejść w rytm kolejnych podziałów. Później, podczas aktywacji genomu zarodkowego, powinno uruchomić program właściwy dla zarodka, nie dla hodowli gruczołu mlekowego.

Reset miał kilka osi:

• cyklową — dopasowanie replikacji i podziału;
• transkrypcyjną — wyciszenie programu dawcy i aktywację genów zarodka;
• chromatynową — zmianę histonów, dostępności i organizacji jądra;
• metylacyjną — przebudowę znaków DNA bez niszczenia prawidłowego imprintingu;
• przestrzenną — odzyskanie zdolności reagowania na położenie w zarodku;
• pozazarodkową — prawidłowe utworzenie trofoblastu i łożyska.

Dolly pokazuje, że układ przeszedł wszystkie te bramki w jednym przypadku. 276/277 rekonstrukcji bez żywego jagnięcia pokazuje zarazem, że oocyt nie wykonuje resetu automatycznie.

Wiek dawcy, wiek jądra i wiek organizmu

Sześcioletnia owca dawczyni nie przekazała Dolly sześciu lat życia. Przekazała jądro z historią podziałów, mutacjami somatycznymi i epigenomem dorosłej tkanki. Rozwój organizmu zaczął się od nowej embriogenezy, lecz nie każdy molekularny ślad musiał zostać wyzerowany.

Trzeba rozdzielić:

„Wiek”	Co może go reprezentować
chronologiczny dawcy	czas od urodzenia owcy
replikacyjny komórki	liczba podziałów i stan telomerów
epigenetyczny	wzory metylacji i chromatyny związane z wiekiem oraz typem komórki
rozwojowy klonu	etap nowo powstałego zarodka i organizmu

SCNT może odmłodzić część cech, pozostawić inne, a jeszcze inne zaburzyć. Jedna liczba „wiek biologiczny” nie opisuje tego procesu.

Przełom eksperymentalny i platformowy

Samo pobranie jądra bez hodowli pozwala odtworzyć genom dawcy, ale trudno je precyzyjnie zmienić i sprawdzić przed rozpoczęciem ciąży. Hodowana linia daje czas na:

1. wprowadzenie konstruktu albo edycji;
2. selekcję komórek niosących zmianę;
3. analizę miejsca integracji i liczby kopii;
4. zamrożenie scharakteryzowanego materiału;
5. wykorzystanie tego samego genotypu w wielu rekonstrukcjach.

W latach 90. brak stabilnych, germline-competent embrionalnych komórek macierzystych zwierząt gospodarskich ograniczał precyzyjną transgenezę znaną z myszy. Transfer jądra z hodowanych komórek miał obejść tę barierę. To właśnie ta funkcja, a nie rynek kopii zwierząt, napędzała program.

Czego eksperyment nie dowiódł

Dolly nie była genetyczną kopią w każdym znaczeniu. Jej genom jądrowy pochodził od dawczyni komórki, ale mitochondria głównie od dawczyni oocytu. Rozwijała się w innej macicy i żyła w innym środowisku. Nie miała też wspomnień ani zachowania „oryginału” — klonowanie kopiuje genotyp, nie biografię.

Nie można również wnioskować z jednego narodzonego zwierzęcia, że SCNT jest bezpieczne. U klonów i ciąż po SCNT obserwowano zaburzenia łożyska, utraty ciąż i nieprawidłowości okołoporodowe. Dolly rozwinęła zapalenie stawów i chorobę płuc; jej przypadek nie rozstrzygnął jednak samodzielnie, czy klony starzeją się szybciej. Długość telomerów i starzenie zależą od gatunku, tkanki, komórki dawcy oraz przebiegu przeprogramowania.³

Eksperyment nie dowiódł także:

• że każda komórka dorosłego zwierzęcia jest równie podatna;
• że skutecznym dawcą była terminalnie zróżnicowana komórka wydzielnicza;
• że surowicze głodzenie jest konieczne dla wszystkich gatunków i typów dawcy;
• że wszystkie błędy epigenetyczne zostały usunięte;
• że jedno zdrowo wyglądające jagnię reprezentuje niewidoczne ciąże zakończone wcześniej;
• że potomstwo po SCNT jest bezpieczne bez długiego monitorowania;
• że metoda może zostać przeniesiona na człowieka;
• że wspólny genom odtworzy osobowość, zachowanie albo osiągnięcia dawcy.

Selekcja ocalałego wyniku

Dolly była obserwowana, ponieważ przeżyła. Nie można jej stanu użyć jako reprezentacji wszystkich rekonstrukcji, które zatrzymały się przed rozpoznaniem ciąży. To przykład survivorship bias: najbardziej widoczny jest rzadki ocalały wynik, a biologiczne koszty pozostają rozproszone w niewidocznych mianownikach.

Pełny bilans dobrostanu obejmuje nie tylko urodzonego klona, ale także:

• dawczynie oocytów i zabiegi ich pozyskania;
• biorczynie tymczasowe;
• ostateczne nosicielki;
• utracone ciąże i nieprawidłowe płody;
• porody wymagające interwencji;
• noworodki, które nie przeżyły;
• długoterminowe zdrowie ocalałych.

Ocena technologii wyłącznie przez fotografię jednego zwierzęcia pomija większość jednostek obciążonych procedurą.

Jedno zwierzę nie ma prawidłowej grupy kontrolnej

Dolly różniła się od zwykłych owiec nie tylko sposobem powstania. Miała konkretny genotyp, mtDNA innej rasy, określoną nosicielkę i była odchowywana ręcznie na preparacie mlekozastępczym.²⁴ Każda z tych cech może wpływać na wzrost, metabolizm lub zdrowie.

Idealne porównanie wymagałoby wielu klonów tej samej linii, osobników poczętych płciowo o zbliżonym tle, podobnego chowu oraz ślepej oceny. Dopiero późniejsze grupy sklonowanych owiec pozwoliły częściowo oddzielić cechy Dolly od ogólnej konsekwencji SCNT.

Prawdziwy cel: leki w mleku, nie kopiowanie zwierząt

W popularnym odbiorze Dolly to „zabawa w kopiowanie życia”. Motywacja zespołu była jednak praktyczna i komercyjna. Roslin Institute współpracował z firmą PPL Therapeutics nad pharmingiem — wytwarzaniem białek leczniczych w mleku zwierząt gospodarskich. Klonowanie z hodowanych komórek miało umożliwić wcześniejsze wprowadzenie do tych komórek modyfikacji genetycznej, a potem powielenie sprawdzonego, zmodyfikowanego zwierzęcia.

Dlatego prawdziwym „produktem docelowym” była nie Dolly, lecz urodzona rok później Polly: owca uzyskana przez transfer jądra z komórek niosących ludzki gen czynnika krzepnięcia IX, potrzebnego chorym na hemofilię.⁷ Dolly udowodniła biologiczną możliwość; Polly pokazała, po co ta możliwość miała służyć. Ta kolejność jest pouczająca — przełomowa nauka często rodzi się przy okazji bardzo konkretnego, użytkowego celu.

Dlaczego wcześniejsza transgeneza była mniej przewidywalna

Wprowadzenie DNA bezpośrednio do wczesnego zarodka mogło dawać:

• integrację w nieprzewidywalnym miejscu;
• różną liczbę kopii;
• mozaicyzm, gdy zmiana nie zaszła przed pierwszym podziałem;
• brak ekspresji albo ekspresję w niewłaściwej tkance;
• konieczność urodzenia zwierzęcia, zanim dokładnie pozna się integrację.

Praca na komórkach odwraca kolejność. Najpierw można scharakteryzować zmianę, potem wybrać właściwy klon komórkowy, a na końcu użyć go jako dawcy jądra. Powstałe zwierzę powinno wywodzić wszystkie tkanki z wybranego genomu jądrowego.

Polly jako test następnego etapu

Polly powstała z płodowych fibroblastów niosących ludzki gen czynnika IX pod kontrolą sekwencji kierujących ekspresją do gruczołu mlekowego.²⁰ Była więc dowodem połączenia:

modyfikacja komórki
→ selekcja materiału dawcy
→ transfer jądra
→ rozwój zwierzęcia
→ tkankowo ukierunkowana ekspresja białka

Nie oznaczało to jeszcze gotowego leku. Białko z mleka trzeba oczyścić, scharakteryzować, sprawdzić jego modyfikacje potranslacyjne, aktywność, immunogenność, czystość oraz powtarzalność produkcji. „Zwierzę produkuje białko” jest początkiem procesu biofarmaceutycznego, nie jego końcem.

Życie i śmierć Dolly

Nazwa nie była przypadkowa: ponieważ komórki dawcy pochodziły z gruczołu mlekowego, zwierzę nazwano na cześć piosenkarki Dolly Parton. Dolly prowadziła w Roslin względnie normalne życie owcy i urodziła sześcioro jagniąt z naturalnego krycia, poczynając od Bonnie.²

Zmarła 14 lutego 2003 roku, w wieku zaledwie sześciu lat. Bezpośrednią przyczyną była choroba płuc — owczy gruczolakorak płuc (Jaagsiekte), wywoływany przez retrowirusa i częsty u owiec trzymanych w pomieszczeniach; nie ma dowodu, by wiązał się z klonowaniem. Wcześniej Dolly rozwinęła też zapalenie stawów. Jej spreparowane zwłoki są dziś eksponatem w National Museum of Scotland w Edynburgu. Warto dodać, że sklonowane „siostry” Dolly z tej samej linii komórkowej dożyły w dobrym zdrowiu wieku typowego dla owiec, co osłabiło wczesne obawy o przyspieszone starzenie klonów.¹⁷

Telomery: ważny pomiar, zbyt szybka opowieść

W 1999 roku opisano u Dolly krótsze terminalne fragmenty restrykcyjne telomerów niż u kontrolnych owiec w podobnym wieku. Wynik był zgodny z długością obserwowaną w dorosłej tkance dawczyni i z dodatkową erozją podczas hodowli.¹² Zrodziła się hipoteza, że klon „zaczyna” z replikacyjnym wiekiem komórki dawcy.

Sam pomiar miał ograniczenia:

• terminal restriction fragment obejmuje także zmienny fragment subtelomerowy, a nie wyłącznie powtórzenia telomerowe;
• długość zależy od tkanki i rozkładu komórek;
• związek telomerów z długością życia nie jest prostym zegarem;
• jeden osobnik nie pozwala oszacować zmienności między klonami;
• różne gatunki i protokoły SCNT dawały później skrócenie, zachowanie albo wydłużenie telomerów.

Krótszy telomer Dolly był prawdziwym wynikiem laboratoryjnym. Nie był dowodem, że zmarła ze starości ani że każdy klon dziedziczy chronologiczny wiek dawcy.

Zapalenie stawów po ponownym odczytaniu danych

Rozpoznanie choroby zwyrodnieniowej u stosunkowo młodej Dolly wywołało obawę o przedwczesne starzenie. Późniejsza analiza szkieletu Dolly oraz innych klonów nie znalazła nietypowego nasilenia ani rozkładu zmian w porównaniu z naturalnie poczętymi owcami.¹³ Co ważne, pierwotna dokumentacja kliniczna i radiogramy nie zostały zachowane w pełnym zakresie, więc retrospektywna ocena miała własne ograniczenia.

Ta historia pokazuje, jak dowód ewoluuje:

1. pojawia się obserwacja u pojedynczego ikonicznego zwierzęcia;
2. media łączą ją z atrakcyjną hipotezą „urodziła się stara”;
3. później bada się większe grupy i zachowany materiał;
4. wniosek staje się węższy: SCNT może wpływać na różne oznaki wieku, lecz Dolly sama nie dowodzi przyspieszonego starzenia.

Zdrowe starzenie późniejszych klonów nie usuwa ryzyka SCNT

Cztery owce uzyskane z tej samej dorosłej linii co Dolly oraz inne klony dożyły wieku 7–9 lat bez dominującego zespołu metabolicznego czy nadciśnienia, a większość badanych parametrów mieściła się w zakresie kontrolnym.¹⁸ To osłabiło teorię uniwersalnego przyspieszonego starzenia.

Nie wolno odwrócić błędu i uznać, że zdrowe ocalałe klony dowodzą bezpieczeństwa całego procesu. Do grup długowiecznych trafiają wyłącznie osobniki, które przeszły wcześniejszą selekcję zarodkową, ciążową i noworodkową. Zdrowie ocalałych oraz wysoki koszt niepowodzeń prenatalnych mogą być jednocześnie prawdziwe.

Dlaczego Dolly nadal jest ważna

Eksperyment połączył embriologię, biologię komórki i epigenetykę w jednym, łatwym do sformułowania pytaniu: czy dorosłe jądro można cofnąć funkcjonalnie do początku rozwoju? Odpowiedź brzmiała „tak, ale rzadko i niedoskonale”. Późniejsze badania SCNT koncentrowały się już nie tylko na uzyskaniu narodzin, lecz na barierach przeprogramowania i zdrowiu potomstwa.

Najdalej idący skutek był pojęciowy. Skoro oocyt potrafi przeprogramować dorosłe jądro, to „dorosłość” komórki nie jest stanem ostatecznym. Ta myśl otworzyła drogę do pytania, które dekadę później rozstrzygnął Shinya Yamanaka: czy da się osiągnąć podobne przeprogramowanie bez oocytu, samymi czynnikami transkrypcyjnymi. Tak narodziła się koncepcja iPSC — o czym w artykule Yamanaka i powstanie iPSC. Dolly wywołała też falę debat etycznych i regulacyjnych o klonowaniu człowieka, które do dziś kształtują prawo w wielu krajach.

Cztery dziedzictwa jednego eksperymentu

1. Biologia rozwoju. Dolly potwierdziła u ssaka, że stan dorosłej komórki jest utrzymywany głównie przez regulację, a nie przez konieczne skasowanie całego zestawu genów rozwojowych.

2. Epigenetyka przeprogramowania. Niska wydajność uczyniła z niepowodzeń materiał badawczy. Zaczęto szukać opornych znaków chromatyny, błędów aktywacji genomu, imprintingu, inaktywacji chromosomu X i nieprawidłowości łożyska.

3. Inżynieria zwierząt. Hodowana komórka dawcy stała się miejscem, w którym można wprowadzać i weryfikować zmianę przed rozpoczęciem rozwoju organizmu. Później SCNT połączono z precyzyjniejszą edycją genomu.

4. Medycyna regeneracyjna. Powstało pytanie o wyprowadzanie dopasowanych jądrowo komórek embrionalnych po SCNT oraz o osiąganie podobnego resetu bez zarodka. Linia ta prowadzi do ntESC i iPSC, choć każda z tych technologii ma inny produkt i inny profil ryzyka.

Reakcja regulacyjna nie była dowodem możliwości u człowieka

Informacja o Dolly natychmiast została przełożona na pytanie o klonowanie człowieka. W Stanach Zjednoczonych prezydent Bill Clinton zwrócił się w 1997 roku do National Bioethics Advisory Commission o pilną ocenę problemu i ograniczył federalne finansowanie prób reprodukcyjnego klonowania ludzi. W tym samym roku UNESCO przyjęło Powszechną Deklarację o Genomie Ludzkim i Prawach Człowieka, której artykuł 11 wskazuje reprodukcyjne klonowanie ludzi jako praktykę sprzeczną z godnością człowieka.¹⁵

Debata etyczna była uzasadniona potencjalnym kierunkiem zastosowania, ale biologicznie Dolly nie stanowiła dowodu, że procedura zadziała u człowieka. Między gatunkami różnią się oocyt, aktywacja genomu, rozwój łożyska i reakcja na manipulację. Co więcej, lejek 1/277 oraz straty ciążowe u zwierząt oznaczały, że bezpośrednia próba kliniczna narażałaby oocyty, zarodki, osoby w ciąży i przyszłe dzieci na ryzyko nieakceptowalne przy braku korzyści terapeutycznej.

Trzeba też rozdzielić trzy zastosowania, które w debacie często nazywano jednym słowem:

• reprodukcyjne SCNT zakończone próbą urodzenia;
• SCNT do wyprowadzenia linii komórek embrionalnych bez ciąży;
• klonowanie DNA lub komórek, które nie tworzy organizmu.

Sprzeciw wobec pierwszego nie jest automatycznie oceną dwóch pozostałych. Dolly przyspieszyła zarówno zakazy reprodukcyjne, jak i badania nad przeprogramowaniem komórkowym.

Dlaczego nie powstał uniwersalny „przepis Dolly”

Po 1997 roku sklonowano kolejne gatunki, ale szczegóły procedury nie przenosiły się automatycznie. Różnią się:

• dostępność i jakość oocytów;
• czas aktywacji genomu zarodkowego;
• wrażliwość na manipulację wrzeciona;
• reakcja na sposób aktywacji;
• imprinting i rozwój łożyska;
• długość ciąży oraz możliwość obserwacji strat;
• podatność konkretnych typów komórek dawcy.

Sukces u owcy dowodził zasady dla ssaków, nie równoważności protokołów. Właśnie dlatego od myszy i bydła do makaków prowadziła długa seria gatunkowo swoistych rozwiązań.

Jak czytać pracę o Dolly

Jednostka eksperymentalna zmienia się po drodze

W lejku pojawiają się oocyty, zarodki, tymczasowe biorczynie, nosicielki i jagnięta. Nie można traktować ich jak tej samej jednostki. Kilka zarodków w jednej nosicielce dzieli środowisko matczyne, a wiele oocytów z jednej samicy dzieli jakość partii.

Współczesna analiza powinna rozdzielić:

dawca komórek
└── linia i pasaż
    └── dzień rekonstrukcji
        └── dawczyni oocytów / partia oocytów
            └── pojedynczy zarodek
                └── nosicielka
                    └── płód lub jagnię

Powtórzenia techniczne na wielu oocytach nie zastępują niezależnych dawców i partii.

Co należałoby zmierzyć dziś

Pełniejsza charakterystyka objęłaby:

1. markery i transkryptom pojedynczych komórek dawcy;
2. zawartość DNA oraz dokładną fazę cyklu;
3. kariotyp i warianty strukturalne linii przed transferem;
4. skuteczność enukleacji;
5. obrazowanie pierwszych podziałów;
6. aktywację genomu zarodkowego;
7. metylację i chromatynę w zarodku oraz łożysku;
8. pełny lejek strat;
9. patologię płodów i łożysk, nie tylko narodziny;
10. genom jądrowy, mtDNA i mozaicyzm potomstwa;
11. wzrost, metabolizm, płodność i starzenie;
12. wynik następnego pokolenia.

Jedno pytanie „czy urodziło się zwierzę?” staje się zatem panelem pytań o tożsamość, mechanizm, bezpieczeństwo i powtarzalność.

Najczęstsze nieporozumienia

Twierdzenie	Korekta
„Dolly była pierwszym sklonowanym zwierzęciem”	była pierwszym ssakiem z jądra komórki wyprowadzonej z dorosłej tkanki
„na pewno powstała z terminalnie dojrzałej komórki produkującej mleko”	dokładnego typu skutecznej komórki w heterogenicznej kulturze nie wykazano
„277 zarodków wszczepiono do 277 owiec”	277 rekonstrukcji przeszło wcześniejszy lejek; 29 zarodków trafiło do 13 nosicielek
„impuls elektryczny skopiował DNA”	umożliwiał fuzję i uczestniczył w aktywacji; DNA kopiowała później maszyneria komórki
„Dolly miała troje rodziców w równym sensie genetycznym”	dawczyni jądra, oocytu i nosicielka wnosiły różne składniki
„urodziła się jako sześcioletnia owca”	rozpoczęła nowy rozwój, choć nie wszystkie ślady wieku jądra musiały zostać usunięte
„krótkie telomery spowodowały jej śmierć”	zmarła z powodu choroby płuc; nie wykazano związku przyczynowego z telomerami
„zdrowe siostry dowodzą pełnego bezpieczeństwa”	opisują ocalałe zwierzęta, nie straty całej procedury
„celem było sprzedawanie kopii owiec”	głównym celem platformy była modyfikacja zwierząt i produkcja białek

Kolejny artykuł, Od myszy i bydła do makaków, pokazuje, dlaczego sukces u owcy nie stał się uniwersalnym przepisem dla wszystkich ssaków.