Streszczenie

Cytometr przepływowy mierzy pojedyncze komórki i cząstki przepływające przez punkt oświetlenia. Dla każdego zdarzenia zapisuje rozproszenie światła i intensywności fluorescencji. Wynik nie jest jednak bezpośrednim „poziomem białka”. Powstaje z połączenia próbki, barwienia, fluidyki, laserów, filtrów, detektorów, ustawień, korekcji nakładania widm oraz analizy.

Dobry eksperyment odpowiada kolejno:

  1. jaka populacja biologiczna ma zostać rozpoznana;
  2. które markery i kontrole ją rozdzielają;
  3. czy instrument ma odpowiednie lasery i detektory;
  4. czy sygnały mieszczą się w zwalidowanym zakresie;
  5. jak odrzucić debris, dublety i martwe komórki;
  6. czy wynik oznacza odsetek, liczbę bezwzględną czy ilościową fluorescencję.

Analizator cytometryczny mierzy. Nie odzyskuje wybranych komórek — to osobne zadanie sortera opisane w artykule Sorter komórek.

Tor pomiarowy cytometru przepływowego: zawiesina komórek jest ogniskowana do strumienia pojedynczych zdarzeń, lasery generują rozproszenie i fluorescencję rozdzielaną filtrami na detektory, a dane wymagają compensation lub spectral unmixing, kontroli jakości i hierarchii bramek.
Tor pomiarowy cytometru przepływowego: zawiesina komórek jest ogniskowana do strumienia pojedynczych zdarzeń, lasery generują rozproszenie i fluorescencję rozdzielaną filtrami na detektory, a dane wymagają compensation lub spectral unmixing, kontroli jakości i hierarchii bramek.

Co jest zdarzeniem

Cytometr nie „widzi komórki” w znaczeniu biologicznym. Rejestruje impuls, gdy obiekt przekracza punkt pomiarowy. Zdarzeniem może być:

  • pojedyncza żywa komórka;
  • martwa komórka;
  • dublet;
  • agregat;
  • jądro;
  • płytka krwi;
  • pęcherzyk;
  • kulka kalibracyjna;
  • debris;
  • elektronowy lub optyczny szum.

To analiza i kontrole nadają zdarzeniu interpretację.

Parametry impulsu

Dla sygnału można zapisać:

  • height (H) — wysokość;
  • area (A) — pole;
  • width (W) — czas trwania.

Pojedyncza komórka i dublet mogą mieć podobne area, lecz inny stosunek height/width. Dlatego bramka singlets używa zwykle FSC-A versus FSC-H albo FSC-W, a nie tylko rozmiaru na jednym histogramie.

Fluidyka: jak uzyskać pojedynczy szereg

Próbka trafia do strumienia sheath fluid. W klasycznej hydrodynamic focusing różnica ciśnień i geometria prowadzą komórki ku osi, aby kolejno przekraczały wąski punkt lasera.

Nie oznacza to idealnej separacji. Przy zbyt dużym stężeniu:

  • dwa obiekty mogą znaleźć się jednocześnie w wiązce;
  • rośnie coincidence;
  • wzrasta abort rate;
  • słabnie rozdzielenie;
  • zatyka się dysza lub flow cell.

Wolniejszy przepływ zwykle daje lepsze CV oraz mniej coincidence, lecz wydłuża akwizycję. Szybki tryb nie jest darmową przepustowością.

Stabilizacja

Na początku próbki przepływ może być niestabilny. Wykres time versus signal ujawnia:

  • pęcherzyk;
  • zator;
  • zmianę ciśnienia;
  • nagły koniec próbki;
  • niestabilne barwienie.

Nie powinno się akceptować danych tylko dlatego, że liczba events została osiągnięta.

Optyka: laser, filtry i detektor

Każdy fluorochrom wymaga wzbudzenia oraz detekcji emisji.

Tor obejmuje:

  1. laser o określonej długości fali;
  2. punkt przecięcia strumienia;
  3. soczewki zbierające;
  4. lustra dichroiczne rozdzielające zakresy;
  5. filtry bandpass/longpass;
  6. detektor;
  7. elektronikę przetwarzającą impuls.

Nazwa kanału typu FITC jest skrótem konfiguracji, nie uniwersalnym pomiarem. Kanał 530/30 zbiera przybliżony zakres 515–545 nm. Inny cytometr może używać innego filtra, lasera i detektora.

Detektory

Klasyczne cytometry wykorzystują photomultiplier tubes, a część nowych konstrukcji photodiodes lub avalanche photodiodes. Ustawienie gain/voltage zmienia położenie sygnału na skali i może wpływać na resolution, lecz nie tworzy fotonów, których próbka nie wyemitowała.

Zbyt niski gain ściska sygnał przy tle. Zbyt wysoki może wprowadzić populację poza zakres. Ustawienie powinno należeć do metody i podlegać kontroli.

FSC i SSC nie są prostym rozmiarem oraz ziarnistością

Forward scatter zależy między innymi od rozmiaru, współczynnika załamania, geometrii komórki, długości fali i kąta detekcji.

Side scatter jest wrażliwy na wewnętrzną złożoność, lecz również na refractive index i instrument.

Dlatego:

  • FSC nie jest kalibrowanym mikrometrem bez odpowiedniego modelu i wzorców;
  • SSC nie jest bezpośrednią „liczbą ziaren”;
  • bramka FSC/SSC wytrenowana na limfocytach nie identyfikuje automatycznie każdego typu komórek;
  • małe obiekty mogą zniknąć poniżej threshold.

Fluorescencja: od znacznika do sygnału

Sygnał zależy od:

  • liczby epitopów;
  • powinowactwa przeciwciała;
  • fluorochrom-to-protein ratio;
  • stężenia;
  • czasu;
  • temperatury;
  • dostępności epitopu;
  • autofluorescencji;
  • instrumentu.

MFI z dwóch eksperymentów nie jest porównywalne tylko dlatego, że użyto tego samego przeciwciała.

Titration

Przeciwciało powinno być miareczkowane dla próbki i panelu. Nadmiar:

  • zwiększa nonspecific staining;
  • podnosi spillover;
  • zwiększa spread;
  • marnuje odczynnik.

Za mało obniża separation. Optimum maksymalizuje rozdzielenie populacji przy rozsądnym tle, nie samą jasność dodatniej.

Autofluorescencja

Komórki martwe, makrofagi, komórki roślinne i niektóre tkanki mogą mieć silne własne widmo. Kontrola unstained jest konieczna, a w cytometrii spektralnej autofluorescence może być modelowana jako dodatkowa składowa, jeśli metoda została zwalidowana.

Nakładanie widm

Fluorochrom emituje szerokie widmo. Część sygnału trafia do sąsiednich detektorów.

Compensation

W cytometrze konwencjonalnym macierz kompensacji odejmuje oszacowany udział fluorochromu w innych kanałach.

Single-stain controls powinny:

  • używać tego samego fluorochromu;
  • dawać wyraźny dodatni i ujemny;
  • być mierzone w tych samych ustawieniach;
  • obejmować barwnik viability, jeśli jest w panelu;
  • odpowiadać próbce lub właściwym beads.

Kompensacja nie usuwa spread. Po odjęciu średniego spillover pozostaje wariancja fotonowa i biologiczna, która poszerza populację.

Spectral unmixing

Cytometr spektralny zbiera większą część widma w wielu detektorach. Algorytm rozkłada mieszaninę na reference spectra.

Wymaga:

  • dobrej biblioteki widm;
  • kontroli każdego fluorochromu;
  • zgodnego stanu barwnika;
  • kontroli autofluorescencji;
  • sprawdzenia residuals.

Unmixing nie naprawia źle dobranego panelu ani niestabilnej próbki.

Projekt panelu

Marker słaby lub rzadki powinien zwykle otrzymać fluorochrom jasny oraz kanał o dobrej sensitivity. Marker silny może użyć słabszego fluorochromu.

Trzeba uwzględnić:

  • co-expression;
  • spillover spreading matrix;
  • autofluorescencję;
  • lasery;
  • filtry;
  • tandem dye stability;
  • fixation/permeabilization;
  • potrzebę viability dye;
  • dostępne klony przeciwciał.

Panel nie jest listą kolorów. Jest projektem rozdzielczości w biologicznie istotnych populacjach.

Kontrole odpowiadają na różne pytania

Kontrola Pytanie
unstained gdzie leży autofluorescencja i tło
single stain jaki jest spillover lub reference spectrum
FMO gdzie ustawić bramkę przy spread pozostałych kolorów
positive biological czy marker i barwienie mogą dać sygnał
negative biological jakie jest biologiczne tło
viability które komórki utraciły błonę
isotype czy wybrany mechanizm nieswoistego wiązania ma znaczenie
beads QC czy instrument działa stabilnie

Isotype control nie zastępuje FMO ani biologicznej kontroli ujemnej.

Przygotowanie próbki

Dobry panel nie uratuje złej zawiesiny.

Kontroluje się:

  • czas od pobrania;
  • dysocjację;
  • filtrację;
  • stężenie;
  • żywotność;
  • agregaty;
  • temperaturę;
  • blokowanie Fc;
  • kolejność barwień;
  • fixation/permeabilization;
  • płukanie;
  • światło.
Martwe komórki

Mają większe nieswoiste wiązanie i autofluorescencję. Viability dye powinien odpowiadać temu, czy próbka będzie utrwalana. Barwnik reaktywny wobec amin może przetrwać fixation; PI lub DAPI wymagają innej logiki.

Fixation

Utrwalanie może zmienić:

  • epitop;
  • scatter;
  • fluorochrom tandemowy;
  • autofluorescencję;
  • reference spectrum.

Kontrole compensation/unmixing powinny odtwarzać stan próbki.

Threshold i trigger

Instrument musi zdecydować, co rejestrować. Threshold ustawiony na FSC może odrzucić małe płytki lub vesicles. Threshold fluorescencyjny może wybierać tylko znakowane obiekty, lecz wykluczać biologicznie ujemne.

Obniżenie progu zwiększa szum i rozmiar pliku. Dla małych cząstek potrzebne są:

  • właściwe blanki;
  • detergent sensitivity test;
  • dilution linearity;
  • analiza swarm detection;
  • wzorce odpowiednie do skali.

NIST rozwija referencyjne mikrosfery dla liczby i fluorescencji submicrometer particles, ponieważ zwykłe beads komórkowe nie wystarczają do wiarygodnego pomiaru EV i wirusów.1

Akwizycja

Przed startem definiuje się:

  • events w populacji docelowej;
  • maksymalny czas;
  • flow rate;
  • objętość;
  • kolejność próbek;
  • wash;
  • kryterium powtórzenia.

Jeżeli populacja stanowi 0,01%, zebranie 10 tys. wszystkich zdarzeń daje oczekiwanie jednej komórki. Liczbę events projektuje się dla rzadkiej populacji, a nie według zwyczaju.

Carryover

Po próbce bardzo dodatniej analizuje się blank. Carryover może pochodzić z igły, przewodu, flow cell i autosamplera. Kolejność powinna ograniczać ryzyko, a procedura wash być zwalidowana.

Gating jest modelem decyzyjnym

Typowa hierarchia:

time-clean events
→ komórki
→ singlets
→ live
→ lineage
→ populacja docelowa
→ marker funkcjonalny

Każdy krok zmienia mianownik. Wynik 20% marker+ jest niepełny bez informacji: 20% czego?

Bramka nie może podążać za oczekiwaniem

Gates ustala się na podstawie kontroli i zapisanej strategii. Przesuwanie ich osobno dla każdej próbki, aby „ładnie objąć populację”, wprowadza bias.

Ręczne gating powinno przejść review. Algorytmiczne clustering wymaga wersji, seed, parametrów, preprocessing i walidacji biologicznej.

Liczba bezwzględna

Odsetek nie mówi, ile komórek znajduje się w materiale.

Absolute count można uzyskać:

  • cytometrem volumetric;
  • beads o znanej liczbie;
  • połączeniem z niezależnym count.

Dla beads:

komórki/µL =
  zdarzenia komórek / zdarzenia beads
  × liczba beads w znanej objętości

Potrzebne są poprawne mieszanie, brak sedymentacji i kwalifikacja pipetowania.

Daily QC, standardization i calibration

To trzy poziomy.

Daily QC

Beads sprawdzają:

  • alignment;
  • sensitivity;
  • background;
  • CV;
  • stabilność fluidyki.

Wynik porównuje się z trendem i control limits, nie tylko napisem pass.

Standardization

Ustawienia cytometru można dostosować tak, aby bead target values pozostawały stałe między dniami. Pozwala to utrzymać comparability metody.

Calibration

Kalibracja przekłada skalę arbitralną na jednostki odniesienia, na przykład ERF lub MESF. NIST opisuje przypisywanie equivalent reference fluorophores do mikrosfer i rozwija standardy ilościowej cytometrii.2

Bead nie jest komórką. Różni się widmem, rozpraszaniem i powierzchnią. Kalibruje część toru, nie całą odpowiedź biologiczną.

Walidacja assay

CLSI H62, uznany przez FDA standard dla walidacji testów wykonywanych cytometrią, obejmuje preexamination, kwalifikację i standaryzację instrumentu, optymalizację, walidację, QC oraz review i przechowywanie danych.3

W zależności od celu bada się:

  • specificity;
  • precision;
  • intermediate precision;
  • linearity;
  • reportable range;
  • detection capability;
  • carryover;
  • stability;
  • robustness;
  • porównanie platform;
  • wpływ operatora;
  • wpływ partii reagenta.
Rare events

Potrzebne są próbki z niską liczbą, blanki, wiele events i oszacowanie false positive rate. „Nie wykryto” powinno odpowiadać zwalidowanej granicy, nie zeru na ekranie.

Precision ma kilka poziomów

Powtórne przeanalizowanie tego samego pliku bada tylko analysis precision. Nie obejmuje barwienia ani instrumentu.

Warto rozdzielić:

  • ponowne gating tego samego FCS;
  • powtórną akwizycję tej samej probówki;
  • dwa aliquoty po wspólnym barwieniu;
  • niezależne barwienia;
  • dni;
  • operatorów;
  • partie odczynników;
  • cytometry.

Każdy poziom odpowiada na inne pytanie. Jeśli endpoint ma być stosowany w badaniu wieloośrodkowym, powtarzalność na jednym instrumencie jest za słabym dowodem.

Randomizacja i batch

Próbki grup biologicznych powinny być rozłożone między dniami, płytkami i kolejnością akwizycji. Jeżeli wszystkie kontrole są mierzone rano, a wszystkie przypadki po południu, drift i carryover mogą udawać efekt biologiczny.

Należy zapisać:

  • kolejność barwienia;
  • kolejność akwizycji;
  • czas od barwienia;
  • operatora;
  • dzień;
  • cytometr;
  • partię cocktail.

W analizie można uwzględnić batch, ale statystyka nie naprawi pełnego confounding.

Cztery przykłady diagnostyczne

1. Populacja dodatnia przesuwa się każdego dnia

Możliwe przyczyny:

  • różne gain;
  • drift lasera;
  • zmiana przeciwciała;
  • czas od barwienia;
  • biologiczny efekt.

Najpierw sprawdza się beads QC, ustawienia i controls. Dopiero potem interpretuje biologię.

2. FMO jest szerokie

To może być oczekiwany spread od jasnego fluorochromu w innym kanale. Kompensacja nie „wyostrzy” populacji. Panel trzeba przeprojektować: przenieść współeksprymowane markery albo wybrać inne fluorochromy.

3. Spada event rate

Time plot pokazuje stopniowy spadek. Możliwe są:

  • sedymentacja;
  • kończąca się próbka;
  • agregaty;
  • częściowy zator;
  • wzrost lepkości.

Podanie jednej średniej z całego pliku ukrywa niestabilność.

4. Rzadka populacja występuje tylko po próbce dodatniej

To typowy sygnał carryover. Blank i zmiana kolejności pomagają odróżnić go od prawdziwego wykrycia.

Review wyniku

Osoba przeglądająca powinna widzieć:

  • QC instrumentu;
  • time plot;
  • wszystkie etapy bramek;
  • kontrole;
  • compensation/unmixing residuals;
  • liczbę zdarzeń;
  • odsetek wykluczonych dubletów i martwych;
  • ostrzeżenia o threshold;
  • zgodność mianownika.

Wykres końcowy bez rodziców bramki nie pozwala ocenić selekcji.

Dane i metadane

Plik FCS przechowuje event-level data oraz keywords. Standard FCS 3.1 służy wymianie danych między instrumentami i programami.4

Archiwizuje się:

  • raw FCS;
  • compensation/unmixing;
  • panel;
  • klony i partie;
  • cytometr i konfigurację;
  • settings;
  • QC;
  • gating template;
  • wyniki;
  • wersję programu;
  • audit trail.

Eksport samych wykresów PDF uniemożliwia reanalizę.

Konserwacja

Rutynowo kontroluje się:

  • sheath i waste;
  • płyny czyszczące;
  • filtry;
  • sondę;
  • flow cell;
  • pęcherzyki;
  • wycieki;
  • laser status;
  • temperaturę reagentów;
  • autosampler;
  • harmonogram deep clean.

Podchloryn może być potrzebny do dekontaminacji, ale pozostałość i niezgodność materiałowa mogą zaszkodzić urządzeniu. Stosuje się instrukcję modelu.

Zator

Objawy:

  • spadek event rate;
  • niestabilny time plot;
  • zmiana scatter;
  • alarm ciśnienia;
  • wzrost CV beads.

Nie zwiększa się bez końca ciśnienia. Uruchamia się procedurę unclog, filtruje próbkę i ocenia, czy część danych jest ważna.

Dobór cytometru

Pytania:

  • ile parametrów potrzebuje panel;
  • jakie lasery;
  • jakie filtry lub zakres spektralny;
  • jaka sensitivity;
  • jaki rozmiar cząstek;
  • jaki throughput;
  • volumetric counting;
  • plate loader;
  • automatyzacja QC;
  • dostępność serwisu;
  • koszt odczynników i oprogramowania.

Więcej kolorów nie jest wartością samoistną. Instrument ma rozdzielić najtrudniejsze populacje panelu.

Przykładowe klasy urządzeń

Przykłady nie są rekomendacjami:

  • analizatory konwencjonalne: BD FACSCanto, LSRFortessa, FACSymphony; Beckman Coulter CytoFLEX; Agilent NovoCyte;
  • analizatory spektralne: Cytek Aurora, Sony ID7000;
  • małe analizatory stołowe: Thermo Fisher Attune, Miltenyi MACSQuant;
  • imaging flow cytometry: Cytek Amnis ImageStream — łączy zdarzenia cytometryczne z obrazem.

Konfiguracja konkretnego egzemplarza ma większe znaczenie niż nazwa serii.

Checklista przed panelem

  • Czy populacja i mianownik są zdefiniowane?
  • Czy markery mają biologiczne kontrole?
  • Czy przeciwciała są zmiareczkowane?
  • Czy panel uwzględnia co-expression i spread?
  • Czy single-stain controls odpowiadają próbce?
  • Czy jest FMO dla niejednoznacznej bramki?
  • Czy viability dye pasuje do utrwalania?
  • Czy cytometr przeszedł QC?
  • Czy settings i threshold należą do metody?
  • Czy flow rate jest właściwy?
  • Czy zebrano dostateczną liczbę populacji rzadkiej?
  • Czy time plot jest stabilny?
  • Czy surowe FCS i metadane zostaną zachowane?

Checklista po akwizycji

  • Czy QC było w limicie przed i po serii?
  • Czy time plot jest stabilny?
  • Czy event rate nie wskazuje coincidence?
  • Czy wszystkie kontrole zostały zmierzone?
  • Czy compensation lub unmixing ma sensowne residuals?
  • Czy rare population przekracza false positive background?
  • Czy pliki mają jednoznaczne nazwy i sample IDs?
  • Czy kolejność i batch są zapisane?
  • Czy gating przeszedł niezależny review?
  • Czy wynik ma jawny mianownik i jednostkę?

Najkrótsza zasada

Cytometr nie mierzy „markera”. Mierzy impulsy optyczne w określonym torze; marker powstaje dopiero po kontroli próbki, panelu, instrumentu, korekcji widm i bramek.

Powiązany artykuł Mikroskopia, cytometria i sortowanie porównuje cytometrię z technikami obrazowymi i analizą pierwiastkową.