Streszczenie

Wykryty profil nie przechodzi bezpośrednio z osoby na elektroferogram. Między czynnością a wynikiem istnieją co najmniej cztery procesy: transfer materiału, jego przetrwanie, obecność tła oraz odzysk w pobraniu i analizie. W literaturze sądowej opisuje je skrót TPPR: transfer, persistence, prevalence i recovery. Każdy proces jest zależny od materiału, powierzchni, czasu, środowiska, kolejnych kontaktów i metody.

Degradacja to zmiana DNA po jego pozostawieniu: fragmentacja, modyfikacje zasad, utrata amplifikowalnych celów i rozwój mikroorganizmów. Kontaminacja to niepożądane wprowadzenie materiału na dowód lub do próbki w procesie sądowym. Tło oznacza DNA nieznanego pochodzenia obecne na powierzchni z wcześniejszych, nieznanych czynności. Prevalent DNA może pochodzić od znanego rutynowego użytkownika. Te pojęcia mają różne źródła i konsekwencje.

DNA kontaktowe nie jest jednym typem komórki ani dowodem dotknięcia przez konkretną osobę. Może zawierać DNA komórkowe i pozakomórkowe, zostać przeniesione bezpośrednio lub przez pośrednika, przetrwać wcześniejszą czynność, przesunąć się podczas użycia i zostać pobrane tylko z części powierzchni. Ilość DNA nie jest prostym zegarem ani licznikiem kontaktów.

Ocena poziomu aktywności porównuje prawdopodobieństwo wyników przy dwóch konkretnych wersjach czynności. Nie pyta ogólnie „czy transfer wtórny jest możliwy”, bo prawie zawsze jest możliwy. Pyta, jak prawdopodobna jest obserwowana lokalizacja, ilość, jakość, skład i rozkład śladów, jeśli wykonano czynność A, w porównaniu z czynnością B.

Model TPPR od czynności przez transfer, trwałość, tło i odzysk do wyniku profilu. Osobny tor pokazuje kontaminację wprowadzoną podczas zabezpieczania, transportu lub analizy.
Model TPPR od czynności przez transfer, trwałość, tło i odzysk do wyniku profilu. Osobny tor pokazuje kontaminację wprowadzoną podczas zabezpieczania, transportu lub analizy.

DNA śladowe nie ma jednej definicji masowej

Określenia „trace DNA”, „touch DNA” i „low-template DNA” bywają używane wymiennie, choć opisują inne własności.

  • DNA śladowe może oznaczać małą, niewidoczną ilość materiału odzyskaną z powierzchni.
  • DNA kontaktowe opisuje domniemaną drogę pozostawienia przez kontakt, a nie rodzaj cząsteczki.
  • Low-template DNA dotyczy małej liczby amplifikowalnych cząsteczek w reakcji.
  • Low-level profile opisuje niski sygnał danych.

Duża powierzchnia może zawierać dużo DNA rozproszonego, ale mało w pojedynczym aliquocie. Mały widoczny ślad może dać silny profil. Wysoki pik minor contributor może pochodzić z niewielkiej ilości względnej wobec głównego dawcy.

Definicja operacyjna laboratorium powinna odnosić się do etapu: masy oszacowanej qPCR, ilości wprowadzonej do PCR, wysokości pików, liczby odczytów lub zachowania stochastycznego. Sam przymiotnik „śladowe” nie określa czułości ani wiarygodności.

TPPR: cztery filtry między czynnością a wynikiem

Załóżmy, że osoba A wykonuje czynność z przedmiotem. Aby jej DNA zostało później wykryte:

  1. materiał musi zostać przeniesiony;
  2. musi przetrwać do chwili pobrania;
  3. musi zostać rozpoznany na tle DNA już obecnego;
  4. musi zostać odzyskany przez pobranie, ekstrakcję, amplifikację i detekcję.

Brak wyniku może powstać na każdym filtrze. Wynik dodatni także może pochodzić z wielu dróg. Model TPPR nie jest osobnym testem laboratoryjnym. Jest ramą łączącą eksperymenty, wiedzę o przypadku i obserwowany rozkład materiału.

ISFG zaleca, aby na poziomie aktywności konstruować propozycje wokół konkretnych czynności, a nie wpisywać do nich ogólnego słowa „transfer”. Transfer, przetrwanie i odzysk są mechanizmami używanymi do oceny prawdopodobieństwa wyników przy tych czynnościach.1

Transfer bezpośredni

Transfer bezpośredni zachodzi, gdy materiał przechodzi z dawcy na badany obiekt bez pośrednika. Może to być:

  • krew spadająca na podłoże;
  • ślina na brzegu naczynia;
  • komórki skóry na rękojeści;
  • włos na odzieży;
  • nasienie na wymazówce pobranej z ciała.

„Bezpośredni” opisuje drogę, nie znaczenie prawne. DNA może zostać naniesione bezpośrednio podczas niewinnej czynności. Może też powstać w śladzie starszym niż zdarzenie.

Ilość zależy między innymi od:

  • rodzaju materiału biologicznego;
  • wilgotności;
  • powierzchni kontaktu;
  • tarcia i nacisku;
  • czasu oraz liczby ruchów;
  • miejsca na ciele;
  • podłoża;
  • wcześniejszego mycia i kontaktów;
  • indywidualnego wydzielania;
  • metody pobrania.

Nie istnieje uniwersalny odsetek skutecznego transferu bezpośredniego.

Transfer przez pośrednika

Materiał może przejść z A na B, a następnie z B na C. Pośrednikiem może być:

  • ręka;
  • rękawiczka;
  • narzędzie;
  • tkanina;
  • opakowanie;
  • stół;
  • wspólny przedmiot;
  • kropla płynu;
  • aerozol.

Kolejny etap zwykle zmniejsza ilość, ale nie zawsze prowadzi do słabszego profilu niż materiał bezpośredni. A może pozostawiać dużo DNA, powierzchnia B może je skutecznie przenieść, a osoba bezpośrednio dotykająca C może pozostawiać mało. Ranking wysokości nie jest rankingiem dróg.

Terminy „transfer pierwotny”, „wtórny” i „trzeciorzędowy” bywają przydatne w eksperymencie, lecz mogą zaciemniać propozycje sądowe. Lepiej opisać czynności:

  • A chwyciła nóż;
  • B uścisnęła dłoń A, a potem chwyciła nóż;
  • A nigdy nie dotykała noża.

Wtedy wiadomo, jakie zdarzenia należy modelować.

Transfer pośredni nie jest hipotezą awaryjną

Samo stwierdzenie, że transfer pośredni „jest możliwy”, ma małą wartość. Właściwe pytania:

  • jaki materiał znajdował się na pośredniku;
  • ile czasu minęło;
  • jakie były kolejne kontakty;
  • czy powierzchnie były suche czy mokre;
  • gdzie na przedmiocie odzyskano DNA;
  • czy obecny jest profil pośrednika;
  • jakie tło było oczekiwane;
  • czy eksperyment odpowiada tej sekwencji czynności.

Hipoteza pośrednia powinna być konkretna i faktycznie alternatywna wobec wersji oskarżenia. Nie można jej dobierać dopiero po zobaczeniu, że wyjaśnia profil.

„Dobry shedder” nie jest trwałą cechą osobowości

Badania wykazują różnice między osobami w ilości DNA odzyskiwanego po kontakcie. Popularny skrót dzieli ludzi na good i poor shedders. To użyteczne opisowo, ale nie jest stała diagnoza.

Wynik jednej osoby zmieniają:

  • pora i aktywność;
  • mycie rąk;
  • pot;
  • stan skóry;
  • dotykanie twarzy i włosów;
  • materiał przeniesiony z innych obiektów;
  • siła i czas kontaktu;
  • używana ręka;
  • powierzchnia;
  • sposób pobrania.

„A zwykle zostawia dużo DNA” nie pozwala dokładnie przewidzieć konkretnego zdarzenia. Klasyfikacja shedder status ma niepewność, zależy od protokołu i może włączać DNA pochodzące z innych miejsc.

Materiał komórkowy i pozakomórkowy

DNA kontaktowe może znajdować się:

  • w jądrzastych komórkach nabłonkowych;
  • w leukocytach płynów;
  • w fragmentach komórek;
  • jako DNA pozakomórkowe;
  • w materiale przeniesionym z potu, śliny lub wydzielin;
  • na cząstkach i włóknach.

Liczba komórek nie musi korelować liniowo z ilością DNA. Część komórek może nie mieć jądra, być uszkodzona albo nie uwolnić DNA. Barwienie komórek i qPCR mierzą różne rzeczy.

Metody rozdzielania komórek mogą wzbogacić składnik, ale nie przypisują automatycznie komórki do aktywności. Komórka na rękawiczce nadal może pochodzić z transferu pośredniego.

Podłoże decyduje o przyjęciu i oddaniu materiału

Powierzchnie różnią się:

  • porowatością;
  • chropowatością;
  • energią powierzchniową;
  • absorpcją płynu;
  • elektrostatyką;
  • podatnością na ścieranie;
  • obecnością inhibitorów;
  • możliwością czyszczenia.

Gładkie szkło może przyjąć materiał inaczej niż surowe drewno. Tkanina może zatrzymać komórki głęboko, ale utrudnić odzysk. Rowki rękojeści gromadzą materiał z wielu kontaktów. Metal może być dobrym podłożem do transferu, lecz korozja i środowisko wpływają na zachowanie.

Badanie na innym podłożu nie jest automatycznie przenoszalne. Nawet „bawełna” obejmuje różne sploty, wykończenia i zużycie.

Kontakt dynamiczny i statyczny

Przy statycznym dotknięciu materiał osiada w miejscu nacisku. Przy chwytaniu, obracaniu lub przesuwaniu:

  • materiał może się ścierać;
  • przesuwać na krawędzie;
  • mieszać z tłem;
  • przenosić na kolejne strefy;
  • zostać usunięty przez następną dłoń.

Lokalizacja bywa bardziej informacyjna niż całkowita ilość. DNA na wewnętrznej powierzchni maski ma inne drogi niż na zewnętrznej. DNA na spuście, magazynku i chwycie broni nie ma jednego wspólnego modelu.

Łączenie wszystkich stref w jeden wymaz usuwa tę informację.

Kolejność kontaktów

Ostatni użytkownik nie musi być głównym dawcą. Kolejny kontakt może:

  • dodać nowe DNA;
  • usunąć część wcześniejszego;
  • przesunąć materiał;
  • pozostawić mniej niż poprzednik;
  • mieszać profile;
  • nie dać wykrywalnego wkładu.

Proporcja mieszaniny nie jest niezawodnym zegarem. Duży wkład może być starszy, jeśli pierwszy kontakt był intensywny i materiał dobrze przetrwał. Mały może być świeży.

Eksperyment kolejności wymaga wielu replikatów i randomizacji osób, bo wynik może być zdominowany przez parę konkretnych dawców.

Persistence: przetrwanie bez prostego okresu półtrwania

Po naniesieniu materiał może:

  • pozostać;
  • wyschnąć;
  • ulec hydrolizie i utlenieniu;
  • zostać strawiony przez nukleazy;
  • rozłożyć się mikrobiologicznie;
  • odpaść;
  • rozmazać się;
  • przenieść na inną powierzchnię;
  • zostać pokryty nowym materiałem;
  • zostać usunięty przez czyszczenie.

Nie istnieje uniwersalny okres półtrwania DNA na przedmiotach. Warunki laboratoryjne, stała temperatura i brak użytkowania nie reprezentują ruchomego przedmiotu w środowisku.

„DNA może przetrwać miesiące” nie mówi, z jakim prawdopodobieństwem odzyska się profil po konkretnej czynności. Potrzebny jest materiał, podłoże, ekspozycja, użytkowanie i metoda.

Chemia degradacji

Degradacja obejmuje:

  • pęknięcia nici;
  • depurynację;
  • deaminację zasad;
  • utlenianie;
  • cross-linking;
  • uszkodzenia UV;
  • hydrolizę;
  • aktywność mikroorganizmów.

Skutek analityczny zależy od położenia uszkodzeń względem primerów i od długości celu. Fragmentacja preferencyjnie usuwa długie amplikony. Modyfikowana zasada może powodować błąd sekwencji albo blokadę polimerazy. Cross-link utrudnia denaturację i dostęp enzymu.

Ciemne, suche i chłodne warunki zwykle sprzyjają zachowaniu bardziej niż ciepło, wilgoć i UV, ale matryca śladu może chronić lub szkodzić. Zasuszona krew, kość i swobodne DNA mają inną dynamikę.

Degradacja a inhibicja

Degradacja uszkadza matrycę. Inhibicja zakłóca reakcję analityczną. Objawy mogą się nakładać:

  • niskie piki;
  • utrata loci;
  • przewaga krótkich produktów;
  • niepełny profil.

qPCR z krótkim i długim celem oraz internal PCR control pomaga je rozdzielić. Rozcieńczenie może poprawić inhibicję, ale nie skleja fragmentów. MiniSTR pomaga przy degradacji, ale nie usuwa humusów.

Poprawa po rozcieńczeniu wspiera inhibicję, lecz równocześnie zmienia liczbę kopii. Wynik wymaga kontroli, nie jednego heurystycznego wzorca.

Wskaźnik degradacji

Assay qPCR może porównywać amplifikację krótkiego i dłuższego fragmentu. Stosunek jest indeksem degradacji właściwym dla testu.

Ograniczenia:

  • mierzy dwa konkretne cele, nie cały genom;
  • wariant pod primerem może udawać degradację;
  • inhibicja może wpływać na cele inaczej;
  • mieszanina łączy DNA o różnej jakości;
  • locus STR ma własną długość;
  • indeks zależy od kalibracji.

Wysoki indeks pomaga dobrać krótkie cele lub oczekiwać slope, lecz nie określa wieku śladu.

Wilgoć, temperatura i mikroorganizmy

Wilgotny materiał biologiczny wspiera enzymy i wzrost mikroorganizmów. Bakterie i grzyby mogą niszczyć ludzkie DNA, dostarczać własne kwasy nukleinowe i produkty hamujące PCR.

Wysuszenie zatrzymuje wiele procesów, ale nie odwraca szkody. Zamrożenie zachowuje wybrane próbki, lecz cykle zamrażania i rozmrażania oraz nieszczelność zmieniają materiał. Chłodzenie nie zastępuje suchego, właściwego opakowania dla dowodu, który powinien być suszony.

Historia temperatury jest istotniejsza niż nominalna temperatura końcowa. Próbka przegrzana w samochodzie, a potem zamrożona nie staje się pierwotna.

NISTIR 7928 traktuje pakowanie, transport, śledzenie i przechowywanie jako jeden cykl zachowania dowodu biologicznego.2

UV i środki chemiczne

UV tworzy fotoprodukty i pęknięcia. Światło słoneczne ma równocześnie ciepło, wilgoć i zmienność, dlatego prosty czas ekspozycji nie wystarcza.

Środki utleniające, wybielacze, kwasy i zasady mogą degradować DNA. Detergent może usunąć materiał z powierzchni, ale przenieść go do szczelin. Czyszczenie nie gwarantuje zera; zmienia prawdopodobieństwo i rozkład.

Wniosek „przedmiot był wyczyszczony, więc DNA musiało pochodzić później” wymaga wiedzy o metodzie, powierzchni i skuteczności. Sam brak widocznej plamy nie dowodzi czyszczenia.

Prevalence: DNA już obecne

Przed zdarzeniem przedmiot może mieć materiał:

  • właściciela;
  • domowników;
  • producenta i pakującego;
  • sprzedawcy;
  • serwisanta;
  • wcześniejszych użytkowników;
  • nieznanych osób z otoczenia.

ENFSI rozróżnia background DNA z nieznanych źródeł i czynności od prevalent DNA znanych osób obecnego z rutynowej aktywności.3 To rozróżnienie pomaga budować propozycje.

Profil właściciela na telefonie jest zwykle oczekiwany i nie musi być kontaminacją. Profil nieznanej osoby pod paznokciami może być tłem. Profil technika laboratoryjnego w blanku może być kontaminacją procesu.

Ta sama osoba może być prevalent w jednym miejscu i nieoczekiwana w innym. Kontekst definiuje kategorię.

Tło nie jest stałą liczbą

Prevalence zależy od:

  • typu przedmiotu;
  • miejsca publicznego lub prywatnego;
  • liczby użytkowników;
  • czasu od czyszczenia;
  • materiału;
  • klimatu;
  • sposobu pobrania;
  • czułości assay;
  • polityki interpretacji.

Badanie klamek w biurze nie daje częstości tła dla wewnętrznej strony nowej rękawiczki. Eksperyment musi odpowiadać klasie przedmiotu i populacji użytkowników.

Próbki kontrolne ze sceny mogą pokazać lokalne tło, ale same są losowym pobraniem. Brak profilu A w kontroli nie dowodzi, że A nie była obecna w innej strefie.

Kontaminacja jako zdarzenie procesowe

ENFSI definiuje kontaminację jako niepożądane wprowadzenie substancji do przedmiotu w dowolnym punkcie procesu sądowego, w tym między strefami tego samego przedmiotu i między przedmiotami.

Źródła:

  • personel;
  • osoby obecne przed kontrolą miejsca;
  • inny dowód;
  • próbka odniesienia;
  • odczynniki i materiały;
  • narzędzia;
  • powierzchnie;
  • wentylacja;
  • automaty;
  • produkt PCR;
  • pliki i zamiana etykiet.

Kontaminacja biologiczna może być prawdziwym profilem wysokiej jakości. Jakość sekwencji nie ujawnia drogi.

Kontaminacja, drop-in i mieszanina

Kontaminacja ma konkretne źródło procesowe, nawet jeśli nie zostało jeszcze ustalone.

Drop-in w modelu interpretacyjnym oznacza dodatkowy allel lub profil niewyjaśniony przez założonych dawców. Może pochodzić z kontaminacji, tła lub innego rzadkiego zdarzenia.

Mieszanina może być oczekiwanym skutkiem czynności, na przykład wymaz z powierzchni wspólnej. Nie każda mieszanina jest kontaminacją.

Nie należy używać tych słów zamiennie. Model drop-in może uwzględniać częstość nieoczekiwanych alleli, ale nie zastępuje dochodzenia po dodatniej kontroli ujemnej.

Przed kontrolowanym procesem i w jego obrębie

SWGDAM w wytycznych laboratoryjnych definiuje początek kontrolowanego procesu i skupia się na kontaminacji od tego punktu. Zaznacza, że DNA jest powszechne w środowisku, a rosnąca czułość ujawnia sygnały wcześniej niewidoczne.4

To ważna granica odpowiedzialności:

  • DNA naniesione przez osobę przed zabezpieczeniem może być tłem albo materiałem zdarzenia;
  • DNA naniesione przez technika podczas oględzin jest kontaminacją procesu;
  • analitycznie oba mogą wyglądać tak samo.

Dokumentacja dostępu do przedmiotu pozwala odtworzyć tę granicę.

Kontaminacja na miejscu

Ryzyko rośnie przez:

  • wielu ratowników;
  • kaszel, mówienie i kichanie;
  • brak zmiany rękawiczek;
  • wspólną miarkę i aparat;
  • odkładanie przedmiotów razem;
  • zwijanie odzieży śladem do środka;
  • mokre opakowanie;
  • ponowne otwarcie bez czystej strefy;
  • transport wielu dowodów w jednym pojemniku.

Minimalizacja obejmuje maskę, czystą odzież, zmianę rękawiczek, jednorazowe narzędzia, oddzielne opakowania, kolejność od śladu najczulszego i dokumentację wszystkich osób.

Nie zawsze można stworzyć warunki laboratoryjne. Wtedy rejestruje się odstępstwa i uwzględnia je w interpretacji.

Kontaminacja w laboratorium

Najważniejsza zasada to kierunkowy przepływ:

  • dowody o małej zawartości;
  • ekstrakcja;
  • przygotowanie PCR;
  • amplifikacja;
  • produkty po PCR.

Strefy pre- i post-PCR są rozdzielone. Sprzęt, odzież i odczynniki mają przypisanie. Próbki odniesienia i wysokokopijne oddziela się od śladowych przestrzenią albo czasem.

ENFSI wydało w 2023 roku szczegółowe wymagania i rekomendacje minimalizacji kontaminacji obejmujące środowisko, materiały, personel, elimination database, monitoring i reagowanie.

Materiały „forensic DNA grade”

Wymazówki, probówki, rękawiczki i inne materiały mogą zawierać ludzkie DNA z produkcji. ISO 18385 określa wymagania minimalizacji ryzyka kontaminacji ludzkim DNA produktów używanych do pobierania i analizy.

Oznaczenie produktu nie gwarantuje absolutnego zera. System obejmuje produkcję, testowanie, partie, opakowanie i obsługę po dostawie. Laboratorium nadal:

  • przechowuje materiały zamknięte;
  • śledzi lot;
  • bada blanki;
  • reaguje na trend;
  • ocenia zmianę dostawcy.

Profil powtarzający się w wielu laboratoriach i partiach może pochodzić z łańcucha produkcji.

Elimination database

Baza eliminacyjna może obejmować:

  • personel;
  • sprzątanie;
  • serwis;
  • osoby wizytujące;
  • techników miejsca;
  • znane nierozpoznane dotąd profile kontaminacyjne.

Zgodność uruchamia ocenę, nie automatyczne „odjęcie”. Trzeba ustalić dostęp, czas, próbki, kontrole i zakres.

Profil pracownika w materiale może mieć również legalne źródło, jeśli był on uczestnikiem kontrolnego eksperymentu. Kontekst i chain of custody pozostają potrzebne.

Dane eliminacyjne wymagają podstawy prawnej, minimalizacji, ograniczenia dostępu i retencji.

Monitorowanie trendu kontaminacji

Pojedynczy blank może być ujemny, choć proces ma systemowy problem. Laboratorium analizuje:

  • częstość dodatnich blanków;
  • allele i profile powtarzalne;
  • operatora;
  • pokój i stanowisko;
  • zestaw odczynników;
  • lot materiałów;
  • pozycję na płytce;
  • typ próbki;
  • datę, serwis i sprzątanie.

Trend może wskazać:

  • wadliwą partię;
  • carry-over robota;
  • profil pracownika;
  • niewłaściwy przepływ;
  • zanieczyszczony reagent;
  • problem indeksów MPS.

Uzupełnienie SWGDAM z 2026 roku rozszerza aktualną informację o zapobieganiu i wykrywaniu kontaminacji, pokazując potrzebę ciągłej aktualizacji systemu.

Dochodzenie po sygnale w kontroli

Sekwencja:

  1. zabezpiecz dane i materiały;
  2. potwierdź, że sygnał spełnia kryteria;
  3. sprawdź surowe pliki;
  4. przeanalizuj mapę partii;
  5. porównaj inne próbki i personel;
  6. sprawdź wcześniejsze i późniejsze partie;
  7. oceń odczynniki i środowisko;
  8. wyznacz zakres potencjalnego wpływu;
  9. zdecyduj o powtórzeniu;
  10. udokumentuj wniosek i działanie korygujące.

Nie każde zdarzenie unieważnia wszystkie próbki. Nie każde jest też lokalne. Zakres wynika z mechanizmu i walidacji.

Recovery: pobranie jest selekcją

Odzysk obejmuje:

  • wybranie strefy;
  • odłączenie materiału od podłoża;
  • zatrzymanie na wymazówce lub taśmie;
  • uwolnienie w ekstrakcji;
  • zachowanie podczas oczyszczania;
  • trafienie do aliquotu;
  • amplifikację;
  • detekcję ponad kryterium.

Wysoka skuteczność jednego etapu nie kompensuje zera na innym. Jeśli pobrano niewłaściwą strefę, bardzo czuły PCR wykryje dokładnie to, co było na wymazówce, nie to, co znajdowało się obok.

Recovery efficiency jest zależna od podłoża i techniki. Można ją badać przez materiał znanej ilości, ale sztucznie naniesione DNA w buforze może zachowywać się inaczej niż wysuszony ślad biologiczny.

Jedna i dwie wymazówki

Metody single-swab, double-swab wet–dry, wet–wet i różne ruchy pobrania mają odmienne zastosowania. Pierwsza wymazówka może odzyskać większość łatwo dostępnego materiału, druga — resztę albo materiał głębiej związany.

Łączenie wymazówek:

  • zwiększa objętość i potencjalny odzysk;
  • może rozcieńczyć lokalny skład;
  • łączy strefy lub momenty pobrania;
  • zwiększa koszt ekstrakcji.

Rozdzielenie daje możliwość replikatu, ale dwie wymazówki z tej samej powierzchni nie są niezależne i druga ma zmieniony substrat.

Pobranie selektywne

Taśmy, mini-tapes, zeskrobanie, wycięcie i mikrodissekcja mogą celować w komórki lub włókna. Metody obrazowania i sortowania mogą oddzielać morfologicznie różne komórki.

Selektywność zawsze ma podstawę:

  • lokalizację;
  • morfologię;
  • typ komórki;
  • marker biologiczny;
  • fluorescencję;
  • immunologiczne znakowanie.

Jeśli marker nie jest unikalny, wzbogacenie nie oznacza czystości. Każda dodatkowa manipulacja zwiększa ryzyko utraty i kontaminacji.

Ilość DNA nie mierzy czasu

Pokusa: więcej DNA = świeższy lub dłuższy kontakt. Problem:

  • dawcy różnią się;
  • kontakty różnią się naciskiem;
  • powierzchnie zatrzymują inaczej;
  • czyszczenie usuwa nierówno;
  • kolejne kontakty dodają i odejmują;
  • pobranie ma zmienną efektywność;
  • degradacja zależy od środowiska;
  • qPCR ma niepewność.

Ilość może być jedną ze zmiennych w dobrze dobranym eksperymencie, ale nie jest samodzielnym zegarem.

Podobnie kompletność profilu nie datuje. Starszy zasuszony ślad krwi może dać pełniejszy profil niż świeży krótki dotyk.

Gleba, woda i pożar

Środowisko nie działa pojedynczym czynnikiem. W glebie jednocześnie występują:

  • wilgoć;
  • mikroorganizmy;
  • humusy hamujące PCR;
  • minerały wiążące DNA;
  • zmiany pH;
  • temperatura;
  • mechaniczne ścieranie.

Cząsteczki mineralne mogą adsorbować DNA i częściowo chronić je przed nukleazami, ale później utrudnić ekstrakcję. Niska wydajność nie mówi więc, czy materiał został zniszczony, czy pozostał związany.

W wodzie materiał może się rozcieńczyć, przemieścić i osadzić w innym miejscu. Słona i słodka woda, temperatura, przepływ, światło oraz biofilm tworzą inne warunki. Profil na przedmiocie wyłowionym z rzeki nie musi reprezentować tylko dawcy sprzed zanurzenia.

Pożar łączy wysoką temperaturę, wodę gaśniczą, dym, chemikalia i pracę wielu osób. Część tkanki może być zwęglona na powierzchni, a głębiej zachowana. Strategia pobrania uwzględnia gradient, nie etykietę „spalone”.

Ekstrapolowanie prostego testu temperatury na realny pożar jest ryzykowne. Temperatura powierzchni, czas, osłona i wilgoć mogą różnić się o rzędy wielkości.

Pranie i czyszczenie jako proces przestrzenny

Pranie może:

  • usuwać materiał do wody;
  • przenosić go między strefami odzieży;
  • przenosić między ubraniami;
  • rozcieńczać;
  • utrwalać we włóknach;
  • dodawać DNA z bębna;
  • wprowadzać inhibitory.

Wspólne pranie tworzy realistyczną drogę pośrednią. Znalezienie DNA na wypranej odzieży wymaga historii załadunku, temperatury, detergentu, suszenia i powierzchni.

Czyszczenie twardej powierzchni ma podobną dwoistość. Ściereczka usuwa DNA, ale jest również pośrednikiem. Jeden ruch może rozprowadzić materiał na większy obszar i stworzyć słabe profile w miejscach bez pierwotnego kontaktu.

Eksperyment powinien obejmować przed i po, strefy centralne, krawędzie, narzędzie czyszczące i blank środowiska. Sam spadek qPCR nie pokazuje, dokąd materiał trafił.

Kilka śladów nie zawsze daje kilka niezależnych dowodów

Jeśli profil A występuje na trzech strefach tego samego przedmiotu, wyniki mogą być zależne. Jeden kontakt może rozprowadzić materiał, a jedna wymazówka albo rękawiczka przenieść go między strefami.

Przy łączeniu wyników trzeba zapytać:

  • czy strefy pobrano niezależnymi narzędziami;
  • czy materiał mógł przemieścić się podczas użycia;
  • czy próbki pochodzą z jednego śladu;
  • czy miały wspólną ekstrakcję lub płytkę;
  • czy blank wskazuje wspólne źródło;
  • czy model TPPR przewiduje korelację.

Mnożenie trzech LR wymaga warunkowej niezależności przy obu propozycjach albo jawnego modelu zależności. Jeśli wyniki są trzema pomiarami tej samej depozycji, prosty iloczyn może potroić informację pozornie.

Z drugiej strony spójny przestrzenny wzorzec może mieć wartość. Profil na wewnętrznym mankiecie, wewnętrznej dłoni i pasku zapięcia może być bardziej oczekiwany po założeniu rękawiczki niż po krótkim zewnętrznym kontakcie. Ocena dotyczy wspólnego układu, nie sumy niezależnych punktów.

Dane zerowe i granica wykrywania

Badania TPPR często mają wiele zer: w części replikatów nie odzyskano profilu. Zero nie oznacza, że transfer nie zaszedł. Oznacza brak wyniku według procedury.

W analizie trzeba zachować:

  • wyniki poniżej LOQ;
  • próbki bez amplifikacji;
  • częściowe profile;
  • no-call;
  • przerwane reakcje;
  • kontrole nieakceptowalne;
  • rzeczywiste brakujące dane.

„Brak profilu” po poprawnym procesie jest inną kategorią niż „brak danych” po awarii. Łączenie obu zawyża odsetek niepowodzeń.

Próg raportowy cenzuruje rozkład. Materiał poniżej progu może istnieć i czasem pojawić się w replikacie. Model powinien odpowiadać systemowi, którym wygenerowano dane, włącznie z progami.

Zmienność hierarchiczna

Wyniki TPPR mają kilka poziomów:

  • dawca;
  • para dawców;
  • dzień;
  • ręka;
  • kontakt;
  • powierzchnia;
  • próbka;
  • ekstrakcja;
  • amplifikacja;
  • run.

Sto kontaktów jednej osoby nie daje takiej samej wiedzy o populacji jak kontakty wielu osób. Replikaty techniczne nie zastępują biologicznych. Model mieszany może rozdzielić zmienność między dawcami, dniami i assay.

Średnia ilość jest słabym podsumowaniem rozkładu z wieloma zerami i rzadkimi dużymi wartościami. Przydatniejsze są:

  • prawdopodobieństwo uzyskania użytecznego profilu;
  • rozkład ilości warunkowy na wykrycie;
  • kompletność;
  • udział mieszanin;
  • rozkład major/minor;
  • lokalizacja;
  • przedziały niepewności.

Te miary można odnieść do danych sprawy bez udawania, że jedna liczba opisuje cały transfer.

Ślepa ocena i kolejność informacji

Analityk oceniający profil powinien najpierw ustalić cechy danych, zanim pozna pełną narrację i profil osoby podejrzanej. Ekspert TPPR potrzebuje kontekstu czynności, lecz informacje można przekazywać etapowo:

  1. typ przedmiotu i miejsca pobrania;
  2. wyniki biologiczne;
  3. neutralna para czynności;
  4. dane potrzebne do modelu;
  5. pozostałe informacje do sensitivity analysis.

To ogranicza wybieranie eksperymentów i parametrów tylko dlatego, że wspierają oczekiwaną stronę.

Dokumentuje się, jakie informacje ekspert znał przy każdej decyzji. Zmiana propozycji po ujawnieniu nowego faktu jest dopuszczalna, ale musi być jawna.

Lokalizacja, ilość, jakość i skład jako pakiet

Ocena aktywności może wykorzystywać:

  • obecność lub brak;
  • pozycję na przedmiocie;
  • liczbę stref dodatnich;
  • ilość DNA;
  • jakość i degradację;
  • profil pojedynczy lub mieszaninę;
  • względne wkłady;
  • rodzaj materiału biologicznego;
  • zgodność śladów na kilku przedmiotach;
  • tło i użytkowników.

Nie wybiera się tylko tej cechy, która wspiera jedną wersję. Model powinien obejmować obserwacje ustalone przed obliczeniem.

Eksperyment TPPR

Dobre badanie transferu:

  • definiuje czynności;
  • ma konkurencyjne scenariusze;
  • używa właściwego podłoża;
  • odwzorowuje czas i środowisko;
  • randomizuje dawców i kolejność;
  • ma wystarczające replikaty;
  • mierzy tło przed eksperymentem;
  • uwzględnia kontrole;
  • używa tej samej metody pobrania i analizy;
  • raportuje wyniki negatywne;
  • zachowuje rozkłady, nie tylko średnią.

Wyniki powinny pozwalać oszacować prawdopodobieństwo danych, nie tylko stwierdzić, że zjawisko raz zaobserwowano.

Case-specific experiment i dane ogólne

Eksperyment sprawospecyficzny może odtworzyć przedmiot i czynności, lecz zwykle nie odtwarza:

  • dokładnego stanu skóry;
  • historii tła;
  • wszystkich warunków środowiska;
  • rzeczywistego czasu;
  • nieznanych kontaktów.

Dane ogólne mają więcej replikatów, ale gorsze dopasowanie. Ekspert może łączyć:

  • badania publikowane;
  • dane laboratorium;
  • eksperyment case-specific;
  • wiedzę o mechanizmach;
  • okoliczności sprawy.

Musi ujawnić, które dane są przenoszone i gdzie istnieje luka.

NISTIR 8351 podkreśla, że czułość umożliwiająca profil z kilku komórek zwiększa zarówno użyteczność, jak i złożoność mieszanin, tła, transferu oraz oceny istotności.5

Propozycje na poziomie aktywności

Para powinna być:

  • wzajemnie rozróżnialna;
  • odpowiadająca sporowi;
  • wystarczająco konkretna;
  • wolna od wyników wpisanych jako założenie;
  • oparta na tym samym conditioning information.

Przykład:

  • Hp: A założyła rękawiczkę i zawiązała worek;
  • Hd: A nie wykonywała tych czynności; wcześniej podała B dokument, a B założył rękawiczkę i zawiązał worek.

Wyniki mogą obejmować DNA A na wewnętrznej i zewnętrznej stronie, profil B, ilości i tło.

Niepoprawna para:

  • Hp: DNA A przeniosło się bezpośrednio;
  • Hd: DNA A przeniosło się wtórnie.

Wpisuje mechanizm do propozycji i nie definiuje czynności.

Iloraz wiarygodności poziomu aktywności

Schemat:

LR = P(wyniki | czynność Hp, informacje) /
     P(wyniki | czynność Hd, informacje)

Ekspert ocenia prawdopodobieństwo wyników przy czynnościach, nie prawdopodobieństwo winy ani samych propozycji. W mianowniku musi znaleźć się realna alternatywa.

Jeśli danych TPPR brakuje, formalna liczba może dawać pozorną precyzję. Możliwe jest:

  • ocena jakościowa;
  • zakres wrażliwości;
  • ograniczenie wniosku do źródła;
  • wskazanie, że poziomu aktywności nie można rzetelnie ocenić.

Brak liczby bywa bardziej naukowy niż liczba bez podstawy.

„Możliwe” i „prawdopodobne”

W sądzie pytanie „czy transfer pośredni jest możliwy?” jest zwykle słabe. Demonstracja możliwości nie określa względnych prawdopodobieństw.

Ekspert powinien rozdzielić:

  • możliwość mechanizmu;
  • częstość w badaniach;
  • dopasowanie do sprawy;
  • prawdopodobieństwo pełnych wyników;
  • niepewność.

Jeden eksperyment pokazujący transfer nie dowodzi, że wyjaśnia konkretny profil. Z kolei brak transferu w kilku próbach nie dowodzi niemożliwości.

Wynik negatywny

Brak profilu po czynności może wynikać z:

  • braku transferu;
  • utraty;
  • niewłaściwej strefy;
  • małego odzysku;
  • degradacji;
  • inhibicji;
  • dropout.

Negatywny wynik jest informacyjny, jeśli znamy sensitivity dla podobnej czynności. Jeśli prawdopodobieństwo wykrycia po Hp jest wysokie, brak może wspierać Hd. Jeśli niskie, brak ma małą wartość.

Nie używa się zasady „brak DNA = brak kontaktu”.

Raportowanie kontaminacji

Raport powinien określić:

  • gdzie wykryto sygnał;
  • jaki był poziom i zakres;
  • jakie kontrole dotyczyły partii;
  • czy ustalono źródło;
  • jakie próbki mogły być dotknięte;
  • jakie działania podjęto;
  • jak zmieniono interpretację;
  • czego nie można rozstrzygnąć.

Nie należy ukrywać kontroli, ponieważ „nie zmienia końcowego profilu”. Odbiorca musi znać podstawę zaufania.

Studium 1: wspólny nóż kuchenny

Na rękojeści noża wykryto mieszaninę z silnym wkładem właściciela A i słabym wkładem B. B twierdzi, że poprzedniego dnia podał A ręcznik, ale noża nie dotykał.

Do oceny potrzebne są:

  • historia użytkowania noża;
  • strefy pobrania;
  • profil na ostrzu i innych przedmiotach;
  • możliwość transferu przez ręcznik i dłoń A;
  • czas oraz czyszczenie;
  • ilość i jakość B;
  • tło kuchni.

Zgodność źródłowa B może być silna. Pytanie o chwytanie noża wymaga TPPR.

Studium 2: profil ratownika

Na odzieży osoby poszkodowanej pojawia się profil ratownika. Dokumentacja pokazuje, że ratownik bez zmiany rękawiczek przenosił kilka przedmiotów.

To konkretna potencjalna droga kontaminacji terenowej. Należy:

  • porównać profil eliminacyjny;
  • odtworzyć kolejność;
  • sprawdzić inne próbki;
  • ocenić lokalizację;
  • ujawnić zdarzenie w raporcie;
  • skorygować procedurę.

Profil może być prawdziwy i pełny, a mimo to nie odnosić się do czynu.

Studium 3: DNA producenta

Na nowym pakowanym materiale wykryto nieznany profil powtarzający się w kilku sprawach. Przedmioty pochodzą z tej samej partii.

Wzorzec sugeruje produkcyjne źródło. Dochodzenie obejmuje lot, niewykorzystane opakowania, dostawcę, profile personelu i inne laboratoria. To pokazuje, dlaczego „nowy” nie znaczy „wolny od DNA”.

Studium 4: starszy profil jest główny

Osoba A używała narzędzia regularnie. B użyła go raz podczas badanego zdarzenia. Profil A jest główny, B słaby.

Proporcja jest zgodna z akumulacją prevalent DNA A i krótkim kontaktem B. Może też wynikać z różnic shedder status. Nie pozwala sama ustalić kolejności. Lokalizacja i eksperymenty użytkowania są ważniejsze niż ranking pików.

Studium 5: czyszczenie

Przedmiot przetarto detergentem. Po wysuszeniu w szczelinie uzyskano pełny profil A, a z gładkiej powierzchni brak wyniku.

Wniosek nie brzmi „A dotykała po czyszczeniu”. Szczelina mogła chronić wcześniejszy materiał. Czyszczenie zmieniło przestrzenny odzysk. Potrzebny jest model powierzchni i czynności.

Najczęstsze błędy

Touch DNA jako dowód dotknięcia. Nazwa próbki nie rozstrzyga drogi.

Główny dawca jako ostatni użytkownik. Ilość nie jest chronologią.

Pełny profil jako świeży ślad. Zachowanie zależy od materiału i środowiska.

Transfer pośredni jako magiczna alternatywa. Musi mieć konkretną sekwencję czynności.

Tło jako kontaminacja. Tło mogło istnieć przed procesem.

Mieszanina jako błąd. Może być oczekiwanym wynikiem wspólnego użycia.

Ujemny blank jako absolutna czystość. Lokalna kontaminacja mogła ominąć blank.

Dodatni blank jako automatyczna utrata całej partii. Zakres ocenia się mechanistycznie.

Shedder status jako stała cecha. Jest zależny od osoby, dnia, czynności i assay.

Indeks degradacji jako wiek. Mierzy relację dwóch celów, nie czas.

Czyszczenie jako wyzerowanie. Może usuwać, przesuwać i selektywnie zachowywać materiał.

Możliwość jako prawdopodobieństwo. Jedno zaobserwowane zdarzenie nie daje częstości.

Lista kontrolna oceny TPPR

  1. Jakie dokładne czynności porównujemy?
  2. Jaki materiał biologiczny mógł powstać?
  3. Jakie były drogi bezpośrednie i pośrednie?
  4. Jaki jest typ, stan i historia przedmiotu?
  5. Jakie osoby były rutynowymi użytkownikami?
  6. Gdzie dokładnie pobrano próbki?
  7. Jaki jest rozkład ilości, jakości i profili?
  8. Jakie tło zbadano?
  9. Jakie warunki wpływały na persistence?
  10. Czy metoda odzysku odpowiada podłożu?
  11. Czy wystąpiły zdarzenia kontaminacyjne?
  12. Jak dobrze dane eksperymentalne odpowiadają sprawie?
  13. Jakie są luki i sensitivity analysis?
  14. Czy można ocenić aktywność, czy tylko źródło?

Co zapamiętać

  1. Między czynnością a profilem działają transfer, persistence, prevalence i recovery.
  2. DNA kontaktowe nie jest jednoznacznym dowodem bezpośredniego dotknięcia.
  3. Ilość DNA nie jest zegarem ani licznikiem kontaktów.
  4. Kolejny użytkownik nie musi być głównym dawcą.
  5. Degradacja uszkadza DNA; inhibicja zakłóca reakcję.
  6. Kontaminacja jest niepożądanym wprowadzeniem w procesie, tło może istnieć wcześniej.
  7. Blank, baza eliminacyjna i monitoring trendu wykrywają różne klasy problemów.
  8. Recovery zaczyna się od wyboru strefy i kończy dopiero po detekcji.
  9. Propozycje o aktywności opisują konkretne czynności, nie ogólne mechanizmy transferu.
  10. Gdy danych TPPR brakuje, należy ograniczyć wniosek zamiast tworzyć pozornie precyzyjną liczbę.