Co właściwie znaczy „klonowanie”

Streszczenie

Klon to zbiór biologicznych obiektów wywodzących się ze wspólnego źródła bez mieszania materiału genetycznego w rozmnażaniu płciowym. Zależnie od skali obiektem może być cząsteczka DNA, populacja komórek, zarodek albo organizm. Wspólne słowo nie oznacza wspólnej procedury.

Najbezpieczniej używać terminu „klonowanie” z dopełnieniem: klonowanie DNA, klonowanie komórkowe, dzielenie zarodka, transfer jądra albo klonowanie reprodukcyjne. Samo zdanie „naukowcy coś sklonowali” jest prawie zawsze zbyt mało precyzyjne, aby ocenić znaczenie wyniku.

Od gałązki do biologii molekularnej

Słowo clone wywodzi się od greckiego klōn, czyli gałązki lub pędu. Początkowo pasowało przede wszystkim do roślin rozmnażanych wegetatywnie: odcięty fragment daje nowy organizm bez połączenia gamet dwóch rodziców. Później termin przeniesiono na mikroorganizmy, komórki, DNA i całe zwierzęta.¹

W każdym z tych zastosowań pozostaje ta sama intuicja: wiele obiektów ma wspólnego przodka albo wspólny wzorzec, który został powielony. Zmieniają się natomiast:

• jednostka podlegająca kopiowaniu;
• mechanizm tworzenia kopii;
• stopień podobieństwa, którego można oczekiwać;
• test potrzebny do potwierdzenia wyniku.

Współczesny słownik NHGRI obejmuje pojęciem klonowania wykonywanie identycznych lub niemal identycznych kopii organizmu, komórki albo sekwencji DNA.² Sformułowanie „niemal identycznych” jest istotne. Każde kopiowanie biologiczne odbywa się w czasie, a w tym czasie mogą powstawać mutacje, zmiany epigenetyczne i różnice środowiskowe.

Cztery osie, których nie wolno zlewać

W słowie „identyczny” mogą kryć się co najmniej cztery różne twierdzenia:

Oś porównania	Pytanie kontrolne	Przykład wyniku
genealogia	czy obiekty pochodzą od jednego przodka lub jednej matrycy?	wszystkie komórki kolonii wyrosły z jednego transformanta
sekwencja	czy porównany odcinek DNA ma ten sam zapis?	insert w plazmidzie zgadza się z projektem
stan biologiczny	czy komórki mają ten sam epigenom, transkryptom i fizjologię?	dwie komórki jednego klonu mogą być w różnych fazach cyklu
fenotyp	czy obiekty wyglądają i działają tak samo?	klony zwierzęce mogą różnić się umaszczeniem, zachowaniem i zdrowiem

Klonalność jest przede wszystkim twierdzeniem o genealogii. Zgodność sekwencji jest jej oczekiwaną, ale zawsze ograniczoną konsekwencją. Nie wynika z niej automatycznie identyczność całych genomów, stanów komórkowych ani cech organizmu. Ta różnica porządkuje pozorny paradoks: populacja może być klonalna i zarazem heterogeniczna, a dwie cząsteczki o tej samej sekwencji mogą nie tworzyć jednego klonu, jeżeli powstały niezależnie.

Trzeba też określić rozdzielczość. „Ten sam genom” może znaczyć zgodność kilku markerów, badanego eksomu albo praktycznie całej sekwencji jądrowej. „Ta sama komórka” może znaczyć wspólne pochodzenie, podobny profil ekspresji albo ten sam typ funkcjonalny. Bez podania metody porównania słowo „identyczny” opisuje raczej oczekiwanie niż wynik pomiaru.

Warto od razu ustawić właściwe proporcje. W codziennej praktyce laboratoryjnej słowo „klonowanie” najczęściej nie dotyczy zwierząt ani ludzi, lecz DNA. Doktorantka, która mówi, że „przez tydzień klonowała”, prawie na pewno wkładała fragmenty DNA do plazmidów, a nie odtwarzała organizmy. To znaczenie techniczne jest starsze i znacznie powszechniejsze niż medialny obraz sklonowanej owcy. Dlatego naukę o klonowaniu dobrze zaczynać właśnie od cząsteczki, a nie od organizmu.

Krótka historia: skąd wzięło się klonowanie molekularne

Współczesne znaczenie słowa „klonować” w biologii molekularnej narodziło się na początku lat siedemdziesiątych XX wieku. Kluczowym momentem był rok 1973, kiedy Stanley Cohen, Annie Chang, Herbert Boyer i Robert Helling opisali, jak pojedyncze fragmenty DNA można rozmnażać w bakteriach.¹¹ Ich pomysł łączył kilka wcześniejszych odkryć w jedną powtarzalną procedurę:

1. enzym restrykcyjny przecinał DNA w ściśle określonym miejscu, zostawiając „lepkie końce”;
2. plazmid pSC101, niosący gen oporności na tetracyklinę, przecinano tym samym enzymem (EcoRI) w jednym miejscu;
3. obce DNA i otwarty plazmid, mające komplementarne końce, samoistnie łączyły się w nową kolistą cząsteczkę;
4. tak powstały rekombinowany plazmid wprowadzano do Escherichia coli, gdzie replikował się razem z komórką.

W kolejnym eksperymencie zespół przeniósł do bakterii gen żaby szponiastej Xenopus i wykazał, że można powielać DNA pochodzące z zupełnie innego królestwa życia. To był praktyczny początek inżynierii genetycznej oraz całego przemysłu biotechnologicznego.²²

Narzędzia, które to umożliwiły, były na tyle przełomowe, że w 1978 roku Werner Arber, Daniel Nathans i Hamilton Smith otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny za odkrycie enzymów restrykcyjnych i ich zastosowanie w genetyce molekularnej.¹² Enzym restrykcyjny rozpoznaje krótką, zwykle symetryczną (palindromiczną) sekwencję i przecina obie nici DNA. Dzięki temu badacz może w kontrolowany sposób wyciąć wybrany fragment i wkleić go w inne miejsce — dokładnie to leży u podstaw klasycznego klonowania molekularnego.

Dwie rzeczy warto zapamiętać z tej historii. Po pierwsze, „klonowanie” w sensie molekularnym zawsze oznaczało powielanie sekwencji, a nie tworzenie organizmu. Po drugie, cała technika opierała się od początku na precyzji: bez enzymu tnącego w powtarzalnym miejscu nie da się przewidywalnie sklejać DNA.

Nowa moc szybko wywołała pytanie o bezpieczeństwo. Już w 1975 roku część twórców tej technologii spotkała się na konferencji w Asilomar w Kalifornii, aby dobrowolnie ustalić zasady ostrożnego prowadzenia badań nad rekombinowanym DNA, zanim ich skutki będą lepiej poznane. To jeden z pierwszych przypadków, gdy środowisko naukowe samo nałożyło na siebie ograniczenia i wypracowało reguły oceny ryzyka. Warto o tym pamiętać, bo debata o granicach klonowania i inżynierii genetycznej towarzyszy tej dziedzinie od jej narodzin, a nie dopiero od czasów Dolly.

Klonowanie molekularne: kopiuje się sekwencję

W laboratorium biologii molekularnej „sklonować gen” zwykle nie znaczy stworzyć organizmu zawierającego drugi taki gen. Oznacza wyizolować wybrany fragment DNA, umieścić go w układzie zdolnym do powielania i uzyskać wiele kopii do dalszej pracy.

Klasyczny schemat wykorzystuje wektor, najczęściej plazmid:

1. wybiera się albo otrzymuje fragment DNA;
2. łączy się go z DNA wektora;
3. wprowadza się wektor do komórki gospodarza, często bakterii;
4. pojedyncza komórka daje kolonię potomną;
5. wraz z komórkami powielany jest plazmid i znajdujący się w nim insert.

Jedna płytka może zawierać wiele kolonii, a każda z nich może nieść inny wariant konstruktu. Dlatego badacz wybiera kolonie, namnaża je osobno i sprawdza insert — na przykład trawieniem enzymami restrykcyjnymi, PCR lub sekwencjonowaniem. Sam wzrost kolonii nie dowodzi jeszcze, że w wektorze znajduje się oczekiwana sekwencja bez błędów.

W tym jednym eksperymencie słowo „klon” może wskazywać trzy rzeczy:

• konkretną cząsteczkę rekombinowanego DNA;
• kolonię komórek pochodzącą od pojedynczego transformanta;
• materiał DNA wyizolowany z tej kolonii.

Podręcznik Molecular Biology of the Cell opisuje biblioteki genomowe jako zbiory kolonii, z których każda wywodzi się od jednej komórki i przechowuje określony fragment genomu.³ Cała biblioteka nie jest jednym klonem. Jest kolekcją wielu różnych klonów DNA.

Czy PCR jest klonowaniem?

PCR również tworzy ogromną liczbę kopii wskazanego fragmentu DNA. Nie wymaga jednak wektora ani żywej komórki gospodarza. Niektóre podręczniki nazywają go „bezkomórkowym klonowaniem molekularnym”, inne rezerwują słowo „klonowanie” dla zbudowania i propagowania rekombinowanego wektora.²¹

W praktyce najlepiej rozdzielać oba procesy:

• amplifikacja PCR — kopiowanie odcinka wyznaczonego przez startery;
• klonowanie do wektora — utrzymywanie wybranego fragmentu w samopowielającym się konstrukcie.

PCR może być jednym z etapów klonowania, ale nie daje wszystkich cech wektora. Plazmid można przechowywać, modyfikować, przenosić do kolejnych komórek i wykorzystać do ekspresji RNA lub białka.

Klon genomowy i klon cDNA

Fragment sklonowany bezpośrednio z genomu może zawierać eksony, introny i sekwencje regulatorowe. cDNA powstaje natomiast przez przepisanie RNA na DNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Reprezentuje więc cząsteczki RNA obecne w badanej próbce, a w przypadku dojrzałego mRNA zwykle nie zawiera intronów.

„Klon genu” nie jest przez to jednoznacznym materiałem. Zawsze trzeba zapytać o sekwencję, izoformę, organizm źródłowy, wektor i ewentualne dodatkowe znaczniki.

Rodzaje wektorów: nie każdy klon mieści się w plazmidzie

Wektor to nie tylko „plazmid”. Wybór wektora zależy głównie od tego, jak długi fragment trzeba przenieść i po co. Warto znać podstawową mapę:

• Plazmidy — najczęstsze, wygodne przy wstawkach do kilku–kilkunastu tysięcy par zasad. To domyślne narzędzie codziennej pracy.
• Wektory oparte na fagach i kosmidy — mieszczą większe fragmenty niż typowy plazmid, historycznie ważne przy budowie bibliotek genomowych.
• BAC i YAC (sztuczne chromosomy bakteryjne i drożdżowe) — utrzymują bardzo duże fragmenty, rzędu setek tysięcy par zasad. Odegrały kluczową rolę przy sekwencjonowaniu genomów, w tym ludzkiego, gdzie genom trzeba było pociąć na duże, zachodzące na siebie kawałki.
• Wektory ekspresyjne — mają dodatkowe elementy (promotor, miejsce wiązania rybosomu, znaczniki), tak aby z insertu można było uzyskać RNA lub białko, a nie tylko przechowywać sekwencję.
• Wektory wirusowe — służą do wprowadzania DNA do komórek trudnych do transformacji, w tym komórek ssaczych; wykorzystuje się je w badaniach i w terapiach genowych.

Ta różnorodność to kolejny powód, by nie mówić po prostu „mam klon tego genu”. Klon w plazmidzie ekspresyjnym, klon w BAC-u i konstrukt w wektorze wirusowym to trzy różne materiały, przydatne do różnych celów.

Jak dziś skleja się DNA: od enzymów restrykcyjnych do metod bezszwowych

Metoda Cohena i Boyera oparta na „przecięciu i sklejeniu” (cut and paste) działa do dziś, ale ma ograniczenia. Wymaga, żeby w konstruowanej sekwencji znajdowały się dogodne miejsca restrykcyjne, a każde takie miejsce zostawia po sobie kilka dodatkowych nukleotydów — „szew”. Dla prostego wklejenia jednego genu to nie przeszkadza. Dla precyzyjnego łączenia wielu fragmentów albo budowy fuzji białkowych szwy bywają kłopotliwe. Dlatego w ostatnich dekadach powstały metody, które warto znać już na początku, bo pojawiają się w niemal każdym protokole:

• Klonowanie TA i TOPO — szybkie wpięcie produktu PCR do gotowego wektora dzięki pojedynczym wystającym nukleotydom albo enzymowi topoizomerazie związanemu z wektorem. Wygodne do wstępnego „zaparkowania” fragmentu.
• Klonowanie Gateway — zamiast enzymów restrykcyjnych wykorzystuje rekombinację miejscowo-specyficzną. Fragment otoczony miejscami att jest przenoszony między wektorami w jednej reakcji, bez cięcia i ligacji.¹⁵ Ułatwia to przekładanie jednego insertu do wielu różnych konstruktów.
• Gibson Assembly — metoda izotermiczna, opracowana w 2009 roku przez zespół Daniela Gibsona w instytucie J. Craiga Ventera.¹³ Sąsiednie fragmenty mają nachodzące na siebie końce (20–40 par zasad). Mieszanina trzech enzymów — egzonukleazy, polimerazy i ligazy — w jednej probówce w temperaturze około 50 °C łączy je w jedną cząsteczkę, bez pozostawiania szwów. Pozwala składać bardzo długie konstrukty, w oryginalnej pracy nawet setki tysięcy par zasad.
• Golden Gate — wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS (np. BsaI, BsmBI), które tną poza własną sekwencją rozpoznawaną. Dzięki temu można zaprojektować unikalne, niepalindromiczne lepkie końce i w jednej reakcji poskładać wiele fragmentów w z góry ustalonej kolejności — bezszwowo.¹⁴ To podstawa modułowego składania w biologii syntetycznej.

Do tego doszła zmiana, która jeszcze bardziej odrywa „klonowanie” od organizmu źródłowego: synteza DNA na zamówienie. Dziś nie trzeba już „wyławiać” genu z próbki, żeby go mieć — można zaprojektować sekwencję na komputerze, zamówić ją jako zsyntetyzowane fragmenty i złożyć w całość metodą Gibsona lub Golden Gate. „Sklonowanie genu” coraz częściej oznacza więc jego zaprojektowanie i zbudowanie, a nie wydobycie z organizmu. To fundament biologii syntetycznej, w której klon molekularny bywa cząsteczką, która wcześniej nie istniała w żadnym żywym organizmie.

Wspólny mianownik jest istotny dla zrozumienia terminu. Wszystkie te techniki służą temu samemu celowi co plazmid pSC101 w 1973 roku: utrzymać wybraną sekwencję w cząsteczce zdolnej do powielania i dalszej pracy. Zmienia się chemia łączenia, nie sens słowa „klon”. Dlatego mówiąc „sklonowałem ten gen”, nadal trzeba doprecyzować, w jakim wektorze, z jakimi znacznikami i z jaką sekwencją, bo to od tych szczegółów zależy, czym naprawdę dysponujemy.

Jak odróżnia się właściwy klon: selekcja i przesiew

Kiedy rekombinowany plazmid trafi już do bakterii, pojawia się praktyczny problem: nie każda komórka pobierze DNA, a nie każdy plazmid będzie miał poprawny insert. Klonowanie molekularne od początku łączy więc łączenie DNA z selekcją, czyli usuwaniem komórek, których nie chcemy.

• Marker selekcyjny. Wektory niosą zwykle gen oporności na antybiotyk. Po transformacji komórki wysiewa się na podłoże z tym antybiotykiem — przeżywają tylko te, które pobrały plazmid. Już plazmid pSC101 działał na tej zasadzie, niosąc oporność na tetracyklinę.²³
• Przesiew niebiesko-biały (blue-white screening). Wiele wektorów ma w miejscu wklejenia insertu gen lacZ. Jeśli insert się wbudował, gen zostaje przerwany i kolonia pozostaje biała; jeśli plazmid zamknął się bez insertu, kolonia na podłożu z X-gal robi się niebieska. To pozwala gołym okiem odrzucić większość „pustych” wektorów, jeszcze przed sekwencjonowaniem.
• Komórki kompetentne i wydajność transformacji. Bakterie trzeba specjalnie przygotować (chemicznie albo elektroporacją), aby przyjęły DNA. Nawet wtedy transformuje się tylko drobny ułamek komórek, dlatego selekcja jest niezbędna.

Ta warstwa jest ważna dla samego pojęcia klonu komórkowego: kolonia to klon dlatego, że wyrosła z jednej komórki, a nie dlatego, że zawiera właściwą sekwencję. Selekcja i przesiew tylko zwiększają szansę, że wybrana kolonia niesie to, o co nam chodziło. Ostateczny dowód i tak daje odczyt sekwencji.

Weryfikacja powinna odpowiadać późniejszemu zastosowaniu. Krótki PCR kolonijny może potwierdzić przybliżony rozmiar insertu, lecz nie wykryje każdej substytucji, inwersji ani zmiany poza amplifikowanym odcinkiem. Odczyt Sangera z jednego startera może nie objąć całego insertu i połączeń z wektorem. Przy konstrukcie ekspresyjnym trzeba sprawdzić co najmniej oba złącza, orientację, ramkę odczytu i pełną sekwencję kodującą; przy dużym lub złożonym plazmidzie uzasadnione bywa sekwencjonowanie całej cząsteczki.

Nawet poprawny chromatogram mieszaniny hodowli nie ustanawia jednego klonu. Dwie kolonie mogą się zlać, hodowla może zostać zanieczyszczona, a wariant obecny w mniejszości może być słabo widoczny. Dlatego zachowuje się połączenie między pojedynczą kolonią, osobną hodowlą, rekordem sekwencji i zapasem zamrożonym. „Klon numer 7” jest użyteczny tylko wtedy, gdy wiadomo, z której kolonii pochodzi i jaki dokładnie materiał został zweryfikowany.

Klonowanie komórkowe: liczy się wspólne pochodzenie

Klon komórkowy to populacja potomna wyprowadzona z jednej komórki. Takie populacje wykorzystuje się między innymi do:

• wyboru komórki niosącej określoną modyfikację genomu;
• otrzymywania linii produkującej jedno przeciwciało;
• rozdzielania heterogenicznej hodowli;
• badania losów komórek podczas rozwoju;
• śledzenia klonów nowotworowych;
• sprawdzania, jakie typy potomne może wytworzyć komórka macierzysta.

Przykładem są hybrydomy. Pojedynczy klon komórek wybrany po fuzji limfocytu B z komórką zdolną do długiego namnażania może stać się źródłem jednego rodzaju przeciwciała monoklonalnego.⁴

Klonalny nie znaczy idealnie jednorodny

Pochodzenie od jednej komórki określa genealogię populacji, nie zamraża jej stanu. Podczas kolejnych podziałów mogą pojawić się:

• nowe mutacje i zmiany liczby chromosomów;
• różnice liczby kopii fragmentów genomu;
• odwracalne stany epigenetyczne;
• zróżnicowana ekspresja genów;
• selekcja komórek najszybciej rosnących w danych warunkach;
• różnice wynikające z fazy cyklu, metabolizmu i lokalnego otoczenia.

Po wielu pasażach klon może zawierać subklony. Dlatego „linia wyprowadzona z pojedynczej komórki” nie jest równoznaczna z „każda komórka jest dziś taka sama”. W produkcji biologicznej trzeba osobno wykazać klonalne pochodzenie i osobno scharakteryzować stabilność linii; analiza wariantów genomowych może być jednym z narzędzi potwierdzających wspólnego przodka.⁵

Jak wykazuje się pochodzenie od jednej komórki

Samo wysianie komórek w małym rozcieńczeniu nie dowodzi klonalności. Jeżeli w dołku statystycznie oczekuje się mniej niż jednej komórki, nadal część dodatnich dołków mogła na początku zawierać dwie lub więcej. Prawdopodobieństwo można oszacować rozkładem Poissona, lecz oszacowanie populacyjne nie jest zapisem historii konkretnego dołka.

Mocniejsze dowody tworzą łączny łańcuch:

1. udokumentowane umieszczenie jednej komórki w pustym dołku, na przykład przez sortowanie pojedynczych komórek;
2. obraz dołka bezpośrednio po zdeponowaniu, pokazujący dokładnie jedną komórkę;
3. kolejne obrazy łączące tę komórkę z jedną rosnącą kolonią, bez przerw pozwalających na migrację albo domieszkę;
4. profil genetyczny lub unikalny wariant zgodny w komórkach potomnych;
5. zapis pasaży i banków komórek, który nie gubi tożsamości materiału.

Żaden pojedynczy marker nie zastępuje genealogii. Wspólny genotyp może być częsty w linii macierzystej, a różny genotyp w części komórek może powstać dopiero po izolacji wskutek niestabilności. Dlatego pytanie „czy linia zaczęła się od jednej komórki?” należy oddzielić od pytań „czy pozostała genetycznie stabilna?”, „czy jest czysta?” i „czy każda komórka zachowuje oczekiwany fenotyp?”.

Klon a linia komórkowa

Linia komórkowa to komórki utrzymywane i pasażowane w hodowli. Może być klonalna, jeśli została wiarygodnie wyprowadzona z jednej komórki, albo poliklonalna, jeśli zaczęła się od mieszaniny komórek.

Z kolei słowo „klon” nie gwarantuje nieograniczonego wzrostu. Potomstwo pojedynczej prawidłowej komórki może po pewnej liczbie podziałów przestać proliferować. Zdolność do długotrwałego namnażania jest osobną cechą linii, nie częścią definicji klonu.

Naturalne klony: bez laboratorium

Klonowanie nie jest wynalazkiem człowieka. Rozmnażanie bezpłciowe wytwarza potomstwo bez rekombinacji genomów dwóch gamet. Rozłogi truskawki, bulwy ziemniaka, pączkowanie drożdży i podział bakterii tworzą linie o wspólnym pochodzeniu.

Nie oznacza to absolutnej identyczności. Mutacje pojawiają się także podczas rozmnażania bezpłciowego, a u mikroorganizmów materiał genetyczny może być przenoszony poziomo. Populacja klonalna może więc z czasem nabierać wewnętrznej różnorodności.

U ssaków naturalnym odpowiednikiem klonowania przez rozdzielenie zarodka są bliźnięta monozygotyczne. Powstają z jednej zygoty, która rozdziela się na dwa zarodki. Mają prawie taki sam genom, ale już podczas rozwoju mogą powstawać różnice genetyczne i epigenetyczne.⁶

Naturalne bliźnięta nie są klonami jednego z rodziców. Ich genom powstał wcześniej przez połączenie komórki jajowej i plemnika. Są klonami względem siebie w sensie wspólnego pochodzenia z tej samej zygoty. Co ciekawe, bywają też bardziej różne, niż podpowiada intuicja: mogą różnić się liczbą wczesnych mutacji, wzorem inaktywacji chromosomu X u dziewczynek, a czasem podziałem komórek między dwa zarodki są na tyle nierówne, że bliźnięta różnią się masą urodzeniową. „Identyczne” jest więc skrótem myślowym, nie dosłownym opisem.

Rekordziści i praktyczne skutki klonalności

Klony naturalne bywają spektakularne. Najczęściej przywoływanym przykładem jest Pando — kolonia topoli osikowej w stanie Utah, złożona z dziesiątek tysięcy pni połączonych wspólnym systemem korzeniowym. Całość jest jednym genetem, czyli osobnikiem genetycznym wywodzącym się z jednej zygoty; pojedynczy pień jest rametem, fizycznie rozpoznawalną jednostką powstałą wegetatywnie. Nawet tak stary genet nie jest doskonale jednorodny: analiza genomowa wykazała między rametami mozaikę mutacji somatycznych.¹⁸ To dobrze ilustruje regułę z poziomu komórkowego — wspólne pochodzenie nie zamraża genomu w czasie.

Inne organizmy rozmnażają się przez partenogenezę, czyli rozwój z niezapłodnionej komórki jajowej. Nie wolno jednak automatycznie nazywać każdego partenogenetycznego potomka genetycznym klonem matki. W apomiksji mejoza jest pominięta i przekaz genomu może być funkcjonalnie mitotyczny. W automiksji mejoza zachodzi, a diploidalność zostaje przywrócona przez podwojenie albo połączenie jej produktów; rekombinacja i segregacja mogą wtedy zmniejszać heterozygotyczność. „Bez ojca” nie musi więc znaczyć „bez nowej kombinacji alleli”.²⁰

Klonalność ma też praktyczną, gospodarczą stronę. Banany grupy Cavendish są beznasienne i rozmnażane wegetatywnie, dlatego produkcja opiera się na bardzo wąskim, powtarzanym materiale genetycznym. Ułatwia to utrzymanie cech handlowych, ale zmniejsza różnorodność, na której selekcja mogłaby oprzeć odporność. W połowie XX wieku rasa 1 patogenu wywołującego fuzariozę bananów przyczyniła się do zastąpienia odmiany Gros Michel przez Cavendish; dziś Tropical Race 4 atakuje także Cavendish. FAO podaje, że ta grupa odpowiada za około połowę światowej podaży bananów i niemal cały eksport.¹⁹ Nie każda epidemia monokultury wynika wyłącznie z klonalności, lecz brak różnorodności gospodarza zwiększa ryzyko wspólnej podatności.

Dzielenie zarodka: sztucznie wywołane bliźnięta

Wczesny zarodek po zapłodnieniu można w odpowiednim stadium rozdzielić na części zdolne do dalszego rozwoju. Jeżeli powstaną z nich osobniki, będą miały wspólne DNA jądrowe i mitochondrialne, podobnie jak bliźnięta monozygotyczne.

To klonowanie zarodkowe, ale nie SCNT:

Cecha	Dzielenie zarodka	SCNT
zapłodnienie	poprzedza podział zarodka	nie jest etapem tworzenia zrekonstruowanego oocytu
genom jądrowy	mieszanina alleli dwojga rodziców	pochodzi zasadniczo od dawcy jądra
mitochondria	pochodzą z oocytu użytego do zapłodnienia	pochodzą głównie z oocytu biorcy
relacja między osobnikami	odpowiednik bliźniąt	odpowiednik dawcy jądra urodzony później
liczba kopii	ograniczona liczbą części zdolnych do rozwoju	ograniczana dostępem do oocytów, nosicielek i bardzo niską wydajnością

National Academies klasyfikuje dzielenie zarodka jako metodę klonowania reprodukcyjnego odtwarzającą mechanizm naturalnego bliźniaczenia.⁷ Nie należy jednak mówić, że w ten sposób „sklonowano dorosłe zwierzę”: genom powstaje w chwili zapłodnienia, a wszystkie rozdzielone zarodki zaczynają rozwój w tym samym okresie.

Więcej o technicznej i biologicznej różnicy opisuje artykuł Dzielenie zarodka a SCNT.

SCNT: klonowanie genomu jądrowego organizmu

W transferze jądra komórki somatycznej usuwa się chromosomy oocytu i wprowadza jądro komórki dawcy. Następnie zrekonstruowany oocyt aktywuje się, aby rozpoczął podziały. ISSCR zaznacza w definicji transferu jądra, że oocyt przeprogramowuje jądro zwykle niekompletnie, a większość powstałych zarodków rozwija się nieprawidłowo.⁸

SCNT kopiuje przede wszystkim genom jądrowy dawcy. Nie tworzy kopii całej komórki ani kompletnego stanu organizmu:

• mitochondrialne DNA pochodzi głównie od dawczyni oocytu;
• część cytoplazmy i jej cząsteczek pochodzi z oocytu;
• wzory epigenetyczne mają zostać przebudowane, ale proces bywa niepełny;
• ciąża zachodzi w innym organizmie i środowisku;
• w rozwoju pojawiają się nowe mutacje oraz zdarzenia losowe.

Z tego powodu klon SCNT nie jest materialnie identyczną kopią dawcy. Ma bardzo podobny genom jądrowy, lecz inną historię komórkową i rozwojową. Dokładniej omawia to artykuł Genom to nie cały organizm.

Skalę trudności dobrze pokazuje sama Dolly. Zespół z Roslin Institute w Szkocji, kierowany przez Iana Wilmuta i Keitha Campbella, wprowadził jądra z komórek gruczołu mlekowego do pozbawionych chromosomów oocytów. W serii z komórkami dorosłej dawczyni uzyskano 277 zrekonstruowanych oocytów, 29 rozwijających się zarodków przeniesiono do nosicielek, a żywe jagnię urodziło się tylko jedno — Dolly, w lipcu 1996 roku.¹⁶ Wynik „jeden na 277” opisuje wydajność wobec rekonstrukcji; „jeden na 29” — wobec przeniesionych zarodków. Podawanie samego procentu bez mianownika zaciera etap, na którym następowały straty.

Reprodukcyjne i „terapeutyczne”: wspólny początek, inny cel

Określenia „klonowanie reprodukcyjne” i „klonowanie terapeutyczne” nie opisują dwóch różnych sposobów przeniesienia jądra. Do stadium blastocysty droga może być podobna. Różni się to, co dzieje się dalej:

• w klonowaniu reprodukcyjnym zarodek ma zostać przeniesiony do macicy i rozwinąć się do urodzenia;
• w zastosowaniu badawczym z blastocysty wyprowadza się linię embrionalnych komórek macierzystych, bez rozpoczynania ciąży.

Nazwa „terapeutyczne” może mylić, ponieważ samo uzyskanie linii nie jest terapią. Trafniejsze bywają określenia SCNT do wyprowadzania komórek macierzystych, transfer jądra do celów badawczych albo klonowanie badawcze.

Nie jest to wyłącznie koncepcja teoretyczna. W 2013 roku opisano ludzkie linie embrionalnych komórek macierzystych wyprowadzone po SCNT; ich genom jądrowy pochodził od komórek somatycznych, natomiast mitochondrialny od oocytów.⁹ To osiągnięcie nie było sklonowaniem człowieka, ponieważ celem i produktem były linie komórkowe, a nie ciąża i urodzenie.

Klon organizmu nie jest kopią wszystkich cech

W klonowaniu reprodukcyjnym produktem ma być żywy organizm o genomie jądrowym odpowiadającym dawcy. „Odpowiadającym” jest lepszym słowem niż „identycznym”, bo nawet pewna sekwencja dawcy nie pozostaje niezmienna w każdej komórce przez cały rozwój.

Genotyp wyznacza zakres możliwości, ale fenotyp powstaje w interakcji genomu z regulacją genów i środowiskiem. Najczęściej przywoływanym dowodem jest Cc (od CopyCat), pierwsza sklonowana metodą SCNT kotka, którą przedstawiono na Texas A&M University w 2001 roku. Jej dawczyni, kotka Rainbow, była trójbarwną (calico) kotką o łatach czarnych, rudych i białych. Cc urodziła się natomiast jako kotka bura pręgowana z bielą — bez rudych łat, mimo praktycznie identycznego jądrowego DNA.^10,17

Mechanizm tej różnicy jest pouczający. Gen barwy rudej u kotów leży na chromosomie X. U samic jeden z dwóch chromosomów X zostaje wyciszony, a klony komórek zachowujące różny aktywny chromosom tworzą mozaikę rudych i nierudych obszarów. Dokładnego układu granic nie zapisuje sama sekwencja genomu. Artykuł opisujący Cc podkreślał wprost, że wzór umaszczenia kocięcia nie był kopią wzoru dawczyni; nie ustanawiał natomiast prostego dowodu, że przyczyną całego fenotypu było zachowanie konkretnego nieaktywnego X z pojedynczej komórki dawcy.²⁴ Bezpieczny wniosek brzmi: wspólne allele barwy nie wyznaczają identycznej mozaiki rozwojowej.

Nie należy więc oczekiwać, że sklonowane zwierzę:

• będzie miało identyczny układ plam, linii papilarnych lub połączeń nerwowych;
• zachowa wspomnienia dawcy;
• rozwinie tę samą osobowość;
• zachoruje w tym samym wieku;
• osiągnie identyczny wynik produkcyjny lub sportowy.

Klonowanie utrwala pewną kombinację alleli. Nie odtwarza przebiegu rozwoju i życia. To praktyczny powód, dla którego komercyjne „odtwarzanie” ukochanego zwierzęcia z definicji nie może przywrócić tego samego pupila — daje jedynie genetycznego bliźniaka urodzonego później.

Co nie jest klonowaniem

Granice terminu stają się czytelniejsze po zestawieniu go z procesami pokrewnymi.

Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie odczytuje kolejność nukleotydów. Przygotowanie próbki może obejmować amplifikację, ale sam wynik jest informacją o sekwencji, nie nowym klonem organizmu lub komórki.

Edycja genomu

CRISPR zmienia wybrane miejsca DNA; sama modyfikacja nie jest klonowaniem. Po edycji często izoluje się jednak pojedynczą komórkę i namnaża jej potomstwo. Powstała populacja jest klonem genealogicznym komórki założycielskiej, choć celowo różni się od linii rodzicielskiej. To dobry przykład, dlaczego „klonalny” nie może być synonimem „identyczny z materiałem wyjściowym”.

iPSC

Wytworzenie iPSC jest przeprogramowaniem stanu dojrzałej komórki do pluripotencji, a nie tworzeniem organizmu. Jeżeli pojedynczą iPSC wyizoluje się i namnoży, powstaje klon komórkowy. Te dwa etapy należy nazywać osobno.

Chimera

Chimera zawiera komórki pochodzące z co najmniej dwóch zygot albo innych źródeł komórkowych. Nie jest jednym klonem na poziomie całego organizmu, ale jeden z tworzących ją składników może być populacją klonalną. Chimeryzm opisuje skład komórkowy; klonalność — genealogię wskazanej części. Te pojęcia nie są prostymi przeciwieństwami.

Organizm zastępczy wymarłego gatunku

Edycja żyjącego krewnego tak, aby miał wybrane cechy wymarłego gatunku, tworzy organizm typu proxy. Nie jest klonowaniem wymarłego osobnika, jeśli nie używa się zachowanego jądra albo genomu tego osobnika. Dokładniej rozróżnia to artykuł Co wymarłego można próbować odtworzyć.

Jak nazywać wynik bez nieporozumień

Przy każdym użyciu słowa „klon” warto uzupełnić pięć pól:

Pytanie	Przykładowa odpowiedź
Co jest jednostką?	fragment DNA, komórka, zarodek, zwierzę
Jaki jest wspólny przodek lub wzorzec?	cząsteczka matrycowa, pojedyncza komórka, zygota, dawca jądra
Jak wykonano kopiowanie?	PCR, wektor, namnażanie komórki, podział zarodka, SCNT
Co ma być wspólne?	sekwencja insertu, pochodzenie linii, genom jądrowy
Co może się różnić?	mutacje, mitochondria, epigenom, środowisko, fenotyp

Zamiast pisać „uzyskano klon”, lepiej napisać:

• „fragment cDNA sklonowano do wektora ekspresyjnego”;
• „linię wyprowadzono z pojedynczej komórki i potwierdzono jej klonalne pochodzenie”;
• „zarodek rozdzielono na dwa zarodki bliźniacze”;
• „cielę uzyskano przez SCNT z jądra fibroblastu dawcy”;
• „z blastocysty po SCNT wyprowadzono linię embrionalnych komórek macierzystych”.

Każde z tych zdań wskazuje inny produkt, inny eksperyment i inny rodzaj dowodu.

Ćwiczenie: rozłóż zdanie na czynniki

Umiejętność, która realnie się przydaje przy czytaniu publikacji i doniesień prasowych, to szybkie rozłożenie zdania z „klonem” na pięć pól. Dwa przykłady.

Zdanie z laboratorium molekularnego: „Sklonowaliśmy ludzki gen TP53 do wektora ekspresyjnego pcDNA3.1 i potwierdziliśmy sekwencję”. Rozbiór: jednostką jest fragment DNA (cDNA genu TP53); wspólnym wzorcem — sekwencja tego genu; mechanizmem — wpięcie do plazmidu; wspólne ma być dokładnie DNA insertu; różnić się nie powinno nic, dlatego zdanie kończy się słowem „potwierdziliśmy sekwencję”. To rutyna, nie sensacja.

Zdanie z nagłówka prasowego: „Naukowcy sklonowali małpy”. Tu jednostką jest organizm, mechanizmem najpewniej SCNT, a wspólny jest genom jądrowy dawcy — nie mitochondria, nie środowisko rozwoju. Pierwsze makaki uzyskane metodą transferu jądra komórki somatycznej (Zhong Zhong i Hua Hua, 2018) były właśnie takim wynikiem: dwa osobniki o niemal identycznym jądrowym DNA, powstałe z wielu prób. To ważny wynik techniczny, ale nie „skopiowanie” konkretnej małpy z całą jej historią. Więcej o tej drodze — od myszy po naczelne — jest w artykule Od myszy do makaków.

Oba zdania używają tego samego czasownika. Dopiero pięć pól pokazuje, że opisują zupełnie różne eksperymenty i różny ciężar dowodowy.

Najważniejsza definicja robocza

Na potrzeby dalszych artykułów przyjmujemy:

Klonowanie to wytwarzanie cząsteczek, komórek lub organizmów o wspólnym pochodzeniu genetycznym przez kopiowanie bez nowego połączenia genomów dwóch gamet; oczekiwany stopień podobieństwa zależy od skali i metody.

Definicja celowo nie obiecuje absolutnej identyczności. Pozwala objąć klon DNA, klon komórkowy, bliźnięta zarodkowe i organizm po SCNT, a jednocześnie zmusza do podania skali.

Następnym krokiem jest Genom to nie cały organizm. Tam różnice między sekwencją jądrową, mitochondrialnym DNA, epigenomem i fenotypem zostaną rozłożone dokładniej. Czytelnik zainteresowany samą techniką może przejść bezpośrednio do SCNT krok po kroku.