Biodruk 3D

Streszczenie

Biodruk 3D wykorzystuje sterowany cyfrowo proces do przestrzennego rozmieszczania żywych komórek, biomateriałów i cząsteczek biologicznych. Pozwala zadać geometrię startową: położenie warstw, przedziałów, gradientów albo kanałów. Nie drukuje jednak automatycznie dojrzałości, homeostazy, naczyń włosowatych ani funkcji narządu.

Rezultat powstaje w łańcuchu zależności. Obraz medyczny trzeba poprawnie posegmentować, model zamienić na wykonalną ścieżkę, materiał przygotować bez sedymentacji komórek, proces utrzymać w zwalidowanym oknie, a wydrukowany konstrukt hodować do czasu przebudowy. Błąd na każdym etapie przechodzi dalej. Idealny plik CAD może dać niedokładny wydruk, a dokładny wydruk — biologicznie niewłaściwą tkankę.

Najpierw uporządkujmy nazwy

Nie każdy wydruk związany z medycyną jest biodrukiem. Warto rozróżnić:

• druk 3D wyrobu medycznego — na przykład implantu tytanowego lub prowadnicy bez żywych komórek;
• druk rusztowania — materiał jest wykonywany addytywnie, a komórki dodaje się później;
• biodruk — proces przestrzennie rozmieszcza komórki lub inne składniki biologiczne;
• bioassembly — zorganizowane moduły biologiczne, na przykład sferoidy, łączy się w większy konstrukt;
• druk in situ — materiał lub komórki są odkładane bezpośrednio w ubytku;
• model anatomiczny — odwzorowuje kształt, lecz nie musi być żywą tkanką.

Te kategorie mogą się łączyć. Sztywny, wydrukowany szkielet PCL może zostać wypełniony bioatramentem. Nie należy jednak nazywać samej protezy lub plastikowego modelu „wydrukowanym narządem”.

Co druk potrafi kontrolować

Proces może kontrolować:

• makroskopowy kształt konstruktu;
• przebieg kanałów i granice przedziałów;
• kolejność materiałów oraz typów komórek;
• lokalną gęstość w granicach możliwości urządzenia;
• orientację włókien lub filamentu;
• gradienty składu;
• miejsca późniejszego perfundowania lub mechanicznego podparcia.

Po wydruku komórki migrują, dzielą się, umierają, kurczą materiał i wytwarzają ECM. Hydrożel pęcznieje albo degraduje się. Geometria zapisana przez drukarkę jest więc warunkiem początkowym, a nie zamrożoną anatomią.

Od obrazu do ścieżki maszyny

W projektowaniu pacjentoswoistym łańcuch może wyglądać tak:

1. obrazowanie, na przykład CT lub MRI;
2. segmentacja interesującej tkanki;
3. rekonstrukcja powierzchni i naprawa siatki;
4. uproszczenie albo dodanie struktur niewidocznych w obrazie;
5. podział na materiały i przedziały;
6. slicing, czyli zamiana modelu na warstwy;
7. generowanie ścieżki, prędkości i parametrów odkładania;
8. symulacja albo kontrola kolizji;
9. wykonanie i porównanie produktu z projektem.

Segmentacja jest interpretacją, nie mechanicznym przepisaniem pikseli. Granica narządu może zależeć od kontrastu, algorytmu i operatora. Kapilary są poniżej rozdzielczości typowego obrazowania klinicznego, więc nie można ich po prostu „skopiować z tomografii”.

Rozdzielczość ma co najmniej trzy znaczenia

Rozdzielczość danych określa, jak mały szczegół zawiera obraz lub model. Rozdzielczość procesu opisuje najmniejszy powtarzalnie wykonany element. Rozdzielczość biologiczna mówi, czy powstała właściwa organizacja komórek oraz ECM.

Model z wokselem 20 µm nie gwarantuje filamentu 20 µm. Filament 20 µm nie gwarantuje naczynia włosowatego. Komórki mają własne wymiary, a żywa tkanka musi utworzyć światło, błonę podstawną, połączenia i przepływ.

Dokładność, precyzja i wierność kształtu

Dokładność mówi, jak blisko wyniku znajduje się wartość docelowa. Precyzja — jak blisko siebie są kolejne wyniki. Wierność kształtu obejmuje zachowanie całej geometrii po wykonaniu i w czasie.

Drukarka może powtarzalnie wykonywać filament o średnicy 450 µm, choć projekt zakłada 300 µm: jest precyzyjna, lecz niedokładna. Konstrukt może być dokładny po minucie, a po dobie pęcznieć lub kurczyć się. Dlatego wymiary należy mierzyć w kilku punktach czasu.

Ekstruzja: ciągły filament

W biodruku ekstruzyjnym tłok, śruba albo ciśnienie pneumatyczne wypycha materiał przez dyszę. Metoda obsługuje szeroki zakres lepkości i wysokie gęstości komórek, pozwala zmieniać kartridże oraz drukować wiele materiałów.

Jakość zależy od:

• średnicy, długości i geometrii dyszy;
• ciśnienia lub prędkości tłoka;
• prędkości ruchu głowicy;
• odległości od podłoża;
• temperatury dyszy, stołu i materiału;
• reologii oraz czasu od przygotowania;
• gęstości komórek, agregatów i cząstek;
• sposobu sieciowania po wyjściu.

Strumień może pulsować, pękać, puchnąć po wyjściu z dyszy albo tworzyć krople zamiast filamentu.

Ścinanie nie jest jedną liczbą

Komórki w dyszy doświadczają rozkładu naprężeń. Obciążenie zależy od przepływu, geometrii zwężenia, lepkości zależnej od ścinania, położenia komórki i kontaktu ze ścianą. Mała dysza nie zawsze zabija więcej komórek, jeśli zmieniono materiał i prędkość, ale zwykle zawęża okno procesu.

Przeżycie tuż po druku nie wystarcza. Subletalne uszkodzenie może zmienić cytoszkielet, metabolizm, różnicowanie i późniejszą funkcję. Trzeba badać odpowiedź bezpośrednią oraz po okresie regeneracji.

Druk kroplowy

W metodach inkjet lub drop-on-demand małe porcje płynu są wyrzucane termicznie, piezoelektrycznie albo akustycznie. Zaletami są szybkość, kontrola kropli i niewielkie zużycie materiału. Ograniczenia to węższy zakres lepkości, ryzyko zatkania, sedymentacja komórek i zmienność liczby komórek w kropli.

Kropla nie jest automatycznie pojedynczą komórką. Przy losowym rozkładzie część kropli nie zawiera żadnej komórki, część jedną, a część kilka. Rozmieszczenie trzeba zmierzyć, nie wyprowadzać z nominalnego stężenia.

Transfer laserowy

W laser-assisted bioprinting impuls lasera działa na warstwę absorbującą i wyrzuca porcję materiału z podłoża donorowego na powierzchnię odbiorczą. Brak dyszy zmniejsza ryzyko zatkania i pozwala pracować z bardziej gęstymi zawiesinami.

Układ jest jednak złożony: energia impulsu, grubość warstw, lepkość, odległość, wielkość kropli i przygotowanie podłoża wpływają na wynik. Wysoka rozdzielczość położenia nie rozwiązuje automatycznie problemu budowy grubej, perfundowanej tkanki.

Fotopolimeryzacja warstwowa

W stereolitografii i systemach DLP światło utwardza fotoczuły prekursor punktowo lub jako cały wzór warstwy. Metody nie wymagają przepychania komórek przez wąską dyszę i mogą szybko tworzyć złożone geometrie.

Ich ograniczenia obejmują:

• rozpraszanie i pochłanianie światła;
• głębokość utwardzania;
• dyfuzję rodników;
• fotoinicjator i niezwiązane grupy;
• hamowanie przez tlen;
• nagrzewanie;
• różnice między dawką na powierzchni i w głębi;
• wymywanie nieutwardzonego prekursora.

Piksel projektora nie jest rozmiarem rzeczywistego woksela chemicznego. Reakcja może wyjść poza oświetlony obszar albo nie dojść do końca w jego środku.

Druk objętościowy

W technikach objętościowych wzory światła z wielu kierunków tworzą trójwymiarowy rozkład dawki i utwardzają obiekt bez klasycznego budowania każdej warstwy. Skraca to czas i może ograniczyć długą ekspozycję komórek na proces.

Szybkość nie usuwa problemów z optyką, rozmiarem obiektu, rozpraszaniem przez komórki, chemią inicjacji, minimalną dawką i usunięciem nieutwardzonego materiału. „Wydruk w kilka sekund” opisuje etap formowania, nie czas uzyskania dojrzałej tkanki.

Bioatrament, tusz materiałowy i kąpiel podporowa

Bioatrament zawiera komórki lub inne aktywne składniki biologiczne. Biomateriałowy tusz może być drukowany bez komórek i zasiedlany później. Materiał podporowy stabilizuje miękki wydruk, a tusz ofiarny tworzy wzór przeznaczony do usunięcia.

Nazwy nie mówią, co pozostanie w produkcie końcowym. Materiał podporowy może zostawić resztki, tusz ofiarny wymaga drogi wypłukania, a komórki mogą migrować między przedziałami. Bilans wszystkich komponentów jest częścią kontroli.

Drukowalność jest wynikiem procesu

Nie wystarczy powiedzieć, że formulacja jest „drukowalna”. Dla ekstruzji warto mierzyć:

• początek stabilnego wypływu;
• zależność przepływu od ciśnienia;
• ciągłość i średnicę filamentu;
• odtwarzanie kątów, rozpiętości i skrzyżowań;
• zgodność porów z projektem;
• zdolność piętrzenia warstw;
• odbudowę po ścinaniu;
• stabilność po sieciowaniu i inkubacji;
• przeżycie oraz funkcję komórek.

Współczesne propozycje ujednolicenia pojęcia łączą reologię, ekstrudowalność, geometrię, wierność i biologię, ponieważ dobry wynik jednej osi może ukrywać porażkę innej.¹

Gęstość komórek zmienia atrament

Komórki nie są biernym barwnikiem. Zwiększają udział fazy rozproszonej, zmieniają lepkość, tworzą agregaty i mogą blokować dyszę. W kartridżu sedymentują lub unoszą się zależnie od gęstości materiału. Pierwszy i ostatni centymetr wydruku mogą mieć inny skład.

Kontrola powinna obejmować:

• stężenie przed i po druku;
• rozkład wielkości agregatów;
• jednorodność w wysokości kartridża;
• czas przebywania przed wykonaniem;
• temperaturę i mieszanie;
• udział komórek pozostających w kartridżu i przewodach.

Nominalne 10⁷ komórek/ml nie dowodzi, że każda część konstruktu otrzymała tę gęstość.

Sieciowanie musi dogonić geometrię

Materiał ma płynąć podczas odkładania, a następnie utrzymać położenie. Można użyć:

• sieciowania natychmiastowego;
• sieciowania po całej warstwie;
• dwóch etapów: słabego przed drukiem i mocniejszego po nim;
• zmiany temperatury;
• dyfuzji jonów;
• reakcji enzymatycznej;
• fotoutwardzania;
• podparcia zewnętrzną kąpielą.

Zbyt szybka reakcja zatyka dyszę lub tworzy granice między filamentami. Zbyt wolna prowadzi do rozpływania i sedymentacji. Niejednorodna dawka tworzy strefy o innej mechanice i degradacji.

FRESH: drukowanie miękkiego materiału w podporze

W metodzie FRESH dysza porusza się w kąpieli z mikrodrobin żelatyny zachowującej się jak materiał z granicą płynięcia. Kąpiel ustępuje lokalnie przed dyszą i odbudowuje się za nią, podpierając miękki filament. Po wydruku można ją stopić i usunąć.

W 2019 roku z użyciem FRESH drukowano kolagenowe elementy serca, w tym struktury anatomiczne i małe komory zawierające kardiomiocyty. Autorzy pokazali geometrię, przewodzenie oraz skurcz ścian, lecz nie kliniczne serce pompujące fizjologiczny rzut przez długi czas.²

Kształt serca to nie funkcja serca

Pełnowymiarowy model anatomiczny może być pustym rusztowaniem albo demonstracją możliwości ścieżki druku. Z kolei milimetrowy fragment może zawierać aktywne komórki, ale nie mieć komór, zastawek i krążenia.

Przy haśle „wydrukowano serce” trzeba ustalić:

1. rozmiar;
2. obecność i typ komórek;
3. gęstość komórkową;
4. perfundowalność;
5. ciśnienie oraz przepływ;
6. czas pracy;
7. porównanie z natywnym sercem;
8. czy konstrukt podtrzymywał życie zwierzęcia.

Kanał ofiarny nie jest jeszcze naczyniem

Tusz ofiarny można wydrukować w materiale, zalać otoczenie, a następnie usunąć wzór i uzyskać pusty kanał. Kolesky i współautorzy wykorzystali tę strategię do tworzenia heterogenicznych konstruktów z perfundowanymi kanałami.³

Kanał umożliwia przepływ, lecz funkcjonalne naczynie wymaga ciągłego śródbłonka, bariery, błony podstawnej, stabilizacji przez komórki podporowe, reakcji na ścinanie i połączenia z mikrokrążeniem. Milimetrowe przewody nie zastępują hierarchii tętnica–tętniczka–kapilara–żyłka.

SWIFT: drukowanie w gęstej żywej matrycy

W strategii SWIFT gęsto upakowane agregaty lub organoidy tworzą żywą, plastyczną matrycę. W jej wnętrzu zapisuje się tuszem ofiarnym kanały, które następnie opróżnia i perfunduje. W demonstracji z 2019 roku powstały gęste tkanki z rozgałęzionymi kanałami, a model sercowy kurczył się synchronicznie przez okres badania.⁴

To odwraca typowy problem: zamiast drukować każdą komórkę, organizuje się gotowe bloki biologiczne i dodaje drogi transportu. Nadal trzeba połączyć kanały z mikrokrążeniem, zapewnić dojrzałość, mechaniczną integralność i długą pracę.

Druk wielomateriałowy tworzy interfejsy

Tkanki zawierają granice: chrząstka–kość, śródbłonek–miąższ, ścięgno–kość. Wielomateriałowy druk może tworzyć gradienty lub sąsiadujące strefy. Każda granica jest jednak potencjalnym miejscem:

• rozwarstwienia;
• różnego pęcznienia;
• koncentracji naprężeń;
• niedokładnego nakładania;
• mieszania komórek;
• różnego tempa degradacji.

Wierność interfejsu trzeba badać po hodowli i obciążeniu, nie tylko na barwnym zdjęciu bezpośrednio po drukowaniu.

Współrzędne nie gwarantują tożsamości komórki

Drukarka może umieścić komórkę w planowanym obszarze, ale jej los zależy od sygnałów, sąsiadów, transportu i mechaniki. Komórki pochodzące z iPSC mogą być niedojrzałe, a długi proces druku utrzymywać część z nich poza inkubatorem.

Projekt powinien określać:

• maksymalny czas procesu;
• medium i temperaturę w kartridżu;
• kolejność materiałów;
• kontrole tożsamości przed i po druku;
• niepożądane populacje;
• wpływ gęstości oraz hipoksji na różnicowanie.

Przestrzenna precyzja nie zastępuje różnicowania kierowanego.

Po wydruku zaczyna się inżynieria tkanki

Konstrukt musi:

1. odzyskać po procesie;
2. ustabilizować połączenia między filamentami;
3. umożliwić transport do rdzenia;
4. utworzyć połączenia komórka–komórka;
5. przebudować materiał i wytworzyć ECM;
6. dojrzeć metabolicznie, mechanicznie i elektrycznie;
7. zintegrować przedziały;
8. utrzymać funkcję pod obciążeniem.

Bioreaktor może dostarczać przepływ, rozciąganie, ucisk, stymulację elektryczną i kontrolę gazów. Czas dojrzewania jest częścią procesu wytwarzania, a nie oczekiwaniem po „gotowym wydruku”.

Kurczenie i przebudowa nie są wyłącznie błędem

Komórki napinają materiał, zmieniają orientację i zagęszczają ECM. Konstrukt może odejść od CAD, ale zyskać funkcjonalną organizację. W innym przypadku skurcz zamknie kanały albo zdeformuje implant.

Należy z góry określić, które zmiany są pożądanym dojrzewaniem, a które wadą. Wymiary po wydruku, po sieciowaniu, po hodowli i pod obciążeniem tworzą historię produktu.

„4D bioprinting” nie oznacza dodatkowego wymiaru przestrzeni

Określenie 4D zwykle opisuje zaprogramowaną zmianę w czasie: składanie, pęcznienie, degradację, zmianę kształtu albo przebudowę przez komórki. Czas jest istotny w każdym żywym konstrukcie, więc etykieta sama nie dowodzi nowej funkcji.

Warto pytać o bodziec, odwracalność, liczbę cykli, dokładność zmiany i jej znaczenie biologiczne.

Sześć poziomów kontroli jakości

Poziom	Co trzeba kontrolować
projekt	źródło danych, segmentację, wersję pliku, tolerancje
wsad	materiał, komórki, gęstość, agregaty, czas i temperatura
proces	ciśnienie, przepływ, prędkość, dawkę światła, środowisko
wydruk	filament, pory, kanały, położenie i przeżycie
dojrzewanie	geometria w czasie, transport, ECM, tożsamość i sterylność
funkcja	punkt końcowy właściwy dla tkanki pod realistycznym obciążeniem

Zwolnienie partii tylko na podstawie wyglądu i żywotności bezpośredniej omija większość łańcucha.

Krytyczne cechy i krytyczne parametry procesu

CQA (critical quality attribute) to cecha produktu powiązana z bezpieczeństwem lub działaniem, na przykład drożność kanału albo potencja tkanki. CPP (critical process parameter) to parametr procesu wpływający na CQA, na przykład ciśnienie ekstruzji lub dawka światła.

Dobre opracowanie procesu tworzy relację:

CPP → stan materiału i komórek → CQA → funkcja.

Samo zapisanie ustawień drukarki nie dowodzi, że kontrolują one wynik. Potrzebne są eksperymenty w zakresie roboczym i granicach.

Powtarzalność urządzenia nie wystarcza

Ta sama drukarka może dać inne wyniki przez:

• partię polimeru lub dECM;
• średnicę rzeczywistą dyszy;
• kalibrację osi i ciśnienia;
• temperaturę pomieszczenia;
• czas od mieszania;
• operatora;
• sedymentację komórek;
• różny poziom napełnienia kartridża;
• położenie konstruktu na stole lub w objętości optycznej.

Partia biologiczna powinna obejmować niezależne przygotowania komórek i materiału, nie tylko kilka obiektów wydrukowanych z jednego kartridża.

Sterylność jest szczególnie trudna

Żywego konstruktu nie można końcowo wysterylizować promieniowaniem albo parą. Proces wymaga kontrolowanych surowców, zamkniętych lub odpowiednio chronionych etapów, monitorowania środowiska i testów, które nie zużyją całego produktu.

FDA wskazuje właśnie brak możliwości sterylizacji końcowej, interakcję komórek ze scaffoldem, produkty degradacji, migrację komórek i zmianę funkcji w czasie jako problemy oceny produktów tkankowo-inżynieryjnych.⁵

Wydruk badawczy i produkt leczniczy to dwa różne zadania

Model in vitro może być mały, wykonywany ręcznie i używany przez kilka tygodni. Produkt implantowany musi być powtarzalny, transportowalny, zgodny z zabiegiem, jałowy, stabilny oraz bezpieczny po długim czasie. Pacjentoswość utrudnia klasyczne pobieranie wielu próbek destrukcyjnych.

Trzeba z góry zdecydować, czy celem jest:

• model choroby;
• test toksyczności lub leku;
• implant bez komórek;
• materiał rekrutujący komórki gospodarza;
• produkt z żywymi komórkami;
• tymczasowa tkanka wspomagająca;
• narząd zastępujący funkcję.

Każdy cel ma inny ciężar dowodu.

Co jest realne obecnie

Biodruk jest wartościowym narzędziem do tworzenia modeli wątroby, nowotworów, skóry, chrząstki, mięśnia i naczyń, zwłaszcza gdy pytanie wymaga kontrolowanej geometrii lub wielu typów komórek. Badania na zwierzętach pokazują naprawę prostszych ubytków i dojrzewanie konstruktów.

Istnieją zarejestrowane wczesne badania kliniczne dotyczące wybranych biodrukowanych konstrukcji, ale rejestracja protokołu nie jest wynikiem skuteczności ani dopuszczeniem produktu. Nie ma rutynowo przeszczepianych, biodrukowanych pełnych serc, nerek lub płuc. Drukowane bezkomórkowe implanty medyczne są znacznie dojrzalszą, odrębną kategorią; FDA podkreśla, że podlegają wymaganiom właściwym dla konkretnego wyrobu i wskazania, nie specjalnemu „zwolnieniu dla druku 3D”.⁶

Kanały i kapilary wyznaczają granicę skali

Duży konstrukt potrzebuje hierarchicznej sieci: kanałów doprowadzających, mikrokrążenia blisko komórek i odpływu. Druk może wykonać większe przewody. Najdrobniejsze sieci często muszą powstać przez samoorganizację śródbłonka i połączyć się z kanałami oraz gospodarzem.

To problem topologii, bariery, przepływu i biologii jednocześnie. Samo zmniejszanie dyszy nie wystarczy. Szczegóły rozwija artykuł Unaczynienie i perfuzja.

Jak czytać doniesienie o biodruku

Przy ocenie publikacji lub komunikatu warto zapytać:

1. co faktycznie drukowano: komórki, materiał czy model bezkomórkowy;
2. jaka była skala i geometria;
3. jak zdefiniowano rozdzielczość;
4. ile niezależnych partii wykonano;
5. czy pokazano cały rozkład komórek;
6. czy kanały były drożne i pokryte śródbłonkiem;
7. jak długo hodowano konstrukt;
8. jaki test funkcji wykonano;
9. jak wynik wypadał wobec tkanki natywnej;
10. czy zastosowano przepływ lub obciążenie;
11. czy implantowano konstrukt i na jak długo;
12. czy rezultat podtrzymywał funkcję organizmu.

Kompetencje potrzebne w pracy z biodrukiem

Biodruk jest dziedziną zespołową. Chemik polimerów rozumie reakcję i reologię, biolog — komórki oraz fenotyp, inżynier — przepływ, automatykę i tolerancje, specjalista obrazowania — segmentację, a osoba od jakości — identyfikowalność i walidację.

Dla osoby przechodzącej z fizyki lub chemii szczególnie użyteczne są:

• mechanika płynów i reologia;
• transport masy;
• fotochemia i kinetyka reakcji;
• CAD, przetwarzanie obrazu i analiza błędów;
• projektowanie eksperymentu;
• statystyka hierarchiczna;
• podstawy biologii komórki, ECM i hodowli aseptycznej;
• rozumienie CQA, CPP i porównywalności.

Największą wartość daje umiejętność przełożenia ustawienia maszyny na stan komórki i mierzalną funkcję tkanki.

Co z tego wynika

Biodruk nie jest urządzeniem produkującym narządy po naciśnięciu „start”. Jest metodą nadawania przestrzennego warunku początkowego. Jego przewaga pojawia się wtedy, gdy geometria jest krytyczna dla hipotezy lub funkcji i gdy potrafimy zmierzyć, jak projekt przechodzi przez materiał, proces oraz dojrzewanie.

Najsilniejszy wynik łączy cyfrową identyfikowalność, kontrolę wsadu, monitorowanie procesu, przestrzenną ocenę wydruku i test funkcji po realistycznym czasie oraz obciążeniu. Kształt narządu może być imponującym demonstratorem. Tkanką staje się dopiero konstrukt, który utrzymuje właściwe komórki, transport, architekturę i funkcję.