Mikroskop konfokalny: pinhole, voxel i dawka obrazowania

Streszczenie

Mikroskop konfokalny laserowy buduje obraz punkt po punkcie. Laser wzbudza mały obszar próbki, a pinhole przed detektorem odrzuca dużą część światła spoza płaszczyzny ogniskowania. Dzięki temu można wykonywać optical sections i stosy z w grubszych preparatach.

Konfokalność nie jest bezpłatnym „wyostrzeniem”. Mniejszy pinhole daje cieńszą sekcję, ale przepuszcza mniej fotonów. Dłuższy pixel dwell time poprawia zliczanie, ale zwiększa czas i dawkę. Większy laser power rozjaśnia obraz, ale przyspiesza photobleaching i phototoxicity. Wyższy detector gain rozjaśnia wartości, lecz nie odzyskuje informacji, której nie zarejestrowano.

Metoda musi ustalić razem:

• obiektyw, medium i głębokość;
• laser power przy próbce;
• pinhole w Airy units;
• zakres emisji i tryb kanałów;
• pixel size oraz z-step;
• scan speed, dwell time i averaging;
• detector gain/offset;
• dopuszczalną saturację;
• dawkę i kolejność skanowania;
• PSF, rejestrację kanałów i kryteria QC.

Na czym polega konfokalność

W idealnym układzie punkt wzbudzenia w próbce jest optycznie sprzężony z aperturą detekcyjną. Pinhole znajduje się w płaszczyźnie konfokalnej. Światło ze zogniskowanego punktu przechodzi przez niego łatwiej niż rozmyta emisja z obszarów powyżej i poniżej.

Wynikiem jest:

• lepszy contrast w grubej próbce;
• cieńsza optical section;
• możliwość lokalizacji struktur w z;
• ograniczenie, ale nie całkowite usunięcie, out-of-focus fluorescence.

Konfokalny nie widzi nieskończenie cienkiej warstwy. Każdy punkt ma trójwymiarową point spread function, a sekcja ma skończoną grubość zależną od długości fali, NA, pinhole, aberracji i współczynnika załamania.

Laser scanning confocal microscope

W klasycznym CLSM wiązka przechodzi przez:

1. laser;
2. modulator mocy;
3. lustra skanujące;
4. dichroic;
5. obiektyw;
6. próbkę.

Emisja wraca przez obiektyw, jest oddzielana spektralnie, przechodzi przez pinhole i trafia do PMT, GaAsP lub innego detektora punktowego. Położenie skanera określa, któremu pikselowi przypisać sygnał.

Obraz 1024×1024 nie powstaje jednocześnie. Jest sekwencją ponad miliona pomiarów, dlatego ruch próbki, drift, pulsacja źródła i bleaching mogą tworzyć wzory przestrzenne.

Pinhole i Airy unit

Wielkość pinhole jest często podawana w Airy units. Jedna Airy unit odpowiada w przybliżeniu średnicy centralnego dysku obrazu punktu dla danego toru optycznego. Fizyczna średnica zależy od długości fali, NA i powiększenia w torze.

Około 1 AU

Ustawienie około 1 AU bywa kompromisem:

• przepuszcza dużą część centralnego sygnału;
• zapewnia optical sectioning;
• zachowuje praktyczny signal-to-noise.

Nie jest jednak uniwersalną regułą. Dla bardzo słabej próbki można otworzyć pinhole, akceptując grubszą sekcję. Dla szczególnego pytania przestrzennego można go zmniejszyć, ale wtedy spadek sygnału może wymusić większą dawkę.

Wspólny pinhole dla kanałów

Jeśli software utrzymuje stałe 1 AU względem różnych długości fali, fizyczna apertura może zmieniać się między kanałami. Jeśli utrzymuje stałą średnicę, liczba AU się zmienia. Dla porównania struktur wielobarwnych trzeba wiedzieć, który parametr był stały.

Zmiana pinhole między próbkami zmienia objętość pomiarową. Integrated intensity z dwóch różnych sekcji nie jest bezpośrednio porównywalne.

Optical section nie jest skrawkiem fizycznym

Sygnał w pojedynczej płaszczyźnie pochodzi z rozkładu ważonego PSF. Obiekt położony nieco poza focus nadal wnosi fotony. Dwa sąsiednie obrazy z nie są niezależnymi warstwami preparatu.

Znaczenie ma też grubość biologiczna:

• jądro przecięte bliżej środka ma większy przekrój;
• punctum może pojawić się w kilku płaszczyznach;
• powierzchnia organoidu jest jaśniejsza niż środek z powodu penetracji;
• przeciwciało może nie przeniknąć całej próbki;
• clearing i mounting zmieniają rozmiar.

Rekonstrukcja 3D nie usuwa tych ograniczeń.

Voxel: geometria danych

Piksel ma rozmiar x/y, a krok stosu określa sampling w z. Razem tworzą voxel.

Pixel size

Rozmiar piksela wynika z pola skanu, zoom i liczby pikseli. Digital zoom zmniejsza pole, lecz nie zwiększa fizycznej NA. Może poprawić sampling do Nyquista, ale po jego osiągnięciu tworzy głównie większy plik i większą dawkę.

Z-step

z-step powinien odpowiadać osiowej rozdzielczości oraz celowi:

• zbyt duży pomija struktury;
• zbyt mały wielokrotnie naświetla podobną objętość;
• zwiększa czas, bleaching i plik;
• tworzy pozór szczegółowości bez nowej informacji.

Nyquist wymaga próbkowania gęstszego niż granica rozdzielczości, ale dokładny krok zależy od wavelength, NA, refractive index i pinhole. Kalkulator jest punktem startu; zmierzona PSF sprawdza realny system.

Voxel izotropowy

Voxel o równych wymiarach w x, y i z jest wygodny do wizualizacji, lecz rzadko konieczny i może wymusić nadmierne skanowanie osiowe. Rozdzielczość osiowa zwykle jest gorsza od bocznej, nawet gdy voxel jest sześcianem.

Obiektyw, immersja i głębokość

Wysoka NA zwiększa zbieranie fotonów i rozdzielczość. Nie eliminuje aberracji.

Refractive-index mismatch

Jeżeli medium immersyjne, coverslip, mounting medium i próbka mają różne współczynniki:

• PSF rozszerza się z głębokością;
• sygnał spada;
• położenie z jest zniekształcone;
• kuliste obiekty stają się wydłużone;
• kanały mogą przesuwać się odmiennie.

Obiektyw olejowy o NA 1,4 może być znakomity blisko coverslip, ale w wodnym organoidzie głębokość obrazowania może ograniczać mismatch. Obiektyw wodny o mniejszej NA może dać lepszy obraz głębiej.

Correction collar

Pierścień korekcyjny kompensuje różnice grubości szkła lub temperatury w określonym zakresie. Ustawienie „na oko” nie zapewnia optimum. Można maksymalizować symetrię PSF albo contrast wzorca, zapisując położenie.

Parametry skanowania

Pixel dwell time

Dwell time to czas pomiaru jednego piksela. Dłuższy daje więcej fotonów, lecz:

• wydłuża frame time;
• zwiększa dawkę;
• nasila bleaching;
• zwiększa ryzyko ruchu w obrębie obrazu.

Scan speed

Wysoka prędkość skraca ekspozycję per pixel i może zwiększać względny noise. Niska prędkość nie zawsze poprawia dane, jeśli próbka zmienia się podczas skanu.

Line i frame averaging

Averaging redukuje nieskorelowany noise, ale wielokrotnie wzbudza próbkę. 4× averaging nie jest darmowym filtrem. W żywych komórkach cztery szybkie skany mogą mierzyć cztery różne stany.

Accumulation lub summing może zachowywać inną skalę niż averaging. Tryb trzeba zapisać.

Kierunek skanu

Unidirectional scanning jest zwykle łatwiejszy do wyrównania. Bidirectional przyspiesza, ale wymaga korekcji fazy między liniami. Błędna kalibracja tworzy ząbkowane krawędzie i podwójne punkty.

Detektor, gain i offset

PMT przekształca fotony w impulsy elektronowe. GaAsP może mieć wyższą quantum efficiency w wybranym zakresie. HyD i inne detektory mają własne charakterystyki.

Gain

Zwiększenie gain wzmacnia sygnał i noise. Może pomóc wykorzystać zakres cyfrowy, jeśli sygnał jest powyżej noise floor, ale nie zwiększa liczby wykrytych fotonów.

Offset

Zbyt wysoki black level obcina słabe wartości do zera. Takiego clippingu nie da się odwrócić. Tło powinno pozostać mierzalne, a potem być korygowane według zdefiniowanej metody.

Saturation

Nasycenie może wystąpić w jasnym jądrze, choć średnia całego pola wygląda bezpiecznie. Look-up table dla overrange należy sprawdzać w najjaśniejszych płaszczyznach i warunkach.

Photon counting

W trybie photon counting wynik ma inne właściwości niż analog intensity. Przy dużej częstości impulsy mogą nakładać się, powodując nonlinearity. Zakres liczenia musi być wyznaczony dla detektora i dwell time.

Laser power: procent nie jest mocą

Wartość 2% oznacza ustawienie modulatora, nie irradiance w próbce. Relacja może być nieliniowa, zależna od linii lasera i zmieniać się w czasie.

Program kontroli powinien mierzyć:

• power versus setting;
• stabilność krótkoterminową;
• stabilność podczas rozgrzewania;
• trend długoterminowy;
• moc dla każdej linii;
• stan po serwisie.

ISO 21073 definiuje zestaw wielkości wydajności laserowego konfokala do obrazowania biologicznego, między innymi rozdzielczość, optical sectioning, uniformity, co-registration i stabilność mocy¹.

Kanały: sekwencyjnie czy równocześnie

Równoczesna akwizycja

Jest szybsza i lepiej rejestruje dynamiczne zdarzenia, ale zwiększa ryzyko:

• cross-excitation;
• bleed-through;
• nakładania pasm detekcji;
• mieszania sygnałów w detektorach.

Sekwencyjna

Można skanować kanały line-by-line, frame-by-frame albo stack-by-stack. Ogranicza crosstalk, ale:

• przesuwa czas między kanałami;
• może pogorszyć co-localization ruchomych struktur;
• zmienia bleaching;
• wydłuża serię.

Single-color controls są konieczne do wyboru okien i trybu. Unmixing spektralny wymaga referencyjnych widm w odpowiadającym środowisku.

Preparat do konfokala

Coverslip i mounting medium

Trzeba kontrolować:

• grubość szkła;
• współczynnik medium;
• utwardzanie;
• kurczenie;
• pęcherzyki;
• orientację;
• stabilność fluoroforu.

Zbyt gruba warstwa medium przesuwa próbkę poza working distance. Środek przeciw blaknięciu może zmieniać refractive index i dojrzewać przez kilka godzin.

Penetracja barwienia

Jasny pierścień na powierzchni tkanki może oznaczać słabą penetrację, nie biologiczną lokalizację. Kontrola obejmuje:

• serię głębokości;
• czas inkubacji;
• stężenie;
• permeabilizację;
• rozmiar sondy;
• cleared versus uncleared;
• przekrój fizyczny jako porównanie.

Żywe komórki

Komora powinna kontrolować temperaturę próbki, CO₂, wilgotność i parowanie. Odczyt kontrolera nie jest temperaturą w studzience. Po włożeniu płytki trzeba dopuścić stabilizację bez niekontrolowanego photobleaching podczas ustawiania.

Dawka i czas

Całkowita ekspozycja rośnie z:

• laser power;
• dwell time;
• liczbą pikseli;
• liczbą płaszczyzn;
• averaging;
• liczbą kanałów;
• częstością time-lapse;
• powtarzaniem focus;
• nieudanymi preview.

Optymalizacja powinna zaczynać się od minimalnej informacji potrzebnej do measurand. Jeśli pytanie dotyczy translokacji jądrowej, pełny stos 3D co 20 sekund może być niepotrzebny.

Test bleaching

Wykonuje się planowaną sekwencję na stabilnej próbce i mierzy sygnał w tych samych obiektach. Spadek trzeba oddzielić od drift, ruchu i focus. Dopuszczalny limit zależy od tego, czy wynik jest intensywnością, lokalizacją czy samą obecnością.

Test phototoxicity

Porównuje się obrazowane i nieobrazowane pola lub próbki przy tym samym czasie poza inkubatorem. Endpoint powinien być wrażliwy na funkcję: podział, ruch, morfologię, mitochondrial state lub marker stresu. Brak propidium iodide tuż po skanie to za mało.

PSF jako stan całego toru

Fluorescencyjne kulki mniejsze niż przewidywana rozdzielczość obrazowane w z pozwalają zmierzyć:

• FWHM x/y/z;
• symetrię;
• sidelobes;
• pochylenie;
• aberrację z głębokością;
• różnicę kanałów.

PSF trzeba mierzyć przy właściwym obiektywie, immersji, pinhole i sampling. Zbyt duży z-step lub piksel fałszuje sam test. Śledzenie FWHM oraz kształtu PSF w czasie ujawnia pogorszenie systemu².

Kulka na coverslip nie odtwarza całej aberracji w tkance. Do trudnych metod warto dodać wzorzec 3D lub kulki osadzone w medium o odpowiadającym współczynniku.

Optical sectioning strength

Sama FWHM punktu nie opisuje zdolności odrzucania tła. Test cienkiej warstwy fluorescencyjnej albo odpowiedniego wzorca mierzy, jak sygnał zanika przy przesunięciu focus.

Wynik zależy od:

• pinhole;
• wavelength;
• NA;
• alignment;
• aberracji;
• detektora;
• noise.

Ma sens tylko razem z konfiguracją i kryterium zastosowania.

Uniformity i scan field

Pole konfokala może być nierówne z powodu optyki skanera, vignetting, lasera i detekcji. Jednorodna fluorescencyjna warstwa służy do:

• flatness;
• centering;
• usable field;
• pasów skanowania;
• cieni z kurzu;
• stabilności między liniami.

Nie należy automatycznie stosować flat-field z widefield do konfokala. Tor i mechanizm skanowania są inne.

Co-registration kanałów

Wielokolorowe beads mierzą przesunięcie x/y/z. Test należy wykonywać:

• w środku i przy krawędziach pola;
• dla używanych obiektywów;
• po zmianie dichroików;
• po serwisie;
• przy representative zoom.

Korekcja wyznaczona na powierzchni może nie kompensować głębokościowej aberracji chromatycznej w próbce.

Obraz ilościowy

Przewodnik ilościowej mikroskopii konfokalnej podkreśla wspólną optymalizację próbki, konfiguracji, sampling, photobleaching, cross-talk i analizy³.

Stałe ustawienia

Jeżeli porównywana jest intensywność:

• laser power;
• pinhole;
• gain;
• offset;
• dwell time;
• averaging;
• zoom;
• obiektyw;
• zakres emisji

powinny pozostać stałe w serii. Wyjątek wymaga fizycznej kalibracji i wykazania liniowości przeliczenia.

Tło

Background można mierzyć w obszarze bez obiektu, próbce ujemnej lub przez model. W grubej próbce tło zmienia się z głębokością, więc jedna stała dla całego stosu może być błędna.

Normalizacja głębokości

Prosta korekcja „na spadek sygnału” może usunąć prawdziwy gradient biologiczny. Potrzebny jest wzorzec, internal reference albo eksperyment oddzielający attenuation od biologii.

Projekcja

Maximum intensity projection jest wizualizacją. Traci informację z, faworyzuje jasne voxele i zwiększa prawdopodobieństwo znalezienia ekstremum wraz z liczbą płaszczyzn. Nie powinna zastępować analizy 3D bez uzasadnienia.

Deconvolution

Deconvolution używa modelu PSF do przypisania rozproszonego sygnału. Może poprawić contrast i lokalizację, ale:

• zależy od PSF;
• wymaga ustawień;
• może tworzyć ringing;
• zmienia intensywność;
• nie odzyskuje informacji całkowicie utraconej.

Surowe dane trzeba zachować, a algorytm oraz iteracje zwalidować.

Time-lapse i dynamika

W skanowanym obrazie lewy górny i prawy dolny piksel nie są z tego samego momentu. Dla szybkiego procesu może powstać spatial distortion.

Trzeba raportować:

• frame time;
• czas całego stosu;
• odstęp od początku do początku;
• kolejność kanałów i płaszczyzn;
• dropped frames;
• czas autofocus;
• rzeczywistą, nie zadaną, częstotliwość.

Z-stack może być rejestrowany od dołu do góry albo naprzemiennie. Kierunek wpływa na czas przypisany do struktury i bleaching.

Spinning disk

Spinning-disk confocal używa wielu pinholes równocześnie i kamery. Jest szybszy oraz często łagodniejszy dla żywych komórek, ale ma inne ograniczenia:

• pinholes i ich spacing są stałe;
• przy grubej, jasnej próbce występuje pinhole crosstalk;
• uniformity zależy od dysku i oświetlenia;
• kamera wnosi swoje noise i saturację;
• optical sectioning może być słabsze głęboko.

QC nie można przenieść mechanicznie z point-scanning CLSM. Nadal potrzebne są PSF, flatness, rejestracja, power i camera characterization.

IQ, OQ i PQ

IQ

Obejmuje:

• statyw, skaner i detektory;
• linie laserowe;
• obiektywy, filtry i dichroics;
• pinhole oraz napęd;
• stolik i focus;
• komorę środowiskową;
• software, wersje i licencje;
• zasilanie, chłodzenie i archiwizację.

OQ

Sprawdza:

• laser power i stability;
• linearity versus setting;
• detector range;
• noise i saturation;
• pinhole centering;
• PSF i optical sectioning;
• flatness i scan field;
• chromatic co-registration;
• pixel calibration;
• stage repeatability i drift;
• bidirectional phase;
• timing.

PQ

Używa reprezentatywnych metod:

• najgrubszej próbki;
• najsłabszego kanału;
• najjaśniejszego kanału;
• najdłuższego stack/time-lapse;
• live-cell environment;
• analizy 3D;
• różnych operatorów i dni.

Standard ISO obejmuje single-point, single-photon confocal, więc spinning disk, multiphoton i super-resolution wymagają dodatkowych testów zamiast automatycznego przypisania zgodności.

Program kontroli jakości

Przed serią

• status laserów;
• rozgrzanie;
• czystość obiektywu;
• właściwa immersja;
• wzorzec intensywności;
• brak saturacji;
• stan komory;
• kontrola pinhole i detektora;
• aktualny status PSF.

Okresowo

• moc i stabilność każdej linii;
• power-setting linearity;
• detector linearity;
• dark/background;
• PSF;
• optical sectioning;
• flatness;
• co-registration;
• stage/focus drift;
• timing;
• temperatura w próbce.

Wyniki powinny tworzyć wykres kontrolny. Limit nie musi być specyfikacją producenta; ma zabezpieczać zastosowanie.

Walidacja metody

Macierz powinna obejmować:

• biologiczny zakres sygnału;
• kilka głębokości;
• słabe i silne znakowanie;
• dni i operatorów;
• różne partie odczynników;
• dolny i górny zakres detektora;
• zmianę focus oraz pinhole;
• tolerancję na bleaching;
• błąd segmentacji 3D;
• powtarzalność liczby i objętości obiektów;
• wpływ deconvolution.

Niepewność wyniku może mieć składowe: preparation, field selection, instrument, shot noise, segmentation, background i biological variation. Większa liczba voxeli nie zastępuje niezależnych próbek biologicznych.

Minimalne metadane

• próbka, utrwalanie i mounting;
• fluorofory, partie i kontrole;
• statyw, skaner i detektor;
• obiektyw, NA, immersja i collar;
• linia oraz power;
• excitation/dichroic/emission range;
• pinhole w AU i µm, jeśli dostępne;
• pixel size, frame size i zoom;
• z-step, zakres i kierunek;
• dwell time, scan speed i averaging;
• gain, offset, bit depth i tryb;
• kolejność kanałów;
• warunki żywych komórek;
• PSF/QC status;
• korekcje i deconvolution;
• pliki surowe i wersja analizy.

Najczęstsze błędy

„Pinhole na minimum da najlepszy obraz”

Może odrzucić tyle fotonów, że noise i wymagana dawka zniszczą korzyść z cieńszej sekcji.

„Gain naprawił słaby kanał”

Zmienił wzmocnienie, nie liczbę wykrytych fotonów ani swoistość.

„Stos 3D dowodzi kontaktu”

Dwie struktury w tych samych voxelach mogą pozostawać oddzielone poniżej rozdzielczości lub nakładać się przez PSF.

„MIP pokazuje całą objętość”

Pokazuje najjaśniejsze wartości wzdłuż osi projekcji, nie zachowując objętości ani głębokości.

„Te same procenty lasera oznaczają te same warunki”

Nie bez pomiaru mocy, stabilności i zgodności toru.

Checklista przed akwizycją

• Czy konfokalny jest potrzebny zamiast widefield?
• Czy obiektyw i immersja pasują do głębokości?
• Czy PSF oraz co-registration są w limicie?
• Czy pinhole odpowiada pytaniu?
• Czy pixel size i z-step spełniają potrzebny sampling?
• Czy controls wykrywają crosstalk?
• Czy najjaśniejszy voxel nie jest nasycony?
• Czy najsłabszy sygnał przewyższa tło?
• Czy planowana dawka przeszła test?
• Czy czas całego stack pasuje do dynamiki?
• Czy zasada wyboru pól jest ustalona?
• Czy surowe dane i metadane zostaną zachowane?

Checklista po akwizycji

• Czy laser, pinhole i detektor były stałe?
• Czy nie wystąpił drift x/y/z?
• Czy bleaching nie przekroczył limitu?
• Czy histogram zawiera clipping?
• Czy głębokościowy spadek ma kontrolę?
• Czy kanały są zarejestrowane?
• Czy segmentacja 3D działa na skrajnych próbkach?
• Czy projekcja nie zastąpiła pomiaru?
• Czy deconvolution ma zachowane parametry?
• Czy wynik ma jednostkę, mianownik i niepewność?

Najkrótsza zasada

Konfokalność odrzuca część światła spoza ostrości, ale wynik nadal jest kompromisem między pinhole, fotonami, sampling, czasem i dawką. Ostrzejszy obraz nie jest automatycznie dokładniejszym pomiarem.