Jak czyta się epigenom

Streszczenie

Epigenom nie jest drugim genomem ani pojedynczą warstwą znaków „nad DNA”. To zbiorcza nazwa stanów regulacyjnych mierzonych w określonych komórkach, warunkach i czasie: modyfikacji zasad DNA, dostępności chromatyny, położenia nukleosomów i białek, organizacji przestrzennej oraz związanej z nimi aktywności genów. Każda metoda rejestruje inny fizyczny ślad. Wiarygodny wniosek powstaje dopiero po połączeniu właściwych kontroli, rozdzielczości komórkowej i eksperymentu przyczynowego.

Najważniejsze warstwy pomiaru epigenomu. Konwersja lub natywny sygnał informują o modyfikacji zasad, ATAC-seq o dostępności, metody oparte na przeciwciałach o białkach i histonach, a Hi-C o częstości kontaktów przestrzennych.

Epigenom jest stanem próbki, nie stałym dopiskiem do sekwencji

Dwie komórki mogą mieć niemal ten sam genom, a wykonywać różne zadania, ponieważ korzystają z innych zestawów genów. Różnice podtrzymują sieci czynników transkrypcyjnych, stan chromatyny, modyfikacje DNA i histonów, położenie w tkance oraz sygnały środowiskowe. Część tych stanów utrzymuje się przez podziały, część zmienia się w ciągu minut lub godzin.

Dlatego zdanie „odczytaliśmy epigenom” jest skrótem. Trzeba dodać: jaką cechę zmierzono, w jakich komórkach, o której porze, po jakim bodźcu, z jaką rozdzielczością i względem jakiej kontroli. Przegląd metod w podręczniku genetyki medycznej może być mapą pojęć, ale nie zastępuje aktualnego protokołu ani walidacji konkretnego testu.¹

Najważniejsze osie pomiaru to:

chemiczne modyfikacje zasad DNA, przede wszystkim 5-metylocytozyna;
dostępność DNA dla enzymu użytego w teście;
położenie nukleosomów, modyfikacji histonów i związanych białek;
częstość kontaktów między regionami chromatyny;
RNA i białka, które pokazują skutek działania sieci regulacyjnej.

Żaden z tych sygnałów sam nie dowodzi mechanizmu. Otwarty enhancer nie musi aktywować najbliższego genu, znacznik histonowy nie jest przełącznikiem o jednym znaczeniu, a korelacja metylacji z ekspresją nie ustala kierunku przyczyny.

Najtrudniejsza zmienna często nazywa się „próbka”

Epigenom jest silnie zależny od typu i stanu komórki. Tkanka pobrana w całości jest mieszaniną komórek zrębu, naczyń, układu odpornościowego i właściwego miąższu. Jeśli po leczeniu rośnie udział jednego typu, pomiar zbiorczy może wyglądać jak przeprogramowanie każdej komórki, choć zmieniła się głównie proporcja populacji.

Znaczenie mają również:

niedokrwienie i czas od pobrania do utrwalenia;
trawienie enzymatyczne tkanki i stres dysocjacji;
zamrażanie, rozmrażanie oraz metoda izolacji jąder;
wiek, płeć, rytm dobowy, stan zapalny i leki dawcy;
gęstość hodowli, skład podłoża, tlen, macierz i numer pasażu;
partia odczynników oraz osoba wykonująca procedurę.

Przed analizą danych trzeba więc zaprojektować porównywalne pobranie, randomizację partii i metadane. Bardziej wyrafinowany algorytm nie odtworzy informacji, której nie zapisano przy próbce.

Stan epigenomiczny ma współrzędne czasu i przestrzeni

„Epigenom hepatocytu” nie jest pojedynczym obiektem. Hepatocyt przy żyle centralnej, po posiłku, w stanie zapalnym i po niedokrwieniu może mieć inny stan niż komórka tego samego typu w innej strefie lub chwili.

Metadane powinny obejmować:

dokładną tkankę i region;
czas pobrania;
stan fizjologiczny;
sposób utrwalenia;
czas do zamrożenia;
sposób izolacji komórek lub jąder;
pasaż i gęstość hodowli;
podłoże oraz macierz;
ekspozycję na lek;
płeć chromosomalną i wiek.

Bez tego wynik jest trudny do porównania z atlasem i do odtworzenia.

Replikatem nie jest pik

Miliony fragmentów z jednej próbki nie tworzą milionów biologicznych powtórzeń. Jednostką niezależną jest dawca, klon albo osobna hodowla — zależnie od przypisania warunku.

Piki ATAC lub ChIP są cechami mierzonymi u replikatów. Komórki single-cell są zagnieżdżone w dawcy. Analiza differential accessibility lub methylation powinna respektować tę hierarchię.

Zmiana składu i zmiana stanu

Bulk może wykazać wzrost H3K27ac w regionie, ponieważ:

każda komórka zwiększyła acetylację;
przybyło komórek, które już miały ten znacznik;
jedna rzadka populacja silnie się aktywowała;
zmieniła się jakość ekstrakcji;
tło przeciwciała było inne.

Rozdzielenie wymaga sortowania, single-cell, dekonwolucji albo niezależnego pomiaru proporcji.

Rozdzielczość biologiczna i techniczna

Metoda może raportować wynik:

per zasada;
per CpG;
per fragment;
per peak;
per region;
per bin;
per komórka;
per typ komórki;
per haplotyp.

Wyższa rozdzielczość współrzędnych nie zawsze oznacza większą pewność biologiczną. Pojedynczy CpG z dwoma reads jest precyzyjnie zlokalizowany, ale słabo oszacowany.

Pokrycie jest lokalne

Średnia głębokość nie mówi, ile danych ma konkretny enhancer. W epigenomice coverage zależy od:

liczby miejsc cięcia;
GC;
mapowalności;
copy number;
stanu chromatyny;
wzbogacenia przez przeciwciało;
selekcji fragmentów;
duplikatów.

Raport powinien pokazywać rozkład i regiony niewidoczne, a nie tylko średnią.

Mapowalność i allele

Powtórzenia, segmental duplications i polimorfizmy utrudniają jednoznaczne mapowanie. Odrzucenie multi-mapping reads może systematycznie usunąć transpozony i duplikacje, choć właśnie one są częścią regulacji.

Allele różniące się od referencji mogą mapować gorzej, tworząc reference bias. Analiza allelospecyficzna wymaga:

spersonalizowanej lub wariantowej referencji;
kontroli mapping bias;
wystarczającej liczby heterozygot;
fazy;
niezależnych cząsteczek.

Kontrole powinny odpowiadać reakcji

Nie ma jednej „kontroli epigenomu”. Trzeba sprawdzić etap, który tworzy sygnał.

Przykłady:

spike-in o znanym stanie metylacji;
unmethylated DNA do konwersji;
input chromatin w ChIP;
IgG lub no-antibody control;
kontrola pozytywnego locus;
naked DNA dla biasu Tn5;
restriction digest QC w Hi-C;
technical blank;
genotype fingerprint;
orthogonal assay.

Kontrola dodana po krytycznym etapie nie testuje wcześniejszej utraty.

Spike-in nie jest magicznym normalizatorem

Obcy materiał o znanej ilości może monitorować wydajność i pozwalać na skalowanie globalnej zmiany. Musi jednak przejść przez odpowiednie etapy w podobny sposób.

Jeśli spike-in dodano po immunoprecypitacji, nie kontroluje wydajności wiązania przeciwciała. Jeśli ma zupełnie inną chromatynę, może nie zachowywać się jak próbka.

Metylacja DNA: co zmienia konwersja

W klasycznym sekwencjonowaniu bisulfitowym niezmetylowana cytozyna zostaje przekształcona tak, że po amplifikacji jest odczytywana jak tymina, natomiast 5-metylocytozyna pozostaje odczytana jako cytozyna. Udział C i T w danej pozycji pozwala oszacować stan populacji cząsteczek. Można badać cały genom, wybrane regiony albo reprezentację wzbogaconą w miejsca CpG.

Ta metoda ma trzy ważne ograniczenia. Po pierwsze, konwersja jest agresywna i degraduje część DNA. Po drugie, odczyt po konwersji ma mniejszą złożoność sekwencji, co utrudnia mapowanie. Po trzecie, standardowy bisulfit nie rozróżnia 5-metylocytozyny od 5-hydroksymetylocytozyny: obie mogą wyglądać jak „ochroniona C”. To rozróżnienie wymaga dodatkowej chemii, reakcji enzymatycznych lub innego rodzaju sygnału; porównania metod pokazują, że nieuwzględnienie 5hmC może zmienić interpretację szczególnie w tkankach, w których jest jej dużo.²

Alternatywy enzymatyczne ograniczają degradację, a niektóre technologie długich odczytów wnioskują modyfikacje bez konwersji z natywnego sygnału cząsteczki. „Bezpośrednio” nie znaczy jednak „bez modelu”: klasyfikator musi być wytrenowany i skalibrowany dla danej modyfikacji, kontekstu sekwencji oraz warunków pomiaru.

WGBS, RRBS i target odpowiadają na inne pytania

WGBS próbuje objąć cały genom po konwersji. Jest kosztowny, bo wiele reads trafia poza CpG islands i elementy o bieżącym zainteresowaniu.

RRBS używa cięcia i selekcji rozmiaru, aby wzbogacić regiony bogate w CpG. Daje głębszy pomiar części genomu, ale nie jest losową próbą wszystkich miejsc.

Targeted bisulfite sequencing mierzy wybrane regiony i może osiągać dużą głębokość. Projekt starterów po konwersji jest trudny, a selekcja celu nie pozwala odkrywać zmian poza panelem.

Porównanie metod wymaga wspólnego zbioru callable CpG. Wyższa korelacja globalna może ukrywać różnice w regionach dostępnych tylko jednej platformie.

Konwersja niepełna i nadmierna

Niepełna konwersja niezmetylowanej C wygląda jak fałszywa metylacja. Zbyt agresywna reakcja degraduje DNA i może prowadzić do selektywnej utraty fragmentów.

Kontrole oceniają:

conversion rate;
ochronę methylated control;
insert size;
duplication;
strand bias;
mapping;
pokrycie CpG;
bisulfite non-conversion.

5mC i 5hmC nie są tym samym stanem

TET utlenia 5mC do 5hmC i dalszych pochodnych w szlaku demetylacji. 5hmC jest szczególnie istotna w neuronach i rozwoju. Standardowy bisulfit grupuje 5mC i 5hmC jako „C”.

Rozdzielenie może używać:

oxidative bisulfite;
TAB-seq;
chemii enzymatycznej;
natywnego sygnału długich reads;
metod wzbogaceniowych.

Każda ma inny limit detekcji i zapotrzebowanie na materiał.

DMR jest wynikiem modelu

Differentially methylated region łączy sąsiednie miejsca zgodnie z:

minimalną liczbą CpG;
odległością;
pokryciem;
wielkością efektu;
modelem wariancji;
korektą wielokrotnego testowania.

Duża różnica w jednym słabo pokrytym CpG nie jest równoważna spójnej zmianie w dziesięciu miejscach u wszystkich dawców.

Raport powinien podawać:

bezwzględną różnicę metylacji;
przedział niepewności;
liczbę replikatów;
coverage;
kierunek per próbka;
powiązanie z typem komórki.

Procent metylacji nie mówi, które komórki go utworzyły

Wynik 40% w miejscu CpG może powstać na wiele sposobów: przez pełną metylację w 40% komórek, metylację jednego allelu w większości komórek, mieszaninę typów komórek, mozaikę cząsteczek lub niepełną konwersję. Pomiar zbiorczy nie rozstrzyga tych scenariuszy.

Do kontroli potrzebne są między innymi DNA o znanym stanie metylacji, ocena wydajności konwersji, kontrola duplikatów, równomierności pokrycia i zanieczyszczenia. Analiza allelospecyficzna wymaga heterozygotycznych wariantów pozwalających przypisać odczyty do alleli. W badaniach imprintingu trzeba dodatkowo ustalić pochodzenie rodzicielskie; samo „50%” nie dowodzi prawidłowego piętna.

Dostępność chromatyny: gdzie enzym mógł wejść

ATAC-seq wykorzystuje transpozazę Tn5, która tnie dostępne DNA i jednocześnie dołącza adaptery. Powstaje biblioteka wzbogacona w regiony łatwo osiągalne dla enzymu. Rozkład długości fragmentów może ujawniać DNA nieosłonięte oraz fragmenty chronione przez jeden lub kilka nukleosomów. Pierwotna metoda umożliwiła szybkie profilowanie dostępności z małej liczby komórek.³

Sygnał ATAC-seq nie jest bezpośrednim pomiarem „aktywności genu”. Otwarty region może być aktywnym promotorem, przygotowanym enhancerem, izolatorem albo miejscem dostępnym tylko w części komórek. Obecność motywu rozpoznawanego przez czynnik transkrypcyjny mówi, że sekwencja może go wiązać, nie że białko było tam obecne.

Na wynik wpływają jakość jąder, nadmierne lub zbyt słabe trawienie, DNA mitochondrialne, martwe komórki i preferencje sekwencyjne Tn5. Typowe kontrole jakości obejmują liczbę unikalnych fragmentów, wzbogacenie przy miejscach startu transkrypcji, rozkład rozmiarów i odtwarzalność pików między powtórzeniami. Wartość pojedynczego „piku” zależy od tła oraz modelu statystycznego.

Fragmenty zawierają informację o nukleosomach

ATAC tworzy:

krótkie fragmenty z regionów nucleosome-free;
fragmenty około mononukleosomowe;
di- i oligonukleosomowe;
mitochondrialne fragmenty.

Okresowy rozkład długości jest znakiem jakości, ale zależy od typu i protokołu. Brak wyraźnych pików nie zawsze dyskwalifikuje próbkę, a ich obecność nie gwarantuje reprezentatywności.

TSS enrichment jest wskaźnikiem, nie endpointem

Agregacja sygnału wokół startów transkrypcji pokazuje, czy biblioteka wzbogaca typowo dostępne promotory względem tła. Wysoki TSS enrichment nie dowodzi dobrych enhancerów ani pełnej reprezentacji populacji.

Powinien być czytany z:

liczbą unikalnych fragmentów;
FRiP;
duplication;
mitochondrial fraction;
insert size;
odtwarzalnością pików;
fingerprintem próbki.

Peak calling zależy od tła

Peak caller porównuje lokalną liczbę fragmentów z oczekiwanym tłem. Wynik zależy od:

głębokości;
blacklist regions;
duplikatów;
długości fragmentów;
shift/extension;
szerokości okna;
progu FDR;
łączenia replikatów.

Consensus peak set powinien być zbudowany tak, by nie faworyzować jednego warunku. Test differential accessibility używa zliczeń w wspólnych regionach i replikatów biologicznych.

Footprinting jest pośrednim śladem

Czynnik związany z DNA może chronić motyw przed cięciem, tworząc obniżenie sygnału otoczone dostępnością. Ale Tn5 ma bias sekwencyjny, a nukleosomy i inne białka wpływają na wzór.

Footprint sugeruje occupancy, nie identyfikuje sam białka. Motyw może być wspólny dla rodziny czynników.

Białka i histony: przeciwciało jest częścią pomiaru

ChIP-seq wzbogaca fragmenty chromatyny związane z określonym białkiem lub modyfikacją histonu. Po związaniu przeciwciała kompleks jest izolowany, a DNA sekwencjonowane. Metoda może badać wąskie miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego albo szerokie domeny znacznika histonowego. Te dwa typy sygnału wymagają innego modelowania.

Najważniejszym odczynnikiem jest przeciwciało. Powinno rozpoznawać właściwy epitop w warunkach eksperymentu, a nie tylko dawać pasmo w innym teście. Potrzebne są odpowiednie kontrole wejścia, tła i swoistości, biologiczne powtórzenia oraz jawne kryteria zgodności. H3K4me3 często wzbogaca się przy aktywnych promotorach, H3K27ac przy aktywnych elementach regulatorowych, a H3K27me3 w domenach represji, lecz znaczniki opisują stan skojarzony z regulacją — nie są samodzielnym dowodem przyczynowym.

CUT&RUN i CUT&Tag kierują enzym tnący lub transpozazę do miejsca wskazanego przez przeciwciało w jądrze. Mogą wymagać mniej materiału i dawać niższe tło niż klasyczny ChIP, ale nadal zależą od jakości przeciwciała, dostępności epitopu, warunków permeabilizacji i kontroli. Oryginalna praca CUT&Tag pokazała mapowanie białek chromatynowych in situ z małej liczby komórek.⁴

Crosslinking zmienia dostęp do epitopu

ChIP może używać chromatyny crosslinked albo native. Utrwalenie stabilizuje pośrednie kompleksy, ale może maskować epitop i zwiększać tło. Native ChIP dobrze działa dla niektórych histonów, lecz nie dla każdego czynnika.

Sonikacja lub trawienie określa rozdzielczość fragmentów. Peak o szerokości 300 bp nie oznacza, że białko dotyka całego regionu.

Narrow i broad marks

Czynnik transkrypcyjny często tworzy wąskie piki. H3K27me3 lub H3K9me3 może tworzyć rozległe domeny. Ten sam algorytm i próg nie powinien być używany bez dostosowania.

Kontrola obejmuje:

fragment size;
library complexity;
FRiP;
signal-to-noise;
zgodność replikatów;
oczekiwane pozytywne i negatywne loci;
lot przeciwciała;
cross-reactivity.

Antibody lot jest wersją assay

Dwa loty nominalnie tego samego przeciwciała mogą różnić się powinowactwem i tłem. Walidacja powinna obejmować:

właściwy peptyd lub białko;
knockout/knockdown, jeśli dostępny;
peptide competition;
orthogonal assay;
western nie jako jedyny dowód;
porównanie profilu genomowego.

Sygnał ChIP nie jest cechą samego genomu — jest wynikiem białka, epitopu i przeciwciała.

Globalna zmiana wymaga kotwicy

Standardowa normalizacja zakłada podobną całkowitą ilość sygnału między próbkami. Jeśli inhibitor zmniejsza globalnie modyfikację histonu, skalowanie do tej samej liczby reads może ukryć spadek i stworzyć pozorne regiony wzrostu.

Spike-in lub niezależny pomiar globalny może zakotwiczyć skalę. Musi jednak przejść przez właściwy etap i mieć stabilne zachowanie.

Kontakty 3D: częstość sąsiedztwa, nie fotografia jądra

Hi-C utrwala chromatynę, tnie DNA, liguje końce znajdujące się blisko i sekwencjonuje pary powstałych połączeń. Zliczenia tworzą macierz kontaktów. Na różnych skalach można z niej wnioskować o przedziałach aktywnej i nieaktywnej chromatyny, domenach częstszych kontaktów oraz wzbogaconych punktach kontaktu. Pierwsza mapa Hi-C całego genomu człowieka pokazała organizację genomu w przestrzenne przedziały i zachowanie polimeru na dużych skalach.⁵

Macierz nie jest zdjęciem trwałych pętli w pojedynczej komórce. Jest rozkładem częstości w populacji i zależy od sposobu utrwalania, enzymu, głębokości danych, odległości genomowej oraz normalizacji. Im drobniejszej struktury szukamy, tym więcej informacyjnych par potrzeba. Nazwanie wzbogacenia „pętlą” nie oznacza, że kontakt istnieje w każdej komórce ani przez cały czas.

Granice domen mogą ograniczać oddziaływanie enhancerów, a rearanżacja może połączyć element regulatorowy z nieprawidłowym genem. Aby wykazać taki mechanizm, warto jednak połączyć kontakty 3D z dostępnością, ekspresją i perturbacją granicy lub elementu — nie opierać wniosku na samej mapie Hi-C.

Contact probability zależy od odległości

Regiony blisko siebie na liniowej sekwencji spotykają się częściej niż odległe. Surowa liczba kontaktów promotora z enhancerem nie może być porównana bez modelu oczekiwanej częstości dla tej odległości.

Normalizacja koryguje także:

liczbę miejsc restrykcyjnych;
GC;
mapowalność;
coverage;
widoczność binów.

Różne metody normalizacji odpowiadają różnym założeniom. Mapa kolorów po balansowaniu nie jest surowym pomiarem.

Rozdzielczość wynika z informacyjnych par

„Mapa 5 kb” oznacza binning, nie że każdy bin ma wiarygodny sygnał. Przy drobnym podziale większość komórek macierzy może być pusta.

Trzeba raportować:

valid pairs;
cis/trans ratio;
duplicate rate;
distance decay;
library complexity;
coverage per resolution;
reproducibility.

Compartments, TADs i loops są różnymi skalami

Compartments opisują szeroką segregację aktywnej i nieaktywnej chromatyny. TAD-like domains opisują lokalne wzbogacenie kontaktów. Loops są punktowymi wzbogaceniami między kotwicami.

Granica wykryta w populacji może być:

silna w większości komórek;
obecna w części;
średnią dynamicznych struktur;
zależna od typu;
zmieniona przez cykl komórkowy.

Single-cell Hi-C pokazuje heterogeniczność, lecz każda komórka ma bardzo mało par.

Capture-C i pokrewne metody celowane

Jeśli pytanie dotyczy wybranych promotorów, celowane wzbogacenie może uzyskać większą głębokość ich kontaktów niż genome-wide Hi-C. Nie pozwala jednak odkrywać z równą mocą w całym genomie.

Wybór:

całogenomowa architektura;
kontakty wielu promotorów;
jeden locus;
kontakt białko-zależny,

prowadzi do innego assay.

Bulk, pojedyncza komórka i pojedyncze jądro

Pomiar zbiorczy (bulk) ma zwykle gęstszy sygnał i jest prostszy statystycznie, ale uśrednia populację. Metody single-cell albo single-nucleus rozdzielają heterogeniczność, kosztem bardzo rzadkiej macierzy: w jednej komórce obserwuje się tylko niewielki podzbiór wszystkich możliwych miejsc.

W scATAC-seq komórki lub jądra otrzymują kody kreskowe. Analiza musi odrzucić puste krople, niskiej jakości jądra i dublety, a następnie grupuje komórki na podstawie fragmentarycznego sygnału. Agregacja klas poprawia widoczność pików, ale ponownie tworzy średnią. Klaster uzyskany obliczeniowo nie jest automatycznie typem komórki; potrzebuje niezależnej adnotacji.

W małych próbkach „więcej komórek” nie zawsze oznacza więcej niezależnych dowodów. Dziesięć tysięcy komórek od jednego dawcy nadal daje jednego dawcę w porównaniu biologicznym. Komórki są jednostkami obserwacji technicznej, a dawcy, hodowle lub niezależne klony — zależnie od pytania — jednostkami replikacji biologicznej.

scATAC ma inną rzadkość niż scRNA

Gen może dać wiele transkryptów. Diploidalna komórka ma zwykle tylko dwie kopie autosomalnego locus. Nawet całkowicie dostępny region może wygenerować zero lub kilka fragmentów. Macierz peak × cell jest skrajnie rzadka.

Analiza często używa:

binów lub peaks;
TF-IDF;
latent semantic indexing;
grafu sąsiadów;
agregacji pseudobulk;
gene activity scores;
transferu etykiet z RNA.

Gene activity jest predykcją na podstawie dostępności promotora i okolicy, nie pomiarem RNA.

Doublets i nuclei quality

Podwójne jądro może łączyć profile dwóch typów i tworzyć pozorny stan. Niskiej jakości jądro ma mało fragmentów i słabe TSS enrichment. Ambient DNA oraz fragmenty bez jądra tworzą tło.

QC per komórka obejmuje:

unique fragments;
TSS enrichment;
nucleosome signal;
FRiP;
mitochondrial fraction;
doublet score;
fraction in blacklist.

Progi zależą od typu. Globalny filtr może usunąć prawidłowe małe jądra.

Peak set dla wielu typów

Piki wywołane na wszystkich komórkach faworyzują populacje liczne. Rzadki typ może mieć prawdziwe enhancery niewidoczne w zbiorczym sygnale.

Lepszy workflow:

wstępnie grupuje komórki;
agreguje per grupa i dawca;
wywołuje piki;
łączy regiony;
przelicza fragmenty we wspólnym zbiorze;
testuje stabilność adnotacji.

Nie wolno używać finalnej chorobowej etykiety do tworzenia peak set w sposób, który z góry maksymalizuje różnicę bez walidacji.

Wielomodalność: wspólny kod nie tworzy przyczynowości

Eksperymenty wielomodalne mogą w tej samej komórce mierzyć na przykład dostępność chromatyny i RNA. SNARE-seq był jednym z podejść łączących transkryptom z dostępnością w pojedynczych komórkach przez rozdzielenie znakowanych jąder i RNA.⁶ Takie dane zmniejszają niepewność wynikającą z dopasowywania osobnych populacji.

Nadal jednak mierzymy współwystępowanie. Dostępny region i ekspresja genu w tej samej komórce mogą być dwoma skutkami trzeciego regulatora. Łączenie zbiorów po „kotwicach” obliczeniowych może wygładzić prawdziwe różnice, a integracja wielu partii może usunąć sygnał biologiczny pomylony z efektem technicznym. Model integracyjny powinien mieć jawną hipotezę i test na danych nieużytych do dopasowania.

Od elementu regulatorowego do genu prowadzi hipoteza

Najbliższy gen nie zawsze jest celem enhancera. Element może ominąć kilka promotorów, działać na innym haplotypie albo mieć różne cele w różnych typach komórek.

Dowody peak-to-gene:

odległość;
korelacja dostępności z RNA;
wspólny stan w single-cell multiome;
kontakt 3D;
eQTL;
zgodność motywów;
CRISPRi/a;
delecja elementu;
reporter.

Każdy ma ograniczenia. Korelacja może wynikać z wspólnego czynnika, Hi-C z samego sąsiedztwa, a reporter usuwa element z natywnego kontekstu.

Link trzeba oceniać w tym samym typie

Enhancer dostępny w limfocycie i gen eksprymowany w monocytach mogą korelować w bulk przez zmiany składu. Integracja powinna być wykonana na porównywalnych komórkach, dawcach i warunkach.

Peak-to-gene score jest rankingiem kandydatów, nie numerem potwierdzonej przyczynowości.

Chromatin state jest etykietą kombinacji

Modele segmentacyjne łączą obecność kilku marks w stany takie jak:

active promoter;
poised promoter;
strong enhancer;
weak enhancer;
transcribed;
Polycomb-repressed;
heterochromatin;
quiescent.

Nazwy są użyteczne, ale zależą od zestawu marks i modelu. „Quiescent” często oznacza brak mierzonego sygnału, nie dowód biologicznej bezczynności.

Bivalent promoter

W komórkach pluripotentnych część promotorów wykazuje H3K4me3 i H3K27me3 w danych zbiorczych. Może to oznaczać:

oba marks na tych samych nukleosomach;
różne nukleosomy tego samego allelu;
różne allele;
mieszaninę komórek;
subpopulacje.

Bulk ChIP dwóch osobnych marks nie rozstrzyga konfiguracji na jednej cząsteczce. Termin „bivalent” powinien być używany z określonym poziomem dowodu.

Czas pozwala odróżnić kolejność

Dwa punkty — przed i po — nie pokazują, co zmieniło się pierwsze. Seria czasowa może ujawnić:

wiązanie czynnika;
zmianę dostępności;
modyfikację histonu;
kontakt enhancer–promoter;
wzrost RNA;
zmianę białka;
fenotyp.

Kolejność wspiera mechanizm, ale nadal nie dowodzi konieczności. Potrzebna jest perturbacja.

Dopasowanie stadium zamiast zegara

W rozwoju dwa zarodki po tej samej liczbie godzin mogą być na innych etapach. Porównanie SCNT i IVF tylko według czasu może uznać opóźnienie za wadę epigenetyczną.

Stadium należy ocenić niezależnie:

liczbą komórek;
morfologią;
markerami;
transkryptomem;
cyklem;
położeniem linii.

Analiza może modelować zarówno czas, jak i stadium.

Dziedziczenie epigenetyczne ma kilka znaczeń

„Dziedziczne” może oznaczać:

utrzymanie stanu przez mitozy;
przekazanie przez różnicowanie;
przejście przez gametę do potomstwa;
efekt środowiska matki na płód;
zachowanie między pokoleniami po ekspozycji.

Te twierdzenia mają rosnącą siłę dowodu.

Mitotyczna pamięć

Po replikacji część informacji jest odtwarzana przez:

maintenance DNA methylation;
reader–writer feedback;
zachowanie czynników;
strukturę chromatyny;
sieci transkrypcyjne;
położenie jądrowe.

Stan może być stabilny, lecz zależny od środowiska. Usunięcie sygnału może prowadzić do jego zaniku.

Międzypokoleniowe i transgeneracyjne

Ekspozycja ciężarnej samicy obejmuje matkę, płód i rozwijające się w płodzie komórki płciowe. Efekt w bezpośrednio narażonych pokoleniach nie jest automatycznie dowodem transmisji ponad ekspozycję.

Trzeba wykluczyć:

zmianę zachowania rodzicielskiego;
środowisko macicy;
mikrobiom;
metabolizm;
genetyczną selekcję;
podobną ekspozycję potomstwa.

Sam marker metylacji u potomstwa nie ustala drogi przeniesienia.

Zmiana epigenetyczna może być skutkiem

W chorobie region może się zamknąć, ponieważ komórka przestała ekspresjonować czynnik utrzymujący dostępność. Metylacja może narastać po wyciszeniu, a nie je inicjować.

Modele przyczynowe:

epigenom → RNA → fenotyp;
sygnał → RNA i epigenom równolegle;
RNA/funkcja czynnika → epigenom;
skład komórek → oba pomiary;
genotyp → epigenom i RNA.

Bez perturbacji wiele modeli pasuje do tej samej korelacji.

Genotyp jest ukrytą zmienną regulacji

Wariant może:

niszczyć motyw;
zmieniać CpG;
wpływać na nucleosome positioning;
zmieniać wiązanie CTCF;
zmieniać ekspresję czynnika.

meQTL, caQTL i hQTL łączą genotyp z metylacją, dostępnością lub histonami. Analiza musi uważać, by różnicy alleli nie uznać za efekt środowiska.

Allele, imprinting i chromosom X

Pomiar epigenomu często wymaga rozdzielenia dwóch kopii genomu. W imprintingu ważne jest, czy aktywny lub zmetylowany jest allel matczyny czy ojcowski. W inaktywacji chromosomu X stan zależy od płci chromosomalnej, typu komórki, etapu rozwoju i gatunku. Uśrednienie alleli może ukryć nieprawidłową utratę imprintingu albo mieszaninę komórek o innych stanach X.

Przypisanie allelu wymaga informacyjnych wariantów w tej samej cząsteczce lub danych rodziców. Krótkie odczyty mogą nie łączyć odległego znacznika z mierzonym miejscem, natomiast długie odczyty zachowują fazę na większym dystansie. To przykład, w którym metoda sekwencjonowania i metoda epigenomiczna muszą być projektowane razem.

Co epigenom mówi o przeprogramowaniu

W transferze jądra komórki somatycznej (SCNT) genom dawcy trafia do cytoplazmy oocytu, która ma przestawić dojrzały stan komórkowy na program wczesnego zarodka. Nie jest to czyszczenie wszystkich znaczników do zera. Prawidłowy rozwój wymaga sekwencji zmian: przebudowy chromatyny, aktywacji genomu zarodkowego, ustanowienia linii embrionalnych i pozazarodkowych oraz zachowania tych piętn, które nie powinny zostać wymazane.

Porównanie klonu z zarodkiem po zapłodnieniu musi kontrolować stadium rozwoju. Zarodek SCNT opóźniony o kilka godzin może mieć inny transkryptom i chromatynę tylko dlatego, że znajduje się na innym etapie. Do sensownego projektu potrzebne są:

komórka dawcy i oocyt jako punkty odniesienia;
zarodki po zapłodnieniu dopasowane stadium, a nie tylko godziną;
wiele niezależnych dawców i rekonstrukcji;
dane z poszczególnych komórek, aby nie mieszać linii rozwojowych;
co najmniej dwie warstwy, na przykład dostępność wraz z RNA;
pomiar przeprowadzony przed i po interwencji.

Region „oporny na przeprogramowanie” powinien wykazywać spójny, odtwarzalny stan dawcy w SCNT, różny od prawidłowego zarodka, oraz związek z zaburzoną ekspresją lub rozwojem. Sama różnica metylacji nie przesądza, że jest przyczyną niepowodzenia.

Korelacja tworzy hipotezę, perturbacja testuje mechanizm

Najmocniejszy projekt przechodzi od mapy do ingerencji. Jeśli otwarcie enhancera koreluje z aktywacją genu, można usunąć enhancer, zmienić jego motyw, zablokować czynnik, skierować regulator chromatyny albo zastosować reporter. Trzeba przy tym mierzyć zarówno bezpośredni cel, jak i dalszy fenotyp.

Schemat przyczynowy wygląda następująco:

obserwacja wskazuje kandydacki element lub barierę;
niezależna metoda potwierdza stan molekularny;
celowana perturbacja zmienia przewidywaną warstwę;
pojawia się przewidywany skutek dla ekspresji lub rozwoju;
eksperyment ratunkowy przywraca efekt albo alternatywna perturbacja daje ten sam kierunek;
kontrole wykluczają toksyczność, opóźnienie rozwoju i zmianę składu komórek.

CRISPR, CRISPRi i CRISPRa są narzędziami do takich testów, lecz same również mają efekty uboczne i wymagają kontroli. Ich mechanizm opisuje artykuł CRISPR-Cas9: zasada działania.

Tabela: metoda, sygnał i najczęstsza nadinterpretacja

Metoda	Bezpośrednio mierzy	Rozsądny wniosek	Nadinterpretacja
bisulfit / konwersja enzymatyczna	stan po reakcji rozróżniającej część modyfikacji C	udział modyfikowanych cząsteczek w miejscu	„ten gen jest wyłączony”
natywny długi odczyt	zmianę sygnału zależną od sekwencji i modyfikacji	modelowo przypisaną modyfikację na cząsteczce	„bezpośredni odczyt bez błędu i kalibracji”
ATAC-seq	dostępność DNA dla Tn5	region dostępny w badanych warunkach	„czynnik na pewno się tu wiąże”
ChIP-seq / CUT&Tag	wzbogacenie zależne od przeciwciała	obecność epitopu powiązanego z DNA	„znacznik sam włącza lub wyłącza gen”
Hi-C	częstość ligacji par regionów	wzbogacony kontakt w populacji	„stała pętla w każdej komórce”
RNA-seq	cząsteczki RNA uchwycone protokołem	stan transkrypcyjny próbki	„aktywność białka i funkcja komórki”
single-cell	rzadki sygnał z zakodowanej komórki/jądra	heterogeniczność i kandydackie stany	„każdy klaster jest nowym typem komórki”

Projekt minimalny i projekt mocny

Minimalny eksperyment porównawczy powinien mieć biologiczne powtórzenia, losowy rozkład próbek między partiami, kontrolę jakości wejścia, kontrolę właściwą dla metody i z góry określony sposób analizy. Jeśli wszystkie kontrole są w jednej partii, a wszystkie próbki badane w drugiej, efekt biologiczny jest nierozdzielny od efektu technicznego.

Projekt mocny dodaje:

pomiar składu komórkowego albo rozdzielczość pojedynczych komórek;
drugą, niezależną warstwę danych;
walidację wybranych miejsc inną metodą;
analizę allelospecyficzną, gdy jest biologicznie istotna;
serię czasową zamiast dwóch arbitralnych punktów;
perturbację i próbę odwrócenia skutku;
kohortę lub serię klonów niewykorzystaną do budowy modelu.

Atlas ENCODE pokazuje wartość ujednoliconych map wielu warstw w licznych typach komórek, ale zarazem przypomina, że mapa referencyjna nie zastępuje materiału odpowiadającego konkretnemu modelowi, wiekowi i warunkom eksperymentu.⁷

Jak raportować epigenomikę

Metody powinny umożliwiać odtworzenie:

pochodzenia i składu próbki;
pobrania, utrwalenia i przechowywania;
liczby replikatów;
randomizacji i partii;
ilości materiału wejściowego;
przeciwciała, klonu i lotu;
enzymu, konwersji lub chemii;
biblioteki i sekwencjonowania;
referencji genomowej;
mapowania i filtrów;
duplikatów i multi-mapping reads;
peak/DMR/contact calling;
normalizacji;
wersji narzędzi;
regionów wykluczonych;
kryteriów QC.

Pliki surowe i przetworzone

FASTQ nie zawsze jest najbardziej surowym dostępnym poziomem. Natywne długie reads mogą zachowywać sygnał potrzebny do ponownego callingu modyfikacji. Dane obrazowe lub macierze kontaktów mają własne formaty pierwotne.

Pakiet powinien zachować:

reads lub sygnał;
alignment;
fragment files;
coverage tracks;
peaks/DMRs/loops;
macierze zliczeń;
metadata;
QC;
workflow;
checksums.

Track w przeglądarce jest wizualizacją. Nie zastępuje zliczeń per replikat i modelu statystycznego.

Lista kontrolna przed interpretacją

Przed sformułowaniem wniosku warto odpowiedzieć:

Jaka cząsteczka lub reakcja wytworzyła mierzony sygnał?
Czy próbki mają porównywalny skład komórkowy i historię pobrania?
Czy jednostką niezależnego powtórzenia jest dawca, klon, hodowla czy komórka?
Czy kontrole sprawdzają konwersję, swoistość przeciwciała, tło i efekty partii?
Jakie regiony lub stany są niewidoczne dla tej metody?
Czy „brak sygnału” oznacza brak cechy, czy zbyt małą moc pomiaru?
Czy obserwacja jest korelacją, predykcją czy wynikiem perturbacji?
Czy wersje genomu, adnotacji, oprogramowania i parametry zostały zapisane?
Czy najważniejszy wynik powtórzono innym pomiarem?
Jakiego alternatywnego wyjaśnienia dane nie rozstrzygają?

Czytanie epigenomu przypomina składanie zeznań wielu niedoskonałych świadków. Każdy opisuje inną cechę próbki i ma własne źródła błędu. Zbieżność niezależnych metod oraz dobrze zaprojektowana ingerencja są cenniejsze niż najładniejsza pojedyncza mapa.