Streszczenie

„Komórka ma 46 chromosomów” jest prawdą tylko po dopowiedzeniu, o jakim gatunku, typie komórki i momencie cyklu mówimy. Po replikacji DNA ludzka komórka somatyczna nadal ma 46 chromosomów, lecz każdy składa się z dwóch chromatyd siostrzanych, a całkowita ilość DNA jest podwojona. Po pierwszym podziale mejotycznym komórka ma już haploidalny zestaw homologów, ale każdy chromosom nadal pozostaje zreplikowany. Liczba zestawów chromosomów i ilość DNA nie są więc tym samym parametrem.

Do opisu będziemy używać dwóch symboli. n oznacza liczbę różnych zestawów chromosomów, czyli ploidalność, a C — ilość DNA względem jednego niezreplikowanego haploidalnego genomu. Typowa diploidalna komórka w G1 ma 2n, 2C, po fazie S ma 2n, 4C, oocyt w metafazie II ma 1n, 2C, a dojrzały pronukleus po zakończeniu mejozy ma 1n, 1C.

To rozróżnienie jest niezbędne w embriologii i transferze jądra komórki somatycznej. Oocyt biorcy nie jest pustym pęcherzykiem, lecz komórką zatrzymaną w konkretnym momencie mejozy. Jądro dawcy także znajduje się w określonej fazie. Jeżeli ich cykle są niezgodne, po aktywacji może powstać nieprawidłowa liczba kopii genomu, przedwczesna kondensacja chromosomów albo błędna segregacja.

Zmiany ploidalności n i ilości DNA C w cyklu mitotycznym, mejozie żeńskiej, zapłodnieniu oraz typowym wariancie SCNT z jądrem dawcy w G0/G1.
Zmiany ploidalności n i ilości DNA C w cyklu mitotycznym, mejozie żeńskiej, zapłodnieniu oraz typowym wariancie SCNT z jądrem dawcy w G0/G1.

Najpierw cztery rzeczy, które często nazywa się „chromosomem”

W codziennym języku obraz chromosomu ma kształt litery X. Taki kształt jest jednak krótkotrwałym stanem zreplikowanego i silnie skondensowanego chromosomu, najlepiej widocznym podczas metafazy. Przez większość życia komórki DNA jest mniej zwarte, a granic pojedynczych chromosomów nie widać w zwykłym mikroskopie.

Trzeba rozdzielić cztery pojęcia:

  • cząsteczka DNA — jedna ciągła dwuniciowa helisa;
  • chromatyda — jedna cząsteczka chromosomalnego DNA wraz z białkami, które ją organizują;
  • chromosom — jednostka dziedziczenia liczona według centromeru;
  • para homologiczna — dwa chromosomy tego samego typu, zwykle jeden odziedziczony po matce i jeden po ojcu.

Przed replikacją chromosom składa się z jednej chromatydy. Po replikacji ma dwie chromatydy siostrzane połączone w rejonie centromeru. Nadal liczymy go jako jeden chromosom, ponieważ ma jeden funkcjonalny układ centromerowy utrzymujący siostry razem. Dopiero gdy chromatydy rozdzielą się w anafazie, każda staje się samodzielnym chromosomem potomnym.

Dlatego w metafazie mitozy ludzkiej komórki można prawidłowo powiedzieć:

  • 46 chromosomów;
  • 92 chromatydy;
  • 92 cząsteczki chromosomalnego DNA;
  • 23 pary homologiczne;
  • 2n, 4C.

Zdanie „po replikacji komórka ma 92 chromosomy” miesza liczbę chromatyd z liczbą chromosomów. W krótkim momencie anafazy, po rozdzieleniu centromerów, w obrębie jednej jeszcze niepodzielonej komórki rzeczywiście można naliczyć 92 chromosomy potomne. Po cytokinezie każda z dwóch komórek ma znowu po 46.

Homologi nie są kopiami

Chromosomy homologiczne mają odpowiadające sobie loci i podobną organizację, ale nie muszą nieść identycznych alleli. Matczyny chromosom 7 i ojcowski chromosom 7 są homologami, natomiast dwie chromatydy powstałe przez replikację jednego z nich są chromatydami siostrzanymi. Po replikacji istnieją więc cztery chromatydy związane z parą homologów: dwie matczyne i dwie ojcowskie.

Rekombinacja podczas mejozy sprawia, że chromatydy siostrzane po crossing-over nie muszą już być sekwencyjnie identyczne na całej długości. Nazwa „siostrzane” opisuje ich pochodzenie z replikacji jednego chromosomu, nie gwarancję absolutnej zgodności każdej zasady.

Co dokładnie oznaczają n i C

Symbolika jest prosta dopiero po ustaleniu punktu odniesienia.

n mówi, ile zestawów różnych typów chromosomów znajduje się w jądrze lub komórce. U człowieka jeden zestaw zawiera 23 chromosomy. Gameta jest haploidalna (1n), a typowa komórka somatyczna diploidalna (2n). U innych gatunków liczby bezwzględne są inne; n nie oznacza liczby 23, tylko jeden właściwy dla gatunku zestaw.

C opisuje względną masę jądrowego DNA. 1C jest ilością DNA w jednym niezreplikowanym haploidalnym zestawie. W zwykłej ludzkiej gamecie odpowiada to w przybliżeniu 3,2 miliarda par zasad, lecz symbol ma pozostać względny i działać również u gatunków o innych rozmiarach genomu.

Stan Ploidalność Ilość DNA Co znajduje się w komórce
somatyczna G0/G1 2n 2C dwa homologi każdego typu, każdy jednochromatydowy
somatyczna po fazie S i w G2 2n 4C dwa homologi, każdy z dwiema chromatydami
po mitozie 2n 2C w każdej komórce potomnej stan jak przed replikacją
pierwotny oocyt po replikacji 2n 4C pary homologów, każdy z dwiema chromatydami
wtórny oocyt w MII 1n 2C po jednym homologu każdego typu, nadal dwie chromatydy
pronukleus żeński po MII 1n 1C po jednym jednochromatydowym chromosomie każdego typu
plemnik przed replikacją w zygocie 1n 1C haploidalny genom ojcowski
dwa pronukleusy po replikacji razem 2n razem 4C genomy rodzicielskie nadal w oddzielnych otoczkach

Ploidalność nie wzrasta podczas zwykłej fazy S. Komórka 2n, 2C staje się 2n, 4C, bo kopiuje każdy z już posiadanych homologów. Nie otrzymuje trzeciego ani czwartego zestawu homologów.

Kiedy n/C nie wystarcza

Notacja opisuje ilość i zestawy, ale nie jakość ani dokładny skład. Dwie komórki mogą być oznaczone 2n, 2C, choć jedna ma prawidłowy kariotyp, a druga straciła chromosom 7 i zyskała dodatkowy chromosom 12. Zbilansowanie całkowitej ilości nie naprawia aneuploidii.

Notacja nie pokazuje także:

  • translokacji i inwersji;
  • mutacji punktowych;
  • mozaikowatości między komórkami;
  • pochodzenia rodzicielskiego chromosomów;
  • wzorów imprintingu;
  • mitochondrialnego DNA;
  • stopnia skondensowania chromatyny.

n i C są więc pierwszą kontrolą rachunkową, a nie pełnym opisem genomu.

Cykl mitotyczny: podwoić DNA tylko raz i rozdzielić je tylko raz

Cykl proliferującej komórki somatycznej dzieli się na G1, S, G2 i M. Litera G pochodzi od gap, ale fazy G nie są biernymi przerwami. Komórka rośnie, syntetyzuje białka, sprawdza warunki i przygotowuje kolejne zdarzenia.

G0: poza aktywną pętlą

Komórka w G0 ma zwykle 2n, 2C, podobnie jak komórka G1. Różnica jest funkcjonalna: nie przesuwa się aktualnie w stronę replikacji. Niektóre komórki wracają do cyklu po odpowiednim sygnale, inne pozostają trwale postmitotyczne albo wchodzą w starzenie komórkowe.

G0 nie jest jednym identycznym stanem. Spoczynkowy limfocyt, dojrzały neuron, komórka macierzysta w niszy i fibroblast pozbawiony surowicy mogą mieć tę samą ilość DNA, lecz inne programy ekspresji, metabolizm i zdolność powrotu do podziału. To ważne przy SCNT: „dawca w G0” opisuje zgodność ilości DNA, ale nie pełną jakość jądra.

G1: decyzja przed replikacją

W G1 chromosomy są niezreplikowane (2n, 2C). Komórka interpretuje sygnały wzrostowe, sprawdza zasoby i przygotowuje kompleksy inicjujące replikację. Po przejściu punktu restrykcyjnego jest znacznie silniej zobowiązana do wejścia w fazę S.

Mechanizmy kontrolne nie działają jak pojedynczy strażnik przy drzwiach. Są siecią kinaz zależnych od cyklin, inhibitorów, systemów wykrywających uszkodzenia i odpowiedzi na warunki środowiska. Białko p53 może po uszkodzeniu DNA zwiększyć ekspresję p21, który hamuje kompleksy cyklina–CDK i daje czas na naprawę albo kieruje komórkę ku trwałemu zatrzymaniu lub śmierci.1

S: replikacja nie jest chwilą

Faza S trwa przez znaczną część cyklu. Poszczególne obszary genomu replikują się w różnych momentach, a wiele miejsc startu działa równolegle. Wczesna komórka S ma ilość DNA niewiele większą od 2C, późna zbliża się do 4C. Oznaczenie komórki S jako po prostu 2n, 3C jest użytecznym schematem, ale pojedyncza komórka może mieć dowolną wartość pośrednią.

Każdy odcinek powinien zostać skopiowany raz. Zbyt mała liczba aktywnych miejsc startu grozi niedokończeniem replikacji, a ponowne uruchomienie już użytego miejsca — powieleniem fragmentu. Licencjonowanie replikacji rozdziela przygotowanie miejsc startu w G1 od ich aktywacji w S.

W czasie S powstają chromatydy siostrzane i ustanawiana jest między nimi kohezja. Nie jest to tylko kopiowanie liter DNA. Trzeba odtworzyć organizację chromatyny, rozdzielić nowe histony, skopiować część znaków epigenetycznych i zbudować dwie fizycznie połączone struktury gotowe do późniejszej segregacji.

G2: 4C nie znaczy „gotowe”

Po replikacji komórka ma 2n, 4C. Musi sprawdzić, czy genom został skopiowany i czy uszkodzenia nie wymagają zatrzymania. Przygotowuje również aparat mitotyczny. Wejście do mitozy zależy między innymi od aktywacji kompleksu cyklina B–CDK1.

Komórka G2 i komórka w metafazie mają podobną ilość DNA, ale zupełnie inną organizację. W G2 chromosomy są rozproszone w jądrze, a w metafazie skondensowane i przyłączone do wrzeciona. Pomiar samej fluorescencji DNA nie rozróżni ich bez dodatkowego markera.

M: segregacja i fizyczny podział

Mitoza obejmuje kondensację chromosomów, rozpad otoczki jądrowej, wychwycenie kinetochorów przez mikrotubule, ustawienie chromosomów, rozdzielenie chromatyd i odbudowę jąder. Cytokineza rozdziela cytoplazmę.

Kluczową decyzję podejmuje punkt kontrolny wrzeciona. Dopóki kinetochory nie są prawidłowo przyłączone, kompleks APC/C pozostaje hamowany. Po spełnieniu warunków degradowana jest sekuryna, aktywuje się separaza i przecina kohezynę utrzymującą chromatydy siostrzane. Ten krok jest zasadniczo nieodwracalny.

W anafazie liczba C w całej jeszcze niepodzielonej komórce nadal wynosi 4, lecz dwie grupy po 2C oddalają się ku biegunom. Dopiero po cytokinezie otrzymujemy dwie komórki 2n, 2C.

Cykliny i CDK tworzą kolejność, a nie zegarek ścienny

Nazwy faz mogą sugerować, że komórka realizuje harmonogram odmierzany równymi odcinkami czasu. W rzeczywistości kolejność jest budowana przez zmiany aktywności enzymów. Kinazy zależne od cyklin (CDK) fosforylują zestawy białek, a stężenia ich cyklinowych partnerów rosną i maleją.

Komórka nie przechowuje osobnego „programu G1”, „programu S” i „programu M” w trzech szufladach. Kolejne aktywności nakładają się, wzajemnie uruchamiają i hamują. Przykładowo:

  • kompleksy G1/S przygotowują wejście do replikacji;
  • aktywności S-CDK uruchamiają miejsca startu replikacji, a jednocześnie zapobiegają ich ponownemu licencjonowaniu;
  • cyklina B–CDK1 pomaga uruchomić mitozę, kondensację chromosomów, przebudowę mikrotubul i rozpad otoczki jądrowej;
  • APC/C kieruje cyklinę B i inne białka do degradacji, dzięki czemu komórka wychodzi z mitozy.

Ważna jest dodatnia informacja zwrotna. Gdy aktywność CDK1 przekroczy próg, hamujące ją białka są wyłączane, a aktywujące wzmacniane. Przejście G2/M staje się gwałtowne i skoordynowane. Podobnie aktywacja APC/C uruchamia degradację zabezpieczeń anafazy. Cykl nie jest więc płynnym rozjaśnianiem kolejnych lamp, lecz serią przełączeń.

Ta logika tłumaczy, dlaczego połączenie jądra i cytoplazmy z różnych faz daje natychmiastowe skutki. Cytoplazma MII nie „pyta” jądra o jego historię. Zawiera wysoką aktywność enzymów, które działają na dostępne substraty: mogą rozłożyć otoczkę jądra G1, skondensować jego chromatynę i przebudować białka. Zgodność oznacza, że konsekwencje tych reakcji prowadzą do możliwego rachunku replikacji i podziału.

Punkt kontrolny nie naprawia błędu za komórkę

Punkty kontrolne są często przedstawiane jako system gwarantujący poprawność. Trafniej mówić, że opóźniają przejście, gdy wykryją określony rodzaj problemu. Odpowiedź na niedoreplikowane DNA może dać czas na dokończenie lub naprawę, ale nie odtworzy brakującego chromosomu. Punkt kontrolny wrzeciona może zahamować anafazę przy wolnym kinetochorze, lecz nie wykrywa każdego przyłączenia dającego nieprawidłową segregację.

Szczególnie podstępne jest przyłączenie meroteliczne, gdy jeden kinetochor łączy się z mikrotubulami obu biegunów. Może wytworzyć napięcie i uniknąć pełnego zatrzymania, a chromosom opóźnia się w anafazie. Powstaje mikrojądro albo aneuploidalna komórka potomna. Obecność sprawnego checkpointu zmniejsza ryzyko, nie daje certyfikatu prawidłowego podziału.

W zarodku presja czasu i nietypowa organizacja pierwszych cykli dodatkowo zmieniają odpowiedzi kontrolne. Dlatego ocena samego tempa bruzdkowania albo faktu osiągnięcia blastocysty nie wyklucza błędów chromosomowych.

Mitoza zachowuje ploidalność, ale nie gwarantuje identyczności

Modelowy podział mitotyczny przekazuje obu córkom po jednej chromatydzie z każdego zreplikowanego chromosomu. Mimo to komórki potomne nie muszą być identyczne:

  • podczas replikacji mogą powstać nowe warianty;
  • uszkodzenie może zostać naprawione inaczej w obu chromatydach;
  • chromosom może zostać błędnie przyłączony i źle rozdzielony;
  • cytoplazma, organelle i czynniki regulacyjne mogą zostać rozdzielone nierówno;
  • komórki mogą po podziale otrzymać inne sygnały z otoczenia.

W hodowli szybciej rosnący subklon może stopniowo wyprzeć resztę populacji. W organizmie mutacja jednej komórki może utworzyć mozaikowy klon. Wspólny przodek nie zamraża genomu ani stanu potomstwa, co łączy ten temat z artykułem Co właściwie znaczy „klonowanie”.

Mejoza: jedna replikacja, dwa rozdzielenia

Mejoza służy nie tylko zmniejszeniu liczby chromosomów. Łączy homologi, umożliwia rekombinację i tworzy gamety o nowych kombinacjach alleli. Jej rachunek jest szczególny:

  1. diploidalna komórka replikuje DNA: 2n, 2C → 2n, 4C;
  2. mejoza I rozdziela homologi: 2n, 4C → 1n, 2C;
  3. bez kolejnej fazy S mejoza II rozdziela chromatydy siostrzane: 1n, 2C → 1n, 1C.2
Profaza I: homologi muszą się odnaleźć

Zreplikowane homologi parują dzięki kompleksowi synaptonemalnemu. Programowo wywołane pęknięcia DNA inicjują rekombinację. Część napraw prowadzi do crossing-over między chromatydami niesiostrzanymi. Widoczne połączenia, czyli chiazmy, pomagają utrzymać parę homologów do czasu ich rozdzielenia.

Układ czterech chromatyd w sparowanych homologach bywa nazywany biwalentem z punktu widzenia dwóch chromosomów albo tetradą z punktu widzenia czterech chromatyd. Obie nazwy mogą opisywać tę samą strukturę.

Mejoza I: redukcja zestawów

W metafazie I homologi ustawiają się parami. Kinetochory chromatyd siostrzanych są funkcjonalnie skierowane ku temu samemu biegunowi, natomiast homologiczne chromosomy ku przeciwnym. W anafazie I rozcinana jest kohezja na ramionach, ale chroniona w rejonie centromeru. Homologi rozchodzą się, siostry pozostają razem.

Po tym podziale każda komórka ma jeden homolog z każdej pary, więc jest 1n. Każdy chromosom nadal składa się jednak z dwóch chromatyd, dlatego ilość DNA wynosi 2C. To najważniejszy przykład pokazujący, że haploidalność nie musi oznaczać 1C.

Mejoza II: rozdzielenie sióstr

Między mejozą I i II nie ma zwykłej fazy S. W mejozie II kinetochory sióstr przyłączają się do przeciwnych biegunów. Kohezja centromerowa zostaje zwolniona, a chromatydy rozchodzą się podobnie jak w mitozie. Produktem jest 1n, 1C.

W podręcznikowym schemacie z jednej komórki powstają cztery haploidalne komórki. Dobrze pasuje to do spermatogenezy. Oogeneza zachowuje ten sam rachunek jądrowy, lecz dzieli cytoplazmę bardzo nierówno.

Wrzeciono liczy chromosomy mechanicznie, nie odczytuje ich sekwencji

Wrzeciono jest układem mikrotubul, biegunów i białek motorycznych. Kinetochor buduje się na centromerowej części chromatyny i stanowi interfejs między chromosomem a mikrotubulami. Aparat nie rozpoznaje, że dany obiekt jest „chromosomem 12” na podstawie jego genów. Reaguje na geometrię przyłączeń, napięcie i stan kinetochoru.

To pozwala segregować różne genomy tym samym podstawowym mechanizmem, ale tworzy ograniczenie: fragment z aktywnym centromerem może zachowywać się jak chromosom, a duplikacja bez prawidłowego centromeru może zostać zgubiona. Z kolei chromosom z dwoma aktywnymi centromerami może być ciągnięty w przeciwne strony.

Komórki somatyczne zwykle organizują mitotyczne wrzeciono wokół centrosomów. Oocyty wielu ssaków budują wrzeciono mejotyczne bez klasycznych centrioli, przez samoorganizację licznych ośrodków mikrotubul. Jest to proces mniej geometrycznie zdeterminowany i podatny na błędy w dużej cytoplazmie. Po zapłodnieniu wkład plemnika w organizację centrosomalną różni się między gatunkami; nie wolno automatycznie przenosić schematu z myszy na bydło, człowieka lub inne ssaki.

W SCNT brak plemnika oznacza, że organizacja pierwszego wrzeciona zależy od aparatu pozostawionego w oocycie i od gatunkowej biologii centrosomów. Enukleacja musi usunąć chromosomy, lecz nie może bezkarnie zniszczyć całej zdolności cytoplazmy do zbudowania kolejnych podziałów.

Oogeneza ssaka: cykl trwający miesiące albo dekady

Żeńska komórka rozrodcza nie przechodzi płynnie od fazy S do dwóch podziałów. U ssaków oocyty rozpoczynają mejozę w życiu płodowym i zatrzymują się w profazie I. U człowieka pojedynczy oocyt może pozostawać w tym stanie przez dziesięciolecia. W tym czasie rośnie i gromadzi RNA, białka, mitochondria oraz struktury potrzebne pierwszym etapom rozwoju.

Po sygnale hormonalnym wybrany oocyt wznawia mejozę. Rozpada się otoczka dużego jądra nazywanego pęcherzykiem zarodkowym (germinal vesicle), formuje się wrzeciono i dochodzi do rozdzielenia homologów. Cytokineza jest asymetryczna: większość cytoplazmy pozostaje w oocycie, a drugi zestaw chromosomów trafia do małego pierwszego ciałka kierunkowego.

Powstały wtórny oocyt ma 1n, 2C i u większości ssaków laboratoryjnych oraz człowieka zatrzymuje się w metafazie II. Wysoka aktywność kompleksu cyklina B–CDK1, nazywanego historycznie MPF, oraz zahamowanie APC/C przez mechanizmy cytostatyczne utrzymują ten stan.3

Dlaczego „komórka jajowa” bywa terminem nieprecyzyjnym

W języku polskim słowo to może oznaczać oocyt na różnym etapie albo dojrzałą gametę po zakończeniu mejozy. W embriologii technicznej trzeba podać stadium:

  • oocyt w profazie I z pęcherzykiem zarodkowym;
  • oocyt po zaniku otoczki jądrowej;
  • oocyt w metafazie I;
  • oocyt w metafazie II z pierwszym ciałkiem kierunkowym;
  • aktywowany oocyt po zakończeniu mejozy II;
  • zygota z pronukleusami.

W SCNT najczęściej wykorzystuje się oocyt MII, bo jego cytoplazma zawiera aparat zdolny do przebudowy wprowadzonego jądra, a chromosomy biorcy można rozpoznać w obrębie wrzeciona. Szczegóły zależą jednak od gatunku i wariantu metody.

Zapłodnienie: dwa haploidalne genomy nie od razu tworzą jedno jądro

Plemnik wnosi 1n, 1C. Oocyt MII przed zakończeniem mejozy ma 1n, 2C. Kontakt gamet uruchamia oscylacje wapnia, które prowadzą do degradacji regulatorów utrzymujących zatrzymanie metafazowe, zakończenia mejozy II i odrzucenia drugiego ciałka kierunkowego.7

Pozostały materiał żeński ma 1n, 1C. Chromatyna plemnika ulega dekondensacji i wymianie części białek. Tworzą się dwa pronukleusy: żeński i męski. Każdy jest haploidalny, ale razem zawierają diploidalny zestaw 2n, 2C.

U ssaków pronukleusy nie muszą zlewać się w jedno klasyczne jądro interfazowe. Replikują DNA w oddzielnych otoczkach, zbliżają się, a ich otoczki rozpadają się przed pierwszą mitozą. Chromosomy obu rodziców spotykają się na wspólnym aparacie pierwszego podziału. Przed tym podziałem cała zygota ma łącznie 2n, 4C.

To ważna korekta popularnego obrazu, w którym dwa „półjądra” po prostu sklejają się w pełne jądro. Diploidalność wynika ze wspólnej obecności dwóch zestawów homologów, nie z samego kształtu otoczki jądrowej.

SCNT jest problemem zgodności dwóch zegarów

W transferze jądra chromosomy oocytu usuwa się, a następnie wprowadza materiał jądrowy komórki dawcy. Celem jest uzyskanie diploidalnego układu, który po aktywacji wykona jedną prawidłową replikację przed pierwszą mitozą.

Najłatwiejszy rachunek daje dawca w G0 lub G1:

  1. oocyt MII ma 1n, 2C;
  2. enukleacja usuwa wrzeciono z chromosomami oocytu;
  3. jądro somatyczne dawcy wnosi 2n, 2C;
  4. aktywacja zwalnia oocyt z zatrzymania i uruchamia przebudowę jądra;
  5. genom dawcy replikuje się do 2n, 4C;
  6. pierwsza mitoza rozdziela go do dwóch komórek 2n, 2C.

Ten schemat nie opisuje jeszcze sukcesu biologicznego. Informuje tylko, że ilość materiału może zostać poprawnie skoordynowana. Jądro musi ponadto utracić somatyczną organizację chromatyny, uruchomić geny zarodkowe, odtworzyć właściwe podziały i współpracować z cytoplazmą oocytu.

Co robi cytoplazma MII z wprowadzonym jądrem

Oocyt MII ma wysoką aktywność czynników mitotycznych. Jądro z zachowaną otoczką może po kontakcie z taką cytoplazmą przejść rozpad otoczki i przedwczesną kondensację chromosomów. Zjawisko to pomaga przebudować chromatynę, ale przy niewłaściwej fazie dawcy może także uszkodzić rachunek replikacji.

Jeśli jądro dawcy jest w G0/G1, ma niezreplikowane chromosomy i po przebudowie może wejść w jedną fazę S. Jeśli pochodzi z fazy S, część genomu jest już skopiowana, a część nie. Nowe środowisko może nie wiedzieć, które miejsca replikacji zostały wykorzystane. Grozi to niedoreplikowaniem, ponowną replikacją fragmentów i uszkodzeniami.

Jądro G2 ma 2n, 4C. Gdyby po transferze wykonało jeszcze zwykłą fazę S bez wcześniejszego rozdzielenia chromatyd, uzyskałoby nadmiar DNA. Nie znaczy to, że jądra G2 lub M są bezwzględnie niezdolne do klonowania. W eksperymentalnych wariantach można koordynować stan dawcy z cytoplazmą i sposobem aktywacji, ale procedura musi uwzględnić, czy chromosomy mają zostać rozdzielone i czy ciałko kierunkowe ma zostać odrzucone.4

Dlatego reguła „G0/G1 jest zgodne z oocytem MII” jest dobrym punktem wejścia, a nie prawem bez wyjątków. Wynik zależy od gatunku, typu komórki dawcy, sposobu transferu, czasu między etapami i stanu oocytu. Przeglądy SCNT opisują żywe klony również z innych faz, pod warunkiem starannej koordynacji obu cykli.8

Zgodność fazy nie jest tym samym co synchronizacja całej populacji

W hodowli „komórki dawcy G1” może oznaczać co najmniej trzy sytuacje:

  • każdą komórkę zmierzono i wybrano w G1;
  • zastosowano zabieg zwiększający udział G1;
  • populacja rosła w warunkach, w których statystycznie wiele komórek powinno być w G1.

To nie są równoważne poziomy pewności. Ograniczenie surowicy, zahamowanie kontaktowe albo lek blokujący określone przejście może wzbogacić populację, ale zwykle nie tworzy stuprocentowo jednorodnego stanu. Po zwolnieniu blokady komórki również nie ruszają idealnie jednocześnie. Jeśli pojedynczą komórkę wybiera się do transferu tylko po morfologii, jej faza pozostaje wnioskowaniem.

Doświadczenie powinno więc podać:

  • jak wywołano lub wybrano stan dawcy;
  • czym i kiedy potwierdzono rozkład faz;
  • jaki odsetek populacji znalazł się w oczekiwanym przedziale;
  • ile czasu upłynęło między pomiarem a transferem;
  • czy zabieg synchronizujący sam zmienił żywotność, uszkodzenia DNA lub epigenom.

Bez tych danych hasło „zsynchronizowano komórki” nie pozwala odtworzyć biologicznego stanu dawcy.

Spoczynek nie jest magicznym odmłodzeniem

Przy Dolly komórki gruczołu mlekowego hodowano w warunkach ograniczonej surowicy, co zwiększało udział komórek spoczynkowych. Historycznie wiązano powodzenie z wprowadzeniem jąder do G0.5 Późniejsze eksperymenty pokazały jednak, że żywe klony można uzyskać także z aktywnie dzielących się komórek G1, a przewaga G0 lub G1 nie jest taka sama dla każdej linii i gatunku.6

Ograniczenie surowicy zmienia więcej niż fazę cyklu: metabolizm, wielkość komórki, ekspresję genów, stres i stan chromatyny. Porównanie „głodzona kontra rosnąca” nie izoluje więc automatycznie jednego czynnika. Do stwierdzenia, że decyduje faza, potrzebne są pomiary fazy i kontrole oddzielające ją od pozostałych zmian.

Enukleacja: usuwa chromosomy, nie całą informację oocytu

W oocycie MII materiał jądrowy nie znajduje się w typowym jądrze z otoczką. Skondensowane chromosomy leżą na wrzecionie blisko pierwszego ciałka kierunkowego. Enukleacja polega na usunięciu obszaru zawierającego wrzeciono i chromosomy. Jej skuteczność trzeba potwierdzić, bo położenie ciałka kierunkowego nie zawsze idealnie wskazuje położenie wrzeciona.

Po enukleacji w cytoplazmie pozostają:

  • mitochondrialne DNA i mitochondria;
  • matczyne RNA;
  • białka cyklu komórkowego;
  • enzymy i czynniki przebudowujące chromatynę;
  • błony, organelle i metabolity;
  • część struktur cytoszkieletu.

SCNT zastępuje więc genom chromosomalny biorcy, ale nie zamienia oocytu w cytoplazmatyczną kopię dawcy. Klon dziedziczy genom jądrowy zasadniczo od dawcy jądra, natomiast mitochondria głównie od dawczyni oocytu. Niewielka ilość mitochondriów może zostać wniesiona wraz z komórką dawcy, zwłaszcza przy fuzji całej komórki, co prowadzi czasem do heteroplazmii.

Aktywacja oocytu musi zastąpić sygnał plemnika

W zapłodnieniu oscylacje wapnia zwalniają oocyt z MII. W SCNT plemnika nie ma, więc potrzebny jest bodziec aktywujący. Elektryczny lub chemiczny sygnał ma obniżyć aktywność MPF, pozwolić na przebudowę jądra i rozpocząć cykle zarodkowe.

Z punktu widzenia rachunku chromosomów krytyczne jest to, czy aktywowany układ:

  • odrzuca dodatkowy materiał do struktury podobnej do ciałka kierunkowego;
  • zatrzymuje cały genom dawcy;
  • rozpoczyna replikację przed pierwszym podziałem;
  • tworzy prawidłowe wrzeciono.

„Aktywacja” nie jest synonimem „zapłodnienia bez plemnika”. Naśladuje część sygnału komórkowego, ale nie wnosi ojcowskiego genomu, centrosomu w gatunkach, w których dostarcza go plemnik, ani innych składników gamety. W SCNT genom jest już diploidalny, więc celem nie jest dołączenie drugiego haploidalnego zestawu.

Gdzie w praktyce może popsuć się rachunek SCNT

Nieprawidłowa ploidalność może powstać kilkoma odrębnymi drogami:

  1. Niepełna enukleacja. Chromosomy biorcy pozostają i dołączają do diploidalnego genomu dawcy.
  2. Utrata części genomu dawcy. Manipulacja, przedwczesna kondensacja lub nieprawidłowe wrzeciono gubi chromosom albo fragment.
  3. Niewłaściwa replikacja. Jądro będące w S lub G2 nie zostaje poprawnie dopasowane do programu cytoplazmy.
  4. Odrzucenie materiału po aktywacji. Część chromosomów dawcy trafia do struktury przypominającej ciałko kierunkowe, choć cały diploidalny zestaw miał pozostać.
  5. Nieudana cytokineza. Jądra potomne powstają, ale komórka nie dzieli cytoplazmy i zachowuje zwielokrotnioną zawartość.
  6. Błąd późniejszej mitozy. Pierwszy podział jest prawidłowy, lecz następny tworzy aneuploidalną linię i mozaikę.

Te mechanizmy dają różne przewidywania. Pozostawienie chromosomów oocytu może utworzyć układ o nadmiarowym zestawie pochodzenia matczynego biorcy. Błąd jednej późnej mitozy powinien być obecny tylko w części blastomerów. Nieudana cytokineza zwiększa całe zestawy, podczas gdy zgubienie opóźnionego chromosomu daje aneuploidię.

Dlatego diagnoza nie powinna kończyć się stwierdzeniem „zarodek był poliploidalny”. Trzeba powiązać skład chromosomowy z obserwacją enukleacji, czasem aktywacji, obecnością struktur podobnych do ciałek kierunkowych, liczbą pronukleusów lub jąder i historią kolejnych podziałów.

Jak mierzy się fazę cyklu i ploidalność

Fazy nie rozpoznaje się wiarygodnie tylko po kształcie komórki. Stosuje się zestaw uzupełniających metod.

Pomiar całkowitej ilości DNA

Barwnik wiążący DNA daje sygnał w przybliżeniu proporcjonalny do ilości materiału. W cytometrii przepływowej populacja G0/G1 tworzy pik 2C, komórki G2/M pik 4C, a faza S wypełnia obszar między nimi. Taki histogram nie odróżnia G0 od G1 ani G2 od mitozy.

Pomiar ma pułapki:

  • dwa sklejone jądra lub dwie komórki przechodzące razem przez wiązkę mogą wyglądać jak pojedynczy obiekt 4C;
  • fragmenty i martwe komórki tworzą sygnał poniżej 2C;
  • agregaty, autofluorescencja i nasycenie detektora zniekształcają rozkład;
  • populacja aneuploidalna może mieć pik przesunięty względem kontroli;
  • mitochondrialne DNA zwykle nie jest głównym składnikiem interpretowanego piku, ale sposób przygotowania próbki ma znaczenie.

Dlatego stosuje się bramkowanie singletów na podstawie wysokości, pola i szerokości impulsu oraz kontrolę o znanej zawartości DNA.

Wbudowanie znakowanego nukleozydu

EdU lub BrdU wbudowuje się do nowo syntetyzowanego DNA, dzięki czemu bezpośrednio oznacza komórki prowadzące replikację w czasie ekspozycji. Krótki impuls mówi, które komórki były wtedy w S; eksperyment pulse–chase pozwala śledzić ich dalszy los.

Obecność EdU nie mówi sama, czy cały genom został prawidłowo skopiowany. Znakowanie może również wykrywać syntezę związaną z naprawą, jeżeli projekt i czułość pomiaru tego nie rozdzielają.

Markery białkowe i obrazowanie

Ki-67 występuje w aktywnie cyklicznych komórkach, ale nie jest prostym zegarem pojedynczej fazy. Fosforylacja histonu H3 jest używana jako marker komórek mitotycznych. Cykliny zmieniają stężenie w czasie, a białka reporterowe FUCCI pozwalają obserwować przejścia faz w żywych komórkach.

W oocycie stadium ocenia się również morfologicznie:

  • obecność pęcherzyka zarodkowego wskazuje profazę I;
  • jego zanik świadczy o wznowieniu mejozy;
  • pierwsze ciałko kierunkowe jest praktycznym wskaźnikiem przejścia przez mejozę I;
  • wrzeciono MII można obrazować metodami optycznymi lub po utrwaleniu znakować immunofluorescencyjnie.

Każdy wskaźnik ma ograniczenia. Ciałko kierunkowe może się przesunąć lub ulec fragmentacji, a jego obecność nie dowodzi prawidłowego składu chromosomowego oocytu.

Kariotyp, liczba kopii i sekwencjonowanie

Kariotyp metafazowy pokazuje liczbę i duże zmiany struktury chromosomów, ale wymaga komórek zdolnych wejść w mitozę i bada ograniczoną liczbę metafaz. FISH zlicza wybrane regiony. Mikromacierze i sekwencjonowanie mogą wykrywać zmiany liczby kopii z większą rozdzielczością, lecz uśrednienie populacji może ukryć rzadki subklon.

W zarodku lub linii po SCNT pytanie „czy jest diploidalny?” należy zatem rozbić:

  • czy całkowita ilość DNA odpowiada 2C w G1;
  • czy liczba każdego chromosomu jest prawidłowa;
  • czy nie ma mozaiki różnych kariotypów;
  • czy nie powstały rearanżacje lub duże zmiany liczby kopii;
  • czy wynik utrzymuje się po dalszych podziałach.

Aneuploidia, poliploidia i mozaikowatość

Aneuploidia oznacza brak lub nadmiar pojedynczych chromosomów, na przykład trisomię. Poliploidia oznacza zwielokrotnienie całych zestawów, na przykład 3n lub 4n. Mozaikowatość oznacza współistnienie co najmniej dwóch linii komórkowych o różnym genotypie w jednym organizmie lub materiale.

Błąd mejozy I może wysłać oba homologi do tej samej komórki. Błąd mejozy II lub mitozy może nie rozdzielić chromatyd siostrzanych. Opóźniony chromosom może pozostać poza głównym jądrem i utworzyć mikrojądro. Nieudana cytokineza może pozostawić jedną komórkę z podwojonym zestawem.

Pierwsze podziały zarodka są szczególnie ważne, ponieważ pojedynczy błąd może zasilić dużą część późniejszego organizmu. Jeżeli wydarzy się po pierwszej mitozie tylko w jednej blastomerze, powstaje mozaika. Ocena kilku komórek nie zawsze opisuje cały zarodek.

Nie każda poliploidia jest chorobą. Niektóre dojrzałe tkanki ssaków fizjologicznie zawierają komórki poliploidalne lub wielojądrowe, między innymi część hepatocytów i megakariocyty. Taka specjalizacja nie oznacza jednak, że poliploidalny zarodek jest prawidłowy. Znaczenie zależy od typu komórki i etapu rozwoju.

Dziesięć zdań, które warto umieć poprawić

Skrót Precyzyjniejsza wersja
„DNA zamienia się w chromosomy podczas podziału” DNA zawsze jest zorganizowane w chromosomy; podczas mitozy chromosomy silnie się kondensują.
„Po replikacji liczba chromosomów się podwaja” Podwaja się ilość DNA i liczba chromatyd, a ploidalność pozostaje 2n.
„Haploidalna komórka ma połowę DNA komórki diploidalnej” Zależy od fazy: oocyt MII 1n, 2C ma podobną ilość DNA jak komórka somatyczna G1 2n, 2C.
„Mejoza to dwie mitozy” Mejoza I rozdziela homologi po ich sparowaniu i rekombinacji; dopiero mejoza II przypomina mitozę.
„Oocyt MII ma jednochromatydowe chromosomy” Ma haploidalny zestaw zreplikowanych chromosomów: 1n, 2C.
„W zapłodnieniu dwa jądra zlewają się od razu” Najpierw powstają dwa pronukleusy, które przygotowują wspólną pierwszą mitozę.
„Enukleacja usuwa całe DNA oocytu” Usuwa chromosomy wrzeciona; mitochondrialne DNA pozostaje w cytoplazmie.
„Jądro z dowolnej fazy można po prostu włożyć do oocytu” Trzeba skoordynować stan replikacji dawcy z cyklem cytoplazmy biorcy.
„G0 to martwa albo nieaktywna komórka” G0 oznacza wyjście z aktywnego cyklu; komórka może być metabolicznie aktywna i czasem zdolna do powrotu.
„Prawidłowy pik 2C dowodzi prawidłowego genomu” Ilość DNA nie wyklucza zbilansowanych zmian, aneuploidii o podobnej masie ani małego subklonu.

Rachunek kontrolny dla czterech sytuacji

Zwykła proliferacja fibroblastu

Fibroblast G1: 2n, 2C. Po replikacji: 2n, 4C. Po rozdzieleniu chromatyd i cytokinezie: dwie komórki 2n, 2C. Ploidalność nie zmienia się.

Powstanie gamety żeńskiej

Pierwotny oocyt po replikacji: 2n, 4C. Po mejozie I oocyt MII: 1n, 2C, a drugi zestaw trafił do pierwszego ciałka kierunkowego. Po aktywacji i mejozie II: żeński pronukleus 1n, 1C.

Zapłodnienie

Pronukleus żeński 1n, 1C plus męski 1n, 1C daje łącznie 2n, 2C. Po replikacji obu genomów zygota ma łącznie 2n, 4C, a pierwsza mitoza tworzy dwie blastomery 2n, 2C.

Typowe SCNT

Enukleowany oocyt nie wnosi chromosomowego zestawu. Jądro dawcy G0/G1 wnosi 2n, 2C. Po aktywacji i replikacji powstaje 2n, 4C, a po pierwszym podziale dwie blastomery 2n, 2C. Mitochondria nadal pochodzą głównie z oocytu.

Dlaczego ta wiedza jest praktyczna także poza SCNT

W hodowli komórkowej rozkład faz pomaga ocenić proliferację, stres i skutki leku. W edycji genomu faza wpływa na dostępność szlaków naprawy. W onkologii aneuploidia i niestabilność chromosomowa są częścią ewolucji guza. W biologii rozrodu prawidłowa segregacja chromosomów warunkuje zdolność gamety i zarodka do dalszego rozwoju.

W analizie pojedynczych komórek geny cyklu mogą dominować nad interesującą różnicą tożsamości. Dwie grupy w przestrzeni transkryptomicznej mogą okazać się komórkami tego samego typu w G1 i G2/M. „Usunięcie efektu cyklu” może pomóc w adnotacji, ale może też skasować rzeczywisty sygnał biologiczny, jeżeli badane zjawisko dotyczy proliferacji.

W produkcji komórkowej tempo podziału wpływa na wydajność, lecz szybki wzrost nie jest zawsze zaletą. Może oznaczać selekcję subklonu, utratę dojrzałości albo wzrost ryzyka niestabilności. Liczenie komórek bez informacji o cyklu, żywotności i tożsamości daje tylko część obrazu.

Co trzeba zapamiętać przed dalszą lekturą

  1. Chromosom liczy się według centromeru, a nie według liczby ramion widocznych na rysunku.
  2. Replikacja zmienia C, ale nie n.
  3. Mitoza rozdziela chromatydy siostrzane i zwykle zachowuje ploidalność.
  4. Mejoza I rozdziela homologi, a mejoza II chromatydy.
  5. Oocyt MII jest 1n, 2C, nie 1n, 1C.
  6. Zapłodnienie łączy dwa haploidalne genomy, a SCNT wprowadza już diploidalny genom somatyczny.
  7. W SCNT faza dawcy i stan cytoplazmy biorcy muszą być skoordynowane.
  8. Prawidłowa ilość DNA nie dowodzi prawidłowej sekwencji, struktury chromosomów ani epigenomu.

Następnym krokiem może być Od zygoty do blastocysty, gdzie rachunek chromosomów zostaje połączony z pierwszymi decyzjami rozwojowymi. Czytelnik zainteresowany techniką transferu może przejść do SCNT krok po kroku, a następnie do Oocytu jako maszyny do przeprogramowania.