Streszczenie

Plazmid nie jest synonimem genu ani pojedynczej kasety ekspresyjnej. Jest fizyczną cząsteczką DNA zawierającą moduły potrzebne do namnażania w określonym gospodarzu, selekcji, identyfikacji i wykonania zaplanowanej funkcji. Kaseta ekspresyjna stanowi tylko część konstruktu: obejmuje elementy sterujące powstaniem właściwego RNA, jego obróbką i — jeśli ma kodować białko — translacją. Wektor opisuje rolę nośnika w procesie, a nie jedną formę materiału.

Dobry projekt zaczyna się od endpointu: jaka cząsteczka ma powstać, w jakiej komórce, przez jak długi czas, w jakiej ilości i z jakim rozkładem między komórkami. Dopiero potem dobiera się promotor, ORF, UTR, sygnał poliadenylacji, sposób współekspresji, marker, replikon i backbone. Silniejszy promotor, wyższa liczba kopii i dłuższa ekspresja nie są automatycznie lepsze. Mogą nasilać toksyczność, obciążenie komórki, niestabilność, odpowiedź immunologiczną lub różnicę między reporterem i właściwym produktem.

W edycji genomu plazmid może kodować Cas, guide, donor albo elementy systemu produkcji wektora. Ostatecznym produktem nie musi być jednak sam plazmid: może nim być RNA, RNP, cząstka wirusowa albo zmodyfikowana komórka. Dlatego mapa konstruktu, mapa procesu i specyfikacja produktu są trzema odrębnymi dokumentami.

Cztery pojęcia, których nie należy mieszać

Plazmid jest zwykle kolistą, pozachromosomową cząsteczką DNA zdolną do utrzymania się w określonym gospodarzu dzięki origin of replication. Naturalne plazmidy niosą własne funkcje biologiczne; plazmid laboratoryjny jest zaprojektowanym układem modułów.

Wektor to nośnik używany do przeniesienia, utrzymania lub ekspresji sekwencji. Plazmid może być wektorem klonującym, ekspresyjnym, transferowym lub donorowym. Wektor może też mieć postać cząstki wirusowej, transpozonu, sztucznego chromosomu albo innego systemu.

Backbone oznacza część konstruktu pozostającą po oddzieleniu właściwego insertu lub kasety. Zwykle obejmuje bakteryjny ori, marker selekcyjny i elementy potrzebne do propagacji. Granica między backbone i insert jest umowna oraz zależy od zastosowania.

Kaseta ekspresyjna jest funkcjonalnym blokiem prowadzącym od regulacji transkrypcji do określonego RNA. Dla mRNA typowo obejmuje promotor, 5′ UTR, sekwencję kodującą, 3′ UTR i sygnał kończenia oraz poliadenylacji. Dla sgRNA ma inny promotor, strukturę transkryptu i terminator.

Zdanie „wprowadzono wektor CRISPR” nie odpowiada zatem na podstawowe pytania: czy komórka dostała plazmidowe DNA, wektor wirusowy, mRNA czy RNP; czy guide i Cas były na jednym konstrukcie; czy ekspresja była przejściowa; czy DNA mogło się integrować i czego szukano po zakończeniu procesu.

Plazmid składa się z modułów propagacji w gospodarzu i jednej lub wielu kaset funkcjonalnych. Promotor, UTR, ORF oraz terminacja opisują drogę do produktu, natomiast ori i marker nie są obojętnym tłem konstruktu.
Plazmid składa się z modułów propagacji w gospodarzu i jednej lub wielu kaset funkcjonalnych. Promotor, UTR, ORF oraz terminacja opisują drogę do produktu, natomiast ori i marker nie są obojętnym tłem konstruktu.

Rekombinowany plazmid połączył nośnik z nowym insertem

Historyczny przełom nie polegał na odkryciu, że bakterie mają plazmidy, lecz na zbudowaniu in vitro cząsteczki łączącej fragmenty z różnych źródeł, wprowadzeniu jej do gospodarza i wykazaniu, że zachowuje funkcję oraz może być namnażana. Doświadczenia Cohena, Chang, Boyer i Hellinga ustanowiły praktyczną logikę rekombinowanego DNA: zgodne końce, zamknięta cząsteczka, transformacja, selekcja i biologicznie funkcjonalny produkt.1

Współczesne metody składania są szybsze i bardziej modułowe, lecz nadal trzeba dowieść tych samych rzeczy:

  • powstała właściwa cząsteczka, a nie tylko produkt reakcji o oczekiwanym rozmiarze;
  • trafiła do właściwego gospodarza;
  • zachowała się podczas propagacji;
  • pełna sekwencja odpowiada projektowi;
  • wykonuje zaplanowaną funkcję.

Kolonia jest klonem komórkowym wybranym przez marker, nie automatycznym certyfikatem konstruktu. Sam fakt, że bakteria rośnie, może nawet preferować wariant z delecją toksycznego elementu.

Mapa kołowa nie pokazuje całej biologii

Popularna mapa plazmidu przedstawia strzałki i kolorowe łuki wokół okręgu. Jest użyteczna, ale upraszcza co najmniej pięć warstw:

  1. dokładną sekwencję i orientację każdego elementu;
  2. kontekst gospodarza, w którym element jest aktywny;
  3. transkrypty powstające przez read-through lub promotory ukryte;
  4. topologię i liczbę kopii cząsteczki;
  5. stan faktycznej partii, który może różnić się od pliku projektowego.

Element oznaczony jako „CMV promoter” może mieć inną długość, mutacje albo dodatkowy enhancer niż element o tej samej skróconej nazwie w innym plazmidzie. „SV40 polyA” nie identyfikuje automatycznie wszystkich granic funkcjonalnych. Nazwa ORF bez wersji sekwencji nie rozstrzyga, czy użyto konkretnej izoformy, optymalizacji kodonów, tagu albo mutacji.

Dlatego minimalny opis konstruktu zawiera:

  • pełną sekwencję w jawnej orientacji;
  • wersjonowany plik GenBank lub równoważny;
  • listę cech z dokładnymi współrzędnymi;
  • przewidywane transkrypty i białka;
  • historię zmian względem konstruktu rodzicielskiego;
  • identyfikator fizycznej partii;
  • wynik potwierdzenia sekwencji.

Artykuł Addgene i repozytoria materiału rozwija identyfikatory, MTA, depozyt, propagację, odbiór i kontrolę fizycznego materiału. Tutaj głównym pytaniem jest architektura biologiczna konstruktu.

Replikon określa, gdzie plazmid jest plazmidem

Origin of replication nie jest uniwersalnym symbolem „DNA będzie się kopiować”. Działa z określoną maszynerią gospodarza i mechanizmem kontroli liczby kopii. Bakteryjny ori umożliwia propagację konstruktu w odpowiednim szczepie, lecz zwykle nie zapewnia autonomicznej replikacji w komórce ssaka.

Wybór replikonu wpływa na:

  • zakres gospodarzy;
  • orientacyjną liczbę kopii;
  • stabilność dużych lub powtarzalnych sekwencji;
  • obciążenie metaboliczne;
  • kompatybilność z innymi plazmidami;
  • ilość DNA możliwą do uzyskania;
  • udział form monomerycznych, multimerów i rearanżacji.

Wysokokopijny backbone może ułatwić przygotowanie DNA, ale pogorszyć stabilność toksycznego insertu lub powtórzeń. Niskokopijny system daje mniej materiału, lecz może zachować konstrukcję, która w innym tle jest selekcjonowana do delecji. Addgene podkreśla, że wybór ori należy łączyć z gospodarzem, oczekiwaną liczbą kopii i kompatybilnością.9

Plazmid może mieć więcej niż jeden replikon. Shuttle vector jest zaprojektowany do pracy w różnych gospodarzach, na przykład w E. coli i drożdżach. Episomalny wektor dla komórek ssaka może zawierać dodatkowy system utrzymania. Obecność takiego elementu nie gwarantuje identycznej liczby kopii ani równomiernego rozdziału do komórek potomnych.

Selekcja utrzymuje presję, nie dowodzi poprawności

Marker bakteryjny pozwala wzbogacić populację komórek niosących konstrukty zdolne do przeżycia w danym warunku. Nie dowodzi, że:

  • insert ma właściwą sekwencję;
  • plazmid zachował pełną długość;
  • każda komórka ma tę samą liczbę kopii;
  • nie powstał rearanżowany wariant zachowujący marker;
  • nie współistnieją różne konstrukty.

Marker w komórkach eukariotycznych pełni odrębną funkcję i wymaga własnego promotora lub współekspresji. Marker bakteryjny nie musi działać w komórce ssaka, a gen selekcyjny dla komórek ssaka nie musi zapewniać propagacji w bakterii.

W projekcie trzeba odróżnić:

  • selekcję pozytywną, wzbogacającą komórki z określoną cechą;
  • selekcję negatywną, usuwającą komórki zachowujące niepożądany element;
  • reporter, dostarczający sygnału pomiarowego;
  • marker identyfikacyjny, pozwalający rozpoznać konstrukcję;
  • gen oporności, który może pełnić różne role zależnie od gospodarza.

Reporter i produkt nie muszą być współmierne. Komórka fluorescencyjna może otrzymać reporter, lecz za mało edytora; przy dwóch plazmidach mogła pobrać tylko jeden. Stabilna fluorescencja może utrzymywać się dłużej niż aktywność właściwego białka. Selekcja zmienia skład populacji i dlatego musi być uwzględniona w mianowniku „wydajności”.

Promotor musi pasować do polimerazy i produktu RNA

Promotor nie jest ogólnym „włącznikiem genu”. Określa, która polimeraza i zestaw czynników mogą rozpocząć transkrypcję, gdzie powstaje koniec 5′ oraz jak ekspresja zależy od komórki i stanu.

Dla eukariotycznego mRNA używa się promotora rozpoznawanego przez RNA polymerase II. Transkrypt może otrzymać czapeczkę, przejść splicing i poliadenylację. Małe RNA, takie jak klasyczne sgRNA, są często transkrybowane z promoterów Pol III. Ich początek, koniec i tolerancja dodatkowych nukleotydów różnią się od mRNA. Addgene ujmuje tę różnicę praktycznie: promotor trzeba dobrać zarówno do gospodarza, jak i typu potrzebnego RNA.2

„Silny promotor” jest relacją, nie stałą. CMV może dawać wysoką ekspresję w wielu liniach, lecz podlegać wyciszeniu albo działać nierówno w komórkach pierwotnych i po różnicowaniu. EF1α, PGK, CAG i promotory tkankowe mają inne profile. Wynik zależy od:

  • typu i stanu komórki;
  • liczby kopii oraz miejsca integracji;
  • chromatyny;
  • metylacji;
  • wielkości i składu transkryptu;
  • odpowiedzi interferonowej lub stresowej;
  • czasu od dostarczenia.

Promotor indukowalny dodaje regulator, ligand i krzywą dawka–odpowiedź. „Wyłączony” stan może mieć leakiness, a maksymalny stan zależy od ilości regulatora. System indukowalny trzeba charakteryzować jako całość, nie tylko podać nazwę operatora.

Enhancer i promotor tworzą kontekst

Enhancer może zwiększać transkrypcję z odległości i działać zależnie od typu komórki. W wektorze niewielka odległość między kasetami może prowadzić do nieplanowanych oddziaływań:

  • enhancer jednej kasety aktywuje drugi promotor;
  • promotory konkurują o czynniki;
  • transkrypcja read-through wchodzi w sąsiedni moduł;
  • powtarzalne promotory sprzyjają rekombinacji;
  • orientacja kaset powoduje transkrypcję zbieżną albo rozbieżną.

Dwie kasety, które działają poprawnie osobno, mogą interferować po połączeniu. Przy wielokasetowym konstrukcie warto przewidzieć wszystkie kierunki transkrypcji, końce i potencjalne produkty fuzyjne. Izolator może ograniczyć część wpływu enhancera lub chromatyny, lecz nie jest absolutną ścianą. Klasyczne badania elementu cHS4 pokazały aktywność boundary/insulator w określonym kontekście, nie uniwersalne odcięcie każdego promotora.8

Początek transkrypcji wpływa na tożsamość produktu

Dla mRNA kilka dodatkowych nukleotydów w 5′ UTR może zmienić strukturę, translację albo utworzyć upstream AUG. Dla sgRNA dodatkowy nukleotyd narzucony przez promotor może wpływać na aktywność i swoistość. Dla RNA o aktywności enzymatycznej końce bywają częścią funkcji.

Jeśli wymagany jest precyzyjny koniec RNA, stosuje się rozwiązania przetwarzające transkrypt, na przykład rybozymy albo elementy rozcinane przez określone enzymy. Wtedy końcowym produktem nie jest transkrypt pierwotny, lecz cząsteczka po obróbce, a test powinien mierzyć właściwe końce.

Wektor kodujący kilka guide może wykorzystywać osobne promotory albo jeden prekursor rozdzielany przez tRNA, rybozymy lub nukleazy RNA. Każda strategia ma inne ryzyko:

  • powtarzalne promotory zwiększają homologię;
  • processing może być niepełny;
  • guide mogą powstawać w różnych ilościach;
  • resztkowe nukleotydy mogą zmieniać aktywność;
  • kolejność elementów może wpływać na stabilność prekursora.

5′ UTR i kontekst startu regulują translację

Rybosom nie rozpoczyna translacji automatycznie przy pierwszym wpisanym ATG. W eukariotycznym mRNA znaczenie mają czapeczka, struktura 5′ UTR, upstream ORF i kontekst nukleotydów otaczających kodon start. Prace Kozak wykazały silny wpływ sekwencji bezpośrednio wokół AUG na inicjację w komórkach eukariotycznych.3

Projekt musi sprawdzić:

  • czy przed właściwym startem nie ma dodatkowego AUG;
  • czy sekwencja klonowania nie utworzyła uORF;
  • czy tag lub signal peptide pozostaje w ramce;
  • czy start odpowiada właściwej izoformie;
  • czy 5′ UTR nie zawiera niepożądanego splice site;
  • czy struktura RNA nie ogranicza skanowania.

Optymalizacja sekwencji kodującej bez kontroli UTR może nie poprawić ekspresji. Z kolei bardzo wysoka translacja może zwiększyć agregację, niewłaściwe fałdowanie i toksyczność.

ORF jest projektem białka, nie samą nazwą genu

„Cas9”, „TP53” albo „GFP” nie identyfikuje sekwencji. ORF powinien mieć jawnie określone:

  • organizm i izoformę;
  • wariant aminokwasowy;
  • optymalizację kodonów;
  • sygnały lokalizacji;
  • tagi i linkery;
  • peptyd sygnałowy lub domenę transmembranową;
  • miejsce stop;
  • mutacje funkcjonalne;
  • elementy 2A albo miejsca proteolizy.

Optymalizacja kodonów może zwiększyć ekspresję w określonym gospodarzu, ale zmienia także GC, strukturę RNA, motywy splicingowe, powtórzenia i możliwość syntezy. Sekwencje kodujące to samo białko nie są równoważne na poziomie DNA i RNA. W badaniu immunologicznym mogą mieć odmienny profil CpG; w wektorze wirusowym odmienną stabilność; w bakterii inne tempo translacji i fałdowanie.

Tag może ułatwić oczyszczanie lub lokalizację, lecz zmienić aktywność, czas półtrwania i położenie białka. N-terminalny tag może kolidować z peptydem sygnałowym, a C-terminalny z sygnałem peroksysomalnym albo domeną regulatorową. Kontrola z białkiem bez tagu lub z tagiem w alternatywnej pozycji pomaga oddzielić funkcję produktu od wygody pomiaru.

Sygnał lokalizacji jest częścią dawki funkcjonalnej

Białko obecne w komórce nie musi dotrzeć do miejsca działania. Cas9 i edytory DNA potrzebują dostępu do jądra; białko wydzielane wymaga prawidłowego wejścia do szlaku sekrecyjnego; receptor musi trafić do błony.

Nuclear localization signal może zwiększyć udział białka w jądrze, ale liczba, pozycja i odsłonięcie NLS wpływają na transport. Duże edytory często mają więcej niż jeden sygnał. Reporter połączony z produktem nie zawsze odzwierciedla lokalizację po rozdzieleniu przez 2A.

W przypadku sekrecji peptyd sygnałowy jest odcinany i może działać odmiennie z różnymi białkami. Wektory kodujące przeciwciała muszą zgrać łańcuch ciężki i lekki, ich sekrecję oraz stosunek ilości. Sama suma mRNA nie opisuje poprawnie złożonego produktu.

Jedno mRNA może kodować kilka białek na różne sposoby

Najprostsze rozwiązanie to osobna kaseta dla każdego białka. Daje niezależną regulację, lecz zwiększa rozmiar i ryzyko interferencji promoterów.

IRES umożliwia wewnętrzną inicjację translacji drugiego cistronu. Klasyczne doświadczenia z sekwencją poliowirusa wykazały inicjację niezależną od czapeczki.6 W praktyce drugi cistron często ma niższą i bardziej zależną od komórki ekspresję. IRES jest stosunkowo duży, ale pozostawia dwa niepołączone białka.

Peptydy 2A powodują ribosome skipping: nie są proteazą i nie wykonują dosłownego samoprzecięcia. Upstream protein zachowuje większość sekwencji 2A na końcu, a downstream protein rozpoczyna się zwykle od proliny. Badania wielocistronowych konstruktów pokazały możliwość współekspresji kilku produktów z jednego ORF.5

2A nie gwarantuje idealnego rozdzielenia ani identycznego poziomu funkcjonalnego białek. Znaczenie mają:

  • rodzaj 2A i kontekst;
  • kolejność białek;
  • resztkowy ogon na upstream product;
  • N-terminalna prolina downstream product;
  • położenie signal peptide;
  • niepełny skipping i produkt fuzyjny;
  • odmienne czasy półtrwania.

Białko fuzyjne jest właściwe, gdy domeny mają działać razem, jak Cas9–deaminaza albo Cas9 nickase–RT. Linker nie jest neutralnym odstępem: wpływa na geometrię, ruchliwość, fałdowanie i dostępność domen.

Reporter może być rozdzielony od produktu na kilka sposobów

Reporter fuzyjny informuje, że powstało białko połączone z produktem, ale może zmienić jego funkcję. Reporter po 2A wskazuje, że przetłumaczono wspólny ORF, lecz po rozdzieleniu ma inny czas półtrwania i lokalizację. Reporter za IRES może być słabszy i nieproporcjonalny. Osobna kaseta może ulec innej regulacji lub integracji.

Warto zdefiniować, co reporter ma mierzyć:

  • dostarczenie DNA;
  • aktywną transkrypcję;
  • translację pełnej długości;
  • lokalizację;
  • aktywność enzymatyczną;
  • przeżycie komórki;
  • obecność pożądanego allelu.

GFP nie jest dowodem edycji. Reporter surrogate może korelować z ekspozycją na edytor, ale korelację trzeba zmierzyć. Selekcja najbardziej fluorescencyjnych komórek może wybierać najwyższą dawkę, a wraz z nią większą toksyczność lub off-target.

3′ UTR, terminacja i poly(A) wpływają na ilość RNA

Po ORF pozostaje część regulacyjna. 3′ UTR może zawierać miejsca wiązania białek i miRNA, elementy stabilności oraz lokalizacji. Sygnał polyadenylation uczestniczy w cięciu pre-mRNA, dodaniu ogona poly(A) i terminacji transkrypcji.

Słaby lub niewłaściwie umieszczony sygnał może prowadzić do:

  • read-through do backbone;
  • heterogenicznych końców;
  • transkryptów fuzyjnych z sąsiednią kasetą;
  • zmienionej stabilności;
  • interferencji z kolejnym promotorem.

Terminatory bakteryjne i eukariotyczne sygnały poly(A) nie są zamienne. Addgene zwraca uwagę, że terminator wpływa nie tylko na zakończenie transkrypcji, ale pośrednio na stabilność RNA i poziom ekspresji.4

WPRE bywa stosowany do zwiększenia ilości i wykorzystania transkryptu w części wektorów. Nie jest zwykłym „wzmacniaczem ekspresji” niezależnym od kontekstu; ma pochodzenie wirusowe, istnieją różne wersje i należy rozważyć niepożądane ORF oraz wymagania bezpieczeństwa. Pierwotne prace pokazały wzrost ekspresji transgenu w konkretnych konstrukcjach lentiwirusowych.7

Kaseta Pol III dla guide ma inne reguły niż kaseta mRNA

U6 i H1 są często używane do sgRNA, lecz narzucają własne cechy początku i terminacji. Pol III kończy transkrypcję przy odpowiednim ciągu tymin w DNA, dlatego sekwencja guide i scaffold mogą wpływać na przedwczesne zakończenie. Promotor może preferować określoną pierwszą zasadę.

Projekt powinien sprawdzić:

  • dokładny koniec 5′ guide;
  • wewnętrzne motywy terminacyjne;
  • zgodność scaffold z użytym Cas;
  • powtarzalność przy kilku kasetach;
  • możliwość rekombinacji;
  • rzeczywisty poziom każdego guide;
  • ślad po przetwarzaniu, jeśli guide powstają z prekursora.

Kaseta guide i kaseta Cas na jednym plazmidzie zwiększają współdostarczenie, lecz konstrukcja jest większa. Rozdzielenie ich na dwa plazmidy ułatwia modułowość, ale tworzy populacje z jednym składnikiem i wymaga jawnego modelu cotransfection.

Donor jest nośnikiem informacji i potencjalnym insertem

W projekcie HDR donor zawiera zmianę oraz ramiona homologii. Może być oligonukleotydem, liniowym DNA albo plazmidem. Plazmid donorowy ma elementy potrzebne do propagacji w bakterii, które zwykle nie powinny znaleźć się w docelowym locus.

Trzeba odróżnić:

  • poprawną integrację obu złączy;
  • integrację jednego złącza;
  • częściową kopię donora;
  • tandemowe kopie;
  • wbudowanie backbone;
  • integrację losową;
  • pozostanie episomalnego DNA;
  • amplifikację sygnału przez nieintegrowany donor.

PCR przez lewe i prawe złącze nie dowodzi, że oba występują na tej samej cząsteczce ani że pomiędzy nimi jest jedna kompletna kopia. Pełna kwalifikacja knock-inu wymaga szerszego pomiaru struktury, zgodnie z Naprawą DNA po edycji genomu.

Plazmid transferowy nie jest gotowym wektorem wirusowym

W systemie wirusowym plazmid transferowy zawiera ładunek i cis-acting elements wymagane do pakowania, integracji lub utrzymania. Osobne helper/packaging plasmids dostarczają funkcje produkcyjne. Po współwprowadzeniu do komórki producenta powstaje cząstka o właściwościach niewynikających z samej mapy transfer plasmid.

Trzy poziomy należy opisać osobno:

  1. plazmidy produkcyjne — ich sekwencja, czystość i stosunek w procesie;
  2. partia wektora — liczba cząstek, funkcjonalny titer, pełne/puste cząstki, zanieczyszczenia;
  3. zmodyfikowana komórka — liczba kopii, miejsca integracji, ekspresja i fenotyp.

Numer plazmidu nie identyfikuje partii wirusa. To samo DNA transferowe może dać partie o różnej aktywności i zanieczyszczeniach. Szczegółowe porównanie systemów dostarczania należy do osobnego artykułu o wektorach wirusowych i niewirusowych.

Topologia DNA zmienia zachowanie i pomiar

Kolisty plazmid może występować jako supercoiled, open circular/nicked, linear, dimer lub wyższy multimer. Te formy migrują inaczej w żelu i mogą różnić się wydajnością transfekcji oraz podatnością na degradację.

Jedno pasmo po linearyzacji potwierdza przybliżony rozmiar, ale nie pełną sekwencję. Kilka pasm nieciętego DNA może oznaczać topologie tej samej cząsteczki, nie różne konstrukty. Artykuł Elektroforeza i dokumentacja żeli rozwija ten problem pomiarowy.

W zastosowaniach wymagających wysokiej jakości istotne są także:

  • udział supercoiled;
  • nicked i linear DNA;
  • multimery;
  • genomic DNA gospodarza;
  • RNA;
  • białko;
  • endotoksyna;
  • residual antibiotics i odczynniki;
  • bioburden lub sterylność zależnie od zastosowania.

Stężenie zmierzone absorbancją nie rozstrzyga tożsamości ani topologii. „Czyste DNA” jest specyfikacją wielu cech, nie jedną wartością A260/A280.

Sekwencja projektowa, klon i partia to trzy obiekty

Plik komputerowy opisuje zamiar. Pojedyncza kolonia reprezentuje potomstwo jednej komórki, ale może zawierać zmieniony plazmid. Preparatyka jest partią materiału uzyskaną z konkretnej hodowli.

Łańcuch identyfikowalności powinien prowadzić:

projekt → synteza/assembly → transformacja → kolonia → stock → hodowla → preparatyka → zastosowanie

Na każdym etapie mogą wystąpić:

  • pomylenie próbek;
  • mutacja;
  • delecja powtórzeń;
  • rekombinacja;
  • kontaminacja innym plazmidem;
  • selekcja wariantu mniej toksycznego;
  • różnica topologii i jakości.

Pełne sekwencjonowanie konstruktu jest coraz bardziej dostępne i szczególnie uzasadnione dla dużych, powtarzalnych oraz klinicznie istotnych plazmidów. Sanger z dwóch końców insertu nie kontroluje backbone ani zmian wewnątrz długiego ORF. FDA w wytycznych dla wektorów mikrobiologicznych wskazuje pełną sekwencję i anotację ORF oraz elementów regulatorowych dla odpowiednich genetycznie zmodyfikowanych plazmidów do 50 kb.11 Jest to kontekst regulacyjny, nie uniwersalny próg badawczy, lecz dobrze ilustruje wagę pełnej tożsamości.

Projekt konstruktu powinien mieć specyfikację przed złożeniem

Przed wyborem metod klonowania warto zapisać:

Produkt
  • jakie RNA i białka mają powstać;
  • ich dokładne końce, izoformy, tagi i lokalizacja;
  • oczekiwany stosunek produktów;
  • czas oraz komórki ekspresji.
Architektura
  • liczba kaset i kierunki transkrypcji;
  • promotory, enhancery, UTR i terminatory;
  • IRES, 2A, linkery i processing;
  • ori, markery i host range;
  • sekwencje potrzebne do produkcji wektora.
Ryzyko
  • powtórzenia i niestabilność;
  • toksyczność w gospodarzu propagacyjnym;
  • ukryte ORF i promotory;
  • read-through;
  • możliwość integracji backbone;
  • geny oporności oraz elementy pochodzenia wirusowego.
Dowód
  • pełna sekwencja;
  • test topologii i czystości;
  • pomiar każdego transkryptu;
  • białko pełnej długości i processing;
  • aktywność funkcjonalna;
  • brak elementów, które miały zaniknąć.

Jeśli nie można narysować przewidywanych transkryptów i białek, mapa plazmidu nie jest jeszcze wystarczająca.

Metoda składania zmienia połączenia, nie cel biologiczny

Klonowanie restrykcyjno-ligacyjne wykorzystuje rozpoznawane sekwencje i zgodne końce. Assembly oparte na homologicznych nakładkach łączy fragmenty według zaprojektowanych końców. Systemy typu Golden Gate używają enzymów tnących poza rozpoznawanym motywem, co pozwala zestawiać moduły w wybranej kolejności. Synteza DNA może dostarczyć większy fragment bez lokalnego PCR.

Wybór metody wpływa na:

  • obecność lub brak „scar” w złączu;
  • liczbę możliwych fragmentów;
  • swobodę orientacji;
  • ryzyko błędów PCR;
  • tolerancję powtórzeń i wysokiego GC;
  • możliwość automatyzacji;
  • koszt oraz czas.

Nie zmienia natomiast wymagań biologicznych. Promotor wstawiony odwrotnie pozostaje błędem niezależnie od elegancji assembly. Bezszwowe złącze może mieć prawidłową sekwencję, lecz tworzyć niepożądany splice site. Syntetyczny ORF może zgadzać się z zamówieniem i nadal kodować niewłaściwą izoformę.

Każda metoda tworzy charakterystyczne alternatywy:

  • pusty backbone po ponownym zamknięciu;
  • niewłaściwa kolejność fragmentów;
  • wielokrotna kopia;
  • brak jednego modułu;
  • mutacja w nakładce lub starterze;
  • chimera po PCR;
  • rearanżacja już po poprawnym złożeniu.

Screening należy zaprojektować do tych alternatyw. PCR kolonijny może odrzucić większość pustych konstrukcji, ale pełna sekwencja rozstrzyga tożsamość. W konstrukcie modułowym warto zachować maszynowo czytelną listę części i połączeń, aby kolejna wersja nie była opisana jako ręcznie zmieniony rysunek.

Stabilność można projektować, ale trzeba ją zmierzyć

Niestabilność nie jest wyłącznie wadą „trudnych bakterii”. Może wynikać z samej architektury:

  • długich bezpośrednich powtórzeń;
  • kilku identycznych promoterów lub scaffoldów;
  • struktur palindromowych;
  • toksycznego produktu wyrażanego nieszczelnie w gospodarzu;
  • bardzo dużego rozmiaru;
  • wysokiej liczby kopii;
  • sekwencji sprzyjających zatrzymaniu replikacji;
  • rekombinacji między homologicz­nymi modułami.

Redesign może użyć różnych synonimicznych sekwencji kodujących, różnych promoterów o podobnej funkcji, odmiennej orientacji kaset lub replikonu o mniejszej liczbie kopii. Każda zmiana może jednak wpływać na RNA, ekspresję albo regulację, więc „usunięcie powtórzenia” nie jest czysto informatyczne.

Stabilność ocenia się w czasie i w warunkach reprezentatywnych dla procesu. Jedna poprawna kolonia po krótkiej hodowli nie dowodzi, że konstrukcja zachowa się po większej ekspansji. Przy bankowaniu należy porównać sekwencję konstruktu przed i po założeniu banku, a w procesie produkcyjnym określić limit pokoleń lub pasaży poparty danymi.

Wieloguide constructs zasługują na szczególną uwagę: powtórzone promotory U6 i scaffolds mogą tworzyć substraty rekombinacji. Utrata jednej kasety może pozostawić marker i pozostałe guide, przez co standardowa selekcja nie wykryje problemu.

Cztery krótkie studia architektury

Przejściowa ekspresja Cas9 i jednego guide

Jeden plazmid zapewnia współdostarczenie, ale długo koduje aktywny kompleks. Reporter po 2A może pomóc wzbogacić komórki, lecz najwyższy sygnał oznacza najwyższą ekspozycję, niekoniecznie najlepszy stosunek produktu do off-target. Należy zmierzyć zanik plazmidu i białka oraz sprawdzić integrację sekwencji backbone.

Dwa białka o wymaganym stosunku

Osobne promotory pozwalają stroić każdy produkt, ale mogą interferować. IRES zwykle daje asymetrię upstream/downstream. 2A zbliża translację molową, lecz produkty mają różne reszty i czas półtrwania. Wybór wymaga pomiaru funkcjonalnych białek, nie tylko jednego wspólnego mRNA.

Knock-in reportera

Donor plazmidowy ma reporter pomiędzy ramionami homologii i backbone poza nimi. Pozytywna fluorescencja może pochodzić z prawidłowego locus, losowej integracji lub episomalnego donora. Genotypowanie musi połączyć oba złącza, strukturę całego insertu, liczbę kopii i brak backbone.

Biblioteka pooled

Każdy spacer jest projektem, a wspólny backbone i scaffold są stałe. Po syntezie rozkład wariantów nie jest równy. Transformacja, namnażanie i produkcja wektora wprowadzają kolejne bottlenecks. Kontrola sekwencjonowaniem na każdym krytycznym etapie odróżnia błąd projektu od utraty reprezentacji w procesie.

Odpowiedzialność zaczyna się przy sekwencji

Konstrukt może kodować białko toksyczne, oncogeniczne, immunomodulujące, czynnik wirulencji albo element umożliwiający produkcję cząstek. Bezpieczeństwo nie wynika z tego, że materiał jest „tylko plazmidem”.

Przed zamówieniem i pracą trzeba ustalić:

  • funkcję wszystkich ORF, także pomocniczych;
  • gospodarza i możliwy zakres hostów;
  • znaczenie markerów oporności;
  • możliwość mobilizacji lub pakowania;
  • poziom zabezpieczeń i zgodę instytucjonalną;
  • warunki transportu, dostępu i inaktywacji;
  • ograniczenia MTA, licencji i danych dawcy.

Nie każdy hipotetyczny ORF stanowi realne zagrożenie. Nie wolno też zakładać, że brak anotacji oznacza brak funkcji. Pełna lista elementów oraz kontekst użycia umożliwiają proporcjonalną ocenę przez osoby odpowiedzialne za biosafety.

Projekt Cas9 i guide na jednym konstrukcie

Kaseta Pol II może kodować Cas9 z NLS, tagiem lub reporterem, a kaseta Pol III — sgRNA. Zaletą jest współdostarczenie. Ograniczeniami są duży rozmiar, dłuższa ekspozycja i trudniejsze rozdzielenie dawki białka od guide.

Pytania kontrolne:

  • czy promotor Cas działa w docelowej komórce;
  • czy NLS znajduje się po właściwej stronie i pozostaje dostępny;
  • czy guide ma dokładne końce;
  • czy promotor Pol III nie interferuje z Pol II;
  • czy reporter rzeczywiście koreluje z kompletnym konstruktem;
  • czy DNA pozostaje po okresie potrzebnym do edycji;
  • czy test wykrywa przypadkową integrację backbone.

Plazmid jest wygodny w pracy badawczej, ale dla komórek terapeutycznych krótsza ekspozycja przez mRNA/RNP może mieć korzystniejszy profil. Jest to decyzja o produkcie i ryzyku, nie ocena, że DNA jest „gorszą technologią” w każdym zastosowaniu.

Konstrukty wieloguide i biblioteki wymagają reprezentacji

Pojedynczy plazmid z kilkoma guide jest innym obiektem niż pooled library, w której każdy wariant ma zwykle inny spacer. W bibliotece znaczenie mają:

  • liczba projektów;
  • rozkład ich obfitości;
  • bottleneck na etapie syntezy, klonowania i transformacji;
  • utrata spacerów toksycznych lub niestabilnych;
  • rekombinacja powtórzonych scaffoldów;
  • zgodność identyfikatora z sekwencją;
  • reprezentacja po każdej amplifikacji.

Średnia liczba kolonii na guide nie opisuje ogona rozkładu. Część elementów może zniknąć, choć całkowita liczba kolonii wygląda wystarczająco. Sekwencjonowanie puli przed użyciem jest pomiarem materiału wejściowego, a nie formalnością.

Przy kilku guide na jednej cząsteczce trzeba potwierdzić wszystkie spacery i ich kolejność. Krótkie reads mogą źle fazować powtarzalne kasety; długi odczyt całego plazmidu lepiej pokazuje delecje i przestawienia.

Minimalny pakiet kontroli funkcjonalnej

Poprawna sekwencja jest konieczna, lecz nie wystarcza. Dla konstruktu ekspresyjnego warto rozdzielić:

Warstwa Pytanie
DNA czy fizyczna cząsteczka zgadza się z projektem
RNA czy powstał właściwy transkrypt i końce
białko czy produkt ma pełną długość i lokalizację
aktywność czy wykonuje właściwą funkcję
populacja jaki odsetek komórek otrzymał pełny system
czas jak długo utrzymuje się ekspresja i materiał

RT-qPCR mierzący środek ORF nie wykrywa automatycznie nieprawidłowego końca. Western blot z tagiem może pokazać fragment zawierający tag, a nie pełne białko. Fluorescencja reportera nie dowodzi aktywności Cas. Test funkcjonalny bez kontroli ekspresji nie rozróżnia złego konstruktu od nieskutecznego dostarczenia.

W eksperymencie edycji dodatkowo mierzy się lokalny produkt, duże zmiany i off-target. Konstrukcja jest przyczyną ekspozycji, a allel — jednym z jej następstw.

Od plazmidu badawczego do materiału klinicznego

Plazmid użyty do wytwarzania produktu leczniczego staje się częścią kontrolowanego procesu. Wymagania obejmują pochodzenie, bank komórek, pełną sekwencję, stabilność, zanieczyszczenia, proces oczyszczania i testy zwolnienia. FDA w wytycznych CMC dla terapii genowych oczekuje opisu produkcji i oczyszczania wektorów, w tym plazmidów, oraz badań in-process adekwatnych do jakości produktu.10

Nie oznacza to, że każdy plazmid badawczy wymaga standardu GMP. Oznacza, że przejście do zastosowania klinicznego nie polega na wykonaniu większego miniprepu tego samego materiału. Zmieniają się:

  • źródła i kwalifikacja surowców;
  • konstrukcja markerów;
  • system banków;
  • skala i proces;
  • specyfikacje zanieczyszczeń;
  • metody analityczne;
  • kryteria stabilności;
  • dokumentacja zmian.

Element wygodny w laboratorium, na przykład określony gen oporności, może być niepożądany w procesie klinicznym. Redesign wymaga comparability: trzeba wykazać, że nowa konstrukcja i proces dają produkt o zachowanej funkcji i kontrolowanym profilu.

Najczęstsze błędy projektowe

„Wybraliśmy najsilniejszy promotor.”
Nie zdefiniowano wymaganej dawki, typu komórki ani kosztu nadekspresji.

„GFP potwierdza ekspresję Cas9.”
Zależy od architektury; osobna kaseta, IRES i 2A dają inne relacje między sygnałami.

„2A rozcina białko bez śladu.”
Ribosome skipping pozostawia reszty na obu produktach i może być niepełny.

„Plazmid jest nieintegrujący.”
Brak zaprojektowanego mechanizmu integracji nie oznacza zerowego prawdopodobieństwa losowego wbudowania DNA.

„Sekwencja insertu jest poprawna, więc konstrukcja jest poprawna.”
Backbone, połączenia, orientacja, liczba kopii i ukryte rearanżacje pozostają niezweryfikowane.

„Ten sam plazmid da ten sam wynik.”
Partia, topologia, czystość, komórka, dostarczenie i czas ekspozycji mogą być odmienne.

„Wektor wirusowy to plazmid w osłonce.”
Gotowa cząstka ma własną biologię, titer, ładunek, zanieczyszczenia i specyfikację.

Co trzeba zapamiętać

  • Plazmid jest fizyczną cząsteczką, kaseta ekspresyjna funkcjonalnym modułem, a wektor rolą w procesie.
  • Replikon, marker i backbone służą propagacji oraz selekcji, ale mogą wpływać na stabilność i produkt.
  • Promotor musi pasować do polimerazy, gospodarza, typu RNA i wymaganej dynamiki.
  • UTR, kontekst startu, terminator i poly(A) są częścią ekspresji, nie dekoracją wokół ORF.
  • IRES, 2A, białko fuzyjne i osobne kasety tworzą różne relacje między produktami.
  • Reporter mierzy tylko to, z czym jego architektura rzeczywiście go sprzęga.
  • Donor plazmidowy może wbudować się częściowo, wielokrotnie lub razem z backbone.
  • Plazmid transferowy, partia wektora wirusowego i zmodyfikowana komórka są odrębnymi materiałami.
  • Pełna sekwencja, topologia, czystość, RNA, białko i funkcja tworzą kolejne warstwy kwalifikacji.
  • Projekt należy zaczynać od oczekiwanego produktu i dowodu, a nie od gotowej mapy popularnego backbone.