Streszczenie

Mikroskop fluorescencyjny tworzy obraz z fotonów emitowanych przez fluorofory. W najczęstszej konfiguracji widefield całe pole jest oświetlane jednocześnie, a kamera rejestruje również światło pochodzące spoza płaszczyzny ostrości. Jest szybki, czuły i bardzo użyteczny dla cienkich preparatów oraz żywych komórek, ale nie daje automatycznie obrazu ilościowego.

Tor pomiarowy obejmuje:

  1. źródło wzbudzenia;
  2. filtr wzbudzenia i lustro dichroiczne;
  3. obiektyw oraz preparat;
  4. filtr emisji;
  5. kamerę;
  6. korekcję tła i niejednorodności;
  7. segmentację;
  8. jednostkę wyniku.

Zmiana obiektywu, mocy, czasu ekspozycji, binningu, gain, lampy, filtra lub algorytmu może zmienić liczbę pikseli i intensywność bez żadnej zmiany biologicznej. Dlatego obraz przeznaczony do pomiaru jest rekordem metody, a nie ilustracją.

Tor ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej widefield: źródło i filtry wzbudzają fluorofor, obiektyw zbiera emisję przez filtr do kamery, a surowy obraz wymaga dark correction, flat-field, kontroli nasycenia, skali przestrzennej i jawnej segmentacji przed wynikiem.
Tor ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej widefield: źródło i filtry wzbudzają fluorofor, obiektyw zbiera emisję przez filtr do kamery, a surowy obraz wymaga dark correction, flat-field, kontroli nasycenia, skali przestrzennej i jawnej segmentacji przed wynikiem.

Skąd bierze się fluorescencja

Fluorofor pochłania foton o energii odpowiadającej pasmu wzbudzenia. Po bardzo krótkim czasie emituje foton o zwykle niższej energii i dłuższej fali. Różnica między maksimum wzbudzenia i emisji to przesunięcie Stokesa.

W preparacie fluoroforem może być:

  • białko fluorescencyjne;
  • barwnik sprzężony z przeciwciałem;
  • sonda kwasu nukleinowego;
  • barwnik organelli;
  • sensor zależny od pH, jonów lub potencjału;
  • naturalna autofluorescencja.

Intensywność obrazu zależy nie tylko od liczby cząsteczek celu, ale także od stopnia znakowania, lokalnego środowiska, quantum yield, ekspozycji, mocy źródła, efektywności obiektywu, filtrów i detektora.

Tor optyczny epifluorescencji

W mikroskopie epifluorescencyjnym wzbudzenie i emisja przechodzą przez ten sam obiektyw.

Źródło

Źródłem może być:

  • lampa rtęciowa lub metalohalogenkowa;
  • LED;
  • laser;
  • zintegrowany moduł wielokanałowy.

Lampa starzeje się, nagrzewa i może mieć nierówną stabilność spektralną. LED daje szybkie przełączanie i łatwiejszą kontrolę mocy, lecz rzeczywiste widmo oraz irradiance nadal trzeba znać. Ustawienie 10% nie jest jednostką fizyczną i nie musi oznaczać tej samej mocy po serwisie albo na drugim urządzeniu.

Zestaw filtrów

Klasyczny filter cube zawiera:

  • filtr excitation;
  • lustro dichroiczne;
  • filtr emission.

Filtr wzbudzenia wybiera pasmo docierające do preparatu. Dichroic odbija krótsze fale ku próbce i przepuszcza dłuższą emisję do kamery. Filtr emisji ogranicza resztkowe wzbudzenie i niepożądane pasma.

Nazwy DAPI, FITC lub TRITC nie są pełnym opisem. Potrzebne są zakresy transmisji i typ dichroika. Dwa zestawy o tej samej nazwie mogą zbierać inną część widma, zmieniając jasność i crosstalk.

Obiektyw określa, co wolno zobaczyć

Najważniejsze parametry obiektywu to:

  • powiększenie;
  • numerical aperture;
  • medium immersyjne;
  • odległość robocza;
  • korekcja aberracji;
  • pole obrazu;
  • grubość szkiełka, dla której został skorygowany;
  • transmisja w użytych pasmach.
NA i rozdzielczość

Numerical aperture opisuje zdolność zbierania światła i kąty promieni. Większa NA zwykle poprawia rozdzielczość oraz zwiększa liczbę zebranych fotonów, ale zmniejsza głębię ostrości i może wymagać immersji.

Przybliżona granica rozdzielczości bocznej zależy od długości fali i NA. Nie jest równa rozmiarowi piksela. Jeśli dwa źródła są bliżej niż odpowiedź układu optycznego, większe cyfrowe powiększenie nie rozdzieli ich.

Immersja

Olejek, woda i silikon mają różne współczynniki załamania. Niewłaściwe medium lub wysychanie warstwy powodują aberrację, utratę sygnału i zniekształcenie osi z. Olej zanieczyszczający obiektyw suchy może go uszkodzić i pogorszyć inne stanowiska.

Preparat wodny obrazowany głęboko obiektywem olejowym doświadcza refractive-index mismatch. Ostrość ustawiona mechanicznie o 10 µm nie musi oznaczać 10 µm w próbce.

Szkiełko i naczynie

Obiektyw skorygowany dla coverslip #1.5 nie osiąga znamionowych parametrów przez grube dno standardowej płytki. W hodowli znaczenie mają:

  • materiał dna;
  • jego grubość;
  • płaskość;
  • autofluorescencja;
  • kompatybilność z immersją;
  • odległość robocza;
  • menisk medium.

Widefield zbiera światło spoza ostrości

Cała objętość preparatu w stożku wzbudzenia emituje światło. Kamera przypisuje fotony do płaszczyzny obrazu, choć część pochodzi powyżej lub poniżej niej.

W cienkiej monowarstwie może to być akceptowalne. W grubej tkance albo organoidzie:

  • tło rośnie;
  • granice obiektów zlewają się;
  • intensywność zależy od lokalnej grubości;
  • punktowy sygnał staje się rozmytą plamą;
  • segmentacja przestaje odpowiadać anatomii.

Mikroskop konfokalny usuwa część światła spoza płaszczyzny za pomocą apertury detekcyjnej, lecz płaci skanowaniem, dawką i ograniczoną szybkością. Widefield nie jest gorszy z definicji: dla cienkich, słabych i szybko zmieniających się próbek bywa właściwszy.

Kamera: foton nie jest jeszcze pikselem

Kamery CCD, EMCCD i sCMOS różnią się:

  • quantum efficiency;
  • read noise;
  • dark current;
  • full well capacity;
  • pattern noise;
  • szybkością;
  • wielkością piksela;
  • liniowością;
  • sposobem gain;
  • rolling albo global shutter.
Offset i dark signal

Kamera dodaje offset, aby szum nie dawał ujemnych wartości. Obraz ciemny z zamkniętym torem ujawnia offset, hot pixels i dark current. Odjęcie jednej stałej od każdego piksela nie zawsze wystarcza, szczególnie w sCMOS, gdzie piksele mogą różnić się parametrami.

Gain

Gain przelicza elektrony na wartości cyfrowe. Większa wartość może rozjaśnić podgląd, ale nie zwiększa liczby fotonów. W EMCCD wzmocnienie elektronowe pomaga, gdy ogranicza read noise, ale wprowadza dodatkową statystykę mnożenia. W sCMOS wybór gain może zmieniać zakres dynamiczny.

Saturation

Piksel nasycony osiąga maksymalną wartość, na przykład 65 535 w obrazie 16-bitowym. Nie wiadomo, czy prawdziwy sygnał był minimalnie czy wielokrotnie wyższy. Nasyconego obrazu nie można naprawić zmniejszeniem jasności w programie.

Kontrola histogramu powinna obejmować wszystkie kanały, pola, czasy i najbardziej jasne warunki biologiczne.

Rozmiar piksela i próbkowanie

Rozmiar piksela w preparacie wynika z fizycznego piksela kamery i całkowitego powiększenia. Przykładowo piksel 6,5 µm przy obiektywie 40× odpowiada około 0,1625 µm w próbce, o ile w torze nie ma dodatkowej optyki.

Próbkowanie musi być dostatecznie gęste wobec rozdzielczości, zwykle oceniane regułą Nyquista. Zbyt duży piksel traci informację. Zbyt mały:

  • nie poprawia rozdzielczości optycznej;
  • rozdziela te same fotony na więcej pikseli;
  • zwiększa plik i czas;
  • może obniżyć signal-to-noise per pixel.

Zoom cyfrowy po akwizycji nie przywraca utraconej informacji.

Binning

Binning 2×2 łączy sąsiednie piksele. Może zwiększyć stosunek sygnału do read noise i szybkość, ale zmniejsza próbkowanie przestrzenne. W sCMOS implementacja sprzętowa i programowa może dawać inne właściwości. Trzeba zapisać tryb, a nie tylko rozmiar obrazu.

Ekspozycja: najpierw pytanie, potem ustawienie

Dla porównania intensywności wszystkie próbki w serii powinny być mierzone w ustalonych ustawieniach mieszczących się w zakresie liniowym.

Sekwencja pilota:

  1. przygotować ujemną i najjaśniejszą spodziewaną próbkę;
  2. ustawić focus i pole bez nadmiernej ekspozycji;
  3. dobrać power, czas i gain;
  4. sprawdzić brak saturacji;
  5. potwierdzić rozdzielenie od tła;
  6. zmierzyć photobleaching w planowanej sekwencji;
  7. zamrozić ustawienia w metodzie.

Automatyczna ekspozycja ustawiana niezależnie dla każdego pola niszczy porównanie intensywności, chyba że zachowane parametry są przeliczone przy zwalidowanej liniowości.

Barwienie i kontrole

Ujemna

Kontrola ujemna ujawnia:

  • autofluorescencję;
  • background nośnika;
  • nonspecific binding;
  • bleed-through;
  • sygnał kamery.

Samo no primary antibody odpowiada tylko na część pytań. Dla białka fluorescencyjnego właściwa może być linia parental, a dla barwnika funkcjonalnego — próbka bez sondy.

Dodatnia

Kontrola dodatnia potwierdza, że znakowanie, tor optyczny i analiza potrafią wykryć cel. Nie powinna być tak jasna, że omija problem zakresu roboczego.

Single-color

W obrazowaniu wielokanałowym próbki znakowane pojedynczo pokazują bleed-through i cross-excitation. Pozwalają też wykryć błąd przypisania filtrów oraz przesunięcie kanałów.

Kontrola biologiczna

Knockout, knockdown, inhibitor, indukcja albo znana lokalizacja dają silniejszy dowód swoistości niż ładny wzór. Przeciwciało może tworzyć oczekiwany obraz mimo wiązania niewłaściwego białka.

Autofluorescencja, tło i bleed-through

Autofluorescencja zależy od komórki, medium, utrwalacza i długości fali. Fenol red, ryboflawina, aldehydy, lipofuscyna oraz niektóre tworzywa mogą podnosić tło.

Sposoby ograniczenia:

  • właściwy fluorofor i kanał;
  • medium do obrazowania;
  • krótsza ekspozycja przy dostatecznej mocy;
  • washing;
  • blokowanie;
  • spectral separation;
  • kontrolowana chemiczna redukcja tła, jeśli nie niszczy celu.

Bleed-through występuje, gdy emisja jednego fluoroforu trafia do kanału drugiego. Nie usuwa się go arbitralnym obniżeniem jasności. Trzeba dobrać widma, filtry, kolejność i controls, a ewentualną korekcję zwalidować.

Niejednorodność pola

Oświetlenie i detekcja rzadko są identyczne w środku oraz przy krawędzi. Kurz, vignette, źródło i optyka tworzą spatial bias.

Flat-field correction używa jednorodnej próbki do oszacowania odpowiedzi pola. Obraz próbki koryguje się po odjęciu dark frame i normalizacji mapą pola. Metoda z jednorodnym barwnikiem może służyć zarówno korekcji, jak i kontroli intensywności1.

Flat-field:

  • musi być wykonany dla kanału i obiektywu;
  • nie zastępuje czyszczenia;
  • wymaga unikania saturacji;
  • powinien mieć wersję i datę;
  • traci ważność po zmianie toru.

Korekcja matematyczna nie jest pretekstem do używania pola, w którym sygnał spada poza zwalidowany zakres.

Rejestracja kanałów

Aberracja chromatyczna sprawia, że ten sam obiekt może pojawić się w różnych pozycjach dla różnych barw. Przy kolokalizacji różnica rzędu jednego piksela może zmienić wniosek.

Wielobarwne kulki subresolution służą do pomiaru przesunięcia x, y i z. Trzeba testować reprezentatywne pozycje pola oraz obiektywy. Transformacja korekcyjna jest ważna dla określonej konfiguracji.

Kolokalizacja nie jest dowodem interakcji molekularnej. Wspólne piksele mogą wynikać z ograniczonej rozdzielczości, tła i gęstego znakowania.

Point spread function

Punktowy emiter jest obrazowany jako trójwymiarowa plama — PSF. Z subresolution beads można oszacować:

  • rozdzielczość boczną;
  • rozdzielczość osiową;
  • symetrię;
  • aberracje;
  • stabilność focus;
  • zmianę między kanałami.

Zmierzona PSF jest bardziej użyteczna niż teoretyczna wartość katalogowa, ponieważ obejmuje rzeczywisty obiektyw, immersję, filtry, kamerę i ustawienie.

Fotowygaszanie i fototoksyczność

Photobleaching

Fluorofor może nieodwracalnie utracić zdolność emisji. Jeżeli kanały są rejestrowane kolejno, pierwszy może być eksponowany podczas ustawiania focus i przez wzbudzenia innych kanałów. Intensywność wtedy zależy od kolejności.

Test:

  1. wybrać reprezentatywną próbkę;
  2. wykonać serię w planowanych odstępach;
  3. mierzyć tę samą strukturę;
  4. wykreślić sygnał po korekcji tła;
  5. ustalić dopuszczalny spadek.
Phototoxicity

W żywych komórkach stan wzbudzony może generować reactive oxygen species. Brak natychmiastowej śmierci nie oznacza braku efektu. Zmieniać mogą się podziały, migracja, mitochondria, wapń i ekspresja genów. Photobleaching oraz phototoxicity są istotnymi źródłami zmienności zależnymi od irradiance2.

Minimalizacja obejmuje:

  • najmniejszą dawkę spełniającą kryterium pomiaru;
  • rzadsze punkty czasu;
  • krótki czas;
  • czuły detektor;
  • fluorofor o dobrej photostability;
  • kanał phase contrast do focus, jeśli właściwy;
  • autofocus bez dodatkowej fluorescencji;
  • utrzymanie temperatury, CO₂ i wilgotności.

Low light jest opisem względnym. Metoda powinna zachować moc, ekspozycję, częstość i całkowity czas.

Obraz ilościowy

Najpierw measurand

Przykładowe measurands:

  • średnia intensywność w jądrze;
  • suma sygnału na komórkę;
  • odsetek komórek dodatnich;
  • liczba puncta na jednostkę powierzchni;
  • powierzchnia pozytywnego obszaru;
  • stosunek jądro/cytoplazma;
  • szybkość zmiany w czasie.

Każdy wymaga innej segmentacji, kontroli tła i jednostki.

Segmentacja

Maska może powstać z:

  • threshold;
  • watershed;
  • modelu obiektu;
  • uczenia maszynowego;
  • osobnego markera jądra lub błony.

Parametry ustala się na zbiorze obejmującym słabe, silne, gęste i nietypowe pola. Ręczne poprawki muszą mieć reguły. Algorytm nie powinien być dostrajany po obejrzeniu grup eksperymentalnych bez niezależnej walidacji.

Mianownik

„Fluorescencja na komórkę” może oznaczać:

  • średnią z pikseli maski;
  • integrated intensity;
  • sumę po korekcji tła;
  • medianę komórek;
  • wartość znormalizowaną przez powierzchnię;
  • stosunek kanałów.

Nazwa wyniku powinna ujawniać obliczenie.

Jednostki

Arbitrary units są dopuszczalne w kontrolowanej serii, ale nie są automatycznie porównywalne między dniami. Wzorzec intensywności może śledzić threshold, saturację i linear dynamic range. NIST opisuje benchmarking widefield z fluorescencyjnym szkłem jako fizycznym artefaktem do oceny tych parametrów3.

Kontrola jakości instrumentu

Inicjatywa QUAREP-LiMi porządkuje QC mikroskopu w niezależne obszary: moc i stabilność źródła, detektor, jednorodność pola, rejestrację chromatyczną, rozdzielczość, stolik/focus i metadane4.

Daily lub przed serią
  • stan źródła;
  • czystość optyki;
  • brak widocznego kurzu;
  • poziom dark signal;
  • wzorzec intensywności;
  • focus i położenie uchwytu;
  • warunki komory żywych komórek.
Okresowo
  • moc i stabilność w czasie;
  • flatness;
  • liniowość kamery;
  • read noise i hot pixels;
  • saturation threshold;
  • PSF;
  • chromatic co-registration;
  • dokładność skali;
  • powtarzalność stolika;
  • drift x/y/z;
  • temperatura próbki;
  • recovery CO₂.

Częstotliwość wynika z ryzyka, wykorzystania, historii trendu i skutków błędu. Jednorazowa „kalibracja roczna” nie wykryje lampy zużywającej się w połowie eksperymentu.

IQ, OQ i PQ

IQ

Potwierdza konfigurację:

  • statyw, obiektywy i numery seryjne;
  • źródła, filtry i kamera;
  • uchwyty oraz komorę;
  • sterowniki i software;
  • kalibrację osi;
  • lokalizację, stół i zasilanie;
  • archiwizację danych.
OQ

Sprawdza urządzenie wzorcami:

  • skalę przestrzenną;
  • power i stability;
  • flat-field;
  • liniowość oraz zakres;
  • rozdzielczość i PSF;
  • co-registration;
  • stage repeatability;
  • focus drift;
  • poprawność shutter i sekwencji.
PQ

Używa reprezentatywnej próbki:

  • słabego i silnego sygnału;
  • wymaganej liczby kanałów;
  • najdłuższego time-lapse;
  • właściwego naczynia;
  • gęstej i rzadkiej hodowli;
  • różnych operatorów;
  • docelowego algorytmu.

PQ akceptuje cały wynik biologiczny, nie tylko ostrość obrazu.

Walidacja analizy

Należy określić:

  • lower detection limit wobec tła;
  • liniowy zakres intensywności;
  • precision pola, studzienki, płytki i dnia;
  • sensitivity na focus i ekspozycję;
  • wpływ flat-field;
  • zgodność ręcznego i automatycznego ground truth;
  • błąd segmentacji;
  • robustness na zmianę gęstości;
  • carryover światła lub pamięć kamery;
  • stabilność odczynnika.

Analiza obrazu musi być wersjonowana. Zmiana modelu segmentacji może wymagać ponownego przeliczenia całej serii, nie tylko nowych obrazów.

Minimalne metadane

Raport powinien zachować:

  • identyfikator próbki i przygotowanie;
  • fluorofory, przeciwciała, partie i stężenia;
  • medium, temperaturę i atmosferę;
  • statyw i obiektyw;
  • immersję;
  • źródło, kanał, moc i filtry;
  • czas ekspozycji, gain, bit depth i binning;
  • rozmiar piksela i z-step;
  • kolejność kanałów;
  • liczbę pól i regułę wyboru;
  • autofocus;
  • korekcje;
  • plik surowy;
  • wersję software i analizy;
  • status QC.

W praktyce irradiance, photobleaching, saturacja i rzeczywisty odstęp czasowy należą do informacji potrzebnych do odtworzenia metody.

Dobór mikroskopu

Widefield jest dobrym wyborem, gdy:

  • próbka jest cienka;
  • sygnał jest słaby;
  • potrzeba szybkiego time-lapse;
  • istotna jest mała dawka;
  • obrazowane są duże pola;
  • deconvolution ma zwalidowane zastosowanie.

Konfokalny warto rozważyć, gdy:

  • próbka jest gruba;
  • światło out-of-focus uniemożliwia segmentację;
  • potrzebny jest optical sectioning;
  • ważna jest rekonstrukcja z;
  • punktowe struktury zlewają się w widefield.

Spinning disk może łączyć sectioning z szybkością, a light-sheet ograniczać dawkę w dużych próbkach. Wybór zaczyna się od pytania biologicznego, nie od najbardziej zaawansowanego urządzenia.

Najczęstsze błędy

Dopasowanie jasności osobno

Różne brightness/contrast mogą służyć prezentacji, jeżeli nie ukrywają danych i są jawne. Nie wolno jednak porównywać tak zmienionych obrazów jak równych pomiarów.

Wybór reprezentatywnego pola

Pole wybrane po poznaniu wyniku generuje bias. Potrzebny jest schemat losowy, systematyczny albo obejmujący całą studzienkę.

Pomiar na JPEG

JPEG traci informacje, ma kompresję i zwykle ograniczoną głębię. Analiza powinna zaczynać się od surowego TIFF/OME-TIFF lub formatu zachowującego dane i metadane.

Wspólne ustawienie dla różnych fluoroforów

Każdy kanał ma inną jasność, tło i czułość. „Ten sam czas” nie jest warunkiem porównywalności między barwami.

Liczenie obiektów bez definicji

Punctum może być pojedynczą strukturą, zlepkiem, pikselem nasyconym albo kurzem. Minimalny rozmiar, intensywność i reguła rozdziału muszą należeć do metody.

Checklista przed akwizycją

  • Czy measurand jest zdefiniowany?
  • Czy widefield jest właściwy dla grubości próbki?
  • Czy naczynie pasuje do obiektywu?
  • Czy controls potwierdzają swoistość?
  • Czy single-color ujawniają crosstalk?
  • Czy QC jest w limicie?
  • Czy ekspozycja mieści najsilniejszy sygnał bez saturacji?
  • Czy najsłabszy sygnał jest rozdzielony od tła?
  • Czy próbkowanie odpowiada rozdzielczości?
  • Czy flat-field i co-registration są aktualne?
  • Czy liczba pól i zasada ich wyboru są ustalone?
  • Czy żywe komórki wytrzymają dawkę i warunki?

Checklista po akwizycji

  • Czy zachowano surowe dane?
  • Czy ustawienia były stałe?
  • Czy histogram ujawnia saturację?
  • Czy focus jest stabilny?
  • Czy time-lapse nie wykazuje photobleaching?
  • Czy dark i flat-field zastosowano we właściwej kolejności?
  • Czy segmentacja działa w grupach skrajnych?
  • Czy wynik ma jednostkę i mianownik?
  • Czy operator nie usuwał pól po poznaniu grupy?
  • Czy metadane oraz status QC są powiązane z plikiem?

Najkrótsza zasada

Mikroskop fluorescencyjny nie mierzy „ilości białka” bezpośrednio. Mierzy fotony przekształcone w piksele przez określony tor, a ilościowy wynik powstaje dopiero po kontroli znakowania, zakresu, pola, kamery i segmentacji.