STR, SNP, chromosom Y i mtDNA w identyfikacji

Streszczenie

Nie istnieje jeden „marker DNA” dobry do każdego zadania identyfikacyjnego. Autosomalne STR mają wiele alleli i w standardowych przypadkach dobrze rozróżniają osoby. Y-STR tworzą haplotyp dziedziczony zasadniczo w jednej linii ojcowskiej: pomagają odzyskać sygnał męski z mieszaniny, ale zwykle nie odróżniają bliskich krewnych tej samej linii. Mitochondrialne DNA występuje w komórkach w wielu kopiach i bywa dostępne w trzonach włosów, kościach oraz silnie zdegradowanych próbkach, lecz wspólny haplotyp może obejmować krewnych po linii matczynej. SNP są liczniejsze i mogą mieścić się w bardzo krótkich amplikonach, ale pojedynczy SNP jest zwykle dwualleliczny, więc do identyfikacji potrzeba dużego panelu.

Wybór systemu zależy od pytania, materiału, degradacji, składu mieszaniny, dostępnych krewnych i oczekiwanego poziomu rozróżnienia. Nie wolno mnożyć częstości alleli markerów sprzężonych tak, jakby były niezależne. Autosomalne loci rozproszone po różnych chromosomach można często modelować iloczynowo po uwzględnieniu populacji i pokrewieństwa. Y-STR i mtDNA ocenia się jako całe haplotypy wraz z genealogiczną zależnością.

Marker nie przechowuje nazwiska, fotografii ani gotowej cechy. Profil jest zestawem obserwacji względem wersjonowanego panelu i nomenklatury. Nazwisko pojawia się dopiero po kontrolowanym połączeniu profilu ze sprawą, próbką odniesienia albo rekordem bazy. Markery identyfikacyjne, pochodzeniowe i fenotypowe odpowiadają na różne pytania i wymagają odrębnej walidacji, statystyki oraz podstawy prawnej.

Najpierw pytanie, potem panel

W drodze od śladu do profilu DNA profil był końcem kontrolowanego procesu laboratoryjnego. Teraz trzeba doprecyzować, co właściwie mierzono. Cztery systemy mogą dostarczyć czterech zgodnych, ale nieidentycznych opisów tej samej próbki.

Przed wyborem markerów laboratorium powinno znać:

• czy celem jest identyfikacja osoby, ocena pokrewieństwa, pochodzenia czy cech wyglądu;
• czy próbka ma jednego dawcę, czy jest mieszaniną;
• czy trzeba uwidocznić składnik męski na tle przewagi DNA żeńskiego;
• czy materiał jest silnie zdegradowany;
• czy dostępny jest tylko trzon włosa, stara kość albo ząb;
• jakich krewnych można pobrać do porównania;
• jaki poziom rozróżnienia jest potrzebny;
• czy wynik ma wejść do bazy zgodnej z określonym standardem;
• jaka technologia i baza populacyjna zostały zwalidowane.

Panel „największy” nie musi być najlepszy. Dodatkowe loci zwiększają informację tylko wtedy, gdy są wiarygodnie odczytane, właściwie modelowane i odnoszą się do pytania. Panel fenotypowy nie naprawia słabego porównania źródłowego, a pełny mitogenom nie odróżni automatycznie dwóch krewnych po linii matczynej.

Locus, allel, genotyp i haplotyp

Podstawowe terminy muszą być precyzyjne:

• locus — określone miejsce lub region genomu;
• marker — cecha tego locus, którą mierzy test;
• allel — jedna z obserwowanych wersji markera;
• genotyp — zestaw alleli danej osoby w locus;
• haplotyp — zestaw alleli lub wariantów dziedziczonych razem na jednej cząsteczce albo w regionie bez rekombinacji;
• profil — zestaw wyników z panelu markerów, wraz z informacją o jakości i metodzie.

W autosomalnym STR człowiek ma zwykle dwa allele: po jednym na homologu odziedziczonym od każdego rodzica. Jeśli oba mają tę samą długość, zapis jest homozygotyczny. W Y-STR mężczyzna ma zasadniczo jeden haplotyp chromosomu Y, choć niektóre loci są wielokopijne i mogą dawać więcej wartości. W mtDNA obserwuje się sekwencję populacji wielu cząsteczek mitochondrialnych, czasem z heteroplazmią.

Genotyp 12,14 bez nazwy locus, panelu i nomenklatury jest niepełny. Haplotyp bez podania zakresu regionu, wersji referencji i progów mieszaniny także. Wymiana danych między laboratoriami wymaga wspólnego języka.

STR: zmienna liczba krótkich powtórzeń

Short tandem repeat jest regionem, w którym krótki motyw powtarza się szeregowo. W kryminalistyce popularne są tetranukleotydowe STR, na przykład powtórzenia czterech zasad. Różne osoby mogą mieć różną liczbę powtórzeń, a więc produkty PCR różnej długości.

Schematycznie:

allel 10: flank — [GATA]×10 — flank
allel 13: flank — [GATA]×13 — flank

Startery wiążą sekwencje flankujące. Elektroforeza mierzy rozmiar produktu, a drabina alleliczna przypisuje go do znormalizowanego oznaczenia. Numer allelu nie zawsze jest po prostu długością fragmentu podzieloną przez cztery. Locus może zawierać niepełne powtórzenia, złożone motywy i warianty sekwencji flankującej.

NIST utrzymuje STRBase jako zasób sekwencji, obserwowanych alleli, nomenklatury, zestawów multiplex, wskaźników mutacji i danych pomocnych w testach tożsamości człowieka.¹ Standaryzacja ma praktyczny skutek: profil D8S1179 12,14 powinien oznaczać to samo w laboratoriach używających zgodnej nomenklatury.

Dlaczego autosomalne STR są podstawowym systemem

Autosomalne STR łączą kilka zalet:

• wiele alleli w pojedynczym locus;
• duża zmienność populacyjna;
• niewielka ilość DNA potrzebna do PCR;
• możliwość amplifikacji wielu loci jednocześnie;
• rozwinięte bazy częstości;
• wspólne panele baz danych;
• dobrze poznane artefakty i modele mieszanin.

Jeśli heterozygotyczność locus jest duża, przypadkowe dwie osoby często mają różne genotypy. Po połączeniu wielu odpowiednio dobranych loci profil ma wysoką moc rozróżniającą. Nie znaczy to, że każdy locus jest całkowicie niezależny ani że prawdopodobieństwo może być dowolnie małe. Trzeba uwzględniać strukturę populacji, pokrewieństwo, sprzężenie, mutacje i ograniczenia próbki.

FBI definiuje obecnie profil standardowego typu STR w NDIS przez allele w 20 loci rdzeniowych CODIS; zestaw został rozszerzony z pierwotnych 13 od 2017 roku.² Europejskie systemy mają własny rdzeń. Zgodność paneli ułatwia wymianę, ale reguły amerykańskiej bazy nie są polskimi regułami prawnymi.

Allel długościowy i allel sekwencyjny

Dwa produkty mogą mieć ten sam rozmiar, ale różnić się kolejnością zasad wewnątrz powtórzenia albo w regionie flankującym. Elektroforeza kapilarna klasyfikuje je jako ten sam allel długościowy. Sekwencjonowanie masowe może ujawnić allel sekwencyjny.

Przykład:

allel długościowy 12:
  A: [GATA]8 [GATG]1 [GATA]3
  B: [GATA]5 [GATG]1 [GATA]6

Oba mogą migrować jak 12, lecz zawierają inny układ. Sekwencja może zwiększyć rozróżnienie bez dodawania nowego locus. Wymaga jednak:

• uzgodnionej nomenklatury;
• walidacji sekwencjonowania i pipeline;
• kontroli błędów odczytu;
• danych częstości dla alleli sekwencyjnych;
• zgodności wstecznej z profilami długościowymi;
• jawnego zakresu sekwencji raportowanej.

ISFG opublikowało zalecenia nomenklatury sekwencyjnej STR, ponieważ zapis musi rozróżniać motyw, warianty i orientację w sposób możliwy do odtworzenia.³

STR nie są genetycznie nieruchome

Liczba powtórzeń może zmienić się podczas mejozy. Mutacja STR często polega na zysku lub utracie jednostki powtórzeniowej, ale możliwe są większe zmiany. W analizie bezpośredniego porównania śladu z tą samą osobą mutacja somatyczna jest zwykle rzadkim problemem. W pokrewieństwie pojedyncza niezgodność może wynikać z mutacji, a nie wykluczać relacji.

Tempo mutacji różni się między loci, liczbą powtórzeń, płcią rodzica i strukturą allelu. Nie stosuje się jednej liczby do całego panelu. Model pokrewieństwa powinien korzystać z danych właściwych dla locus i rozważanej transmisji.

W nowotworach, przeszczepach szpiku, chimerach i niektórych aneuploidiach profil może odbiegać od prostego wzorca dwóch alleli. Wymaz policzkowy po allogenicznym przeszczepie krwiotwórczym może zawierać różne proporcje DNA biorcy i dawcy. „Profil osoby” zależy wtedy od tkanki i historii medycznej.

Stutter jest cechą reakcji, nie dodatkową osobą

Podczas PCR polimeraza może ześlizgnąć się w regionie powtórzonym. Powstaje produkt najczęściej o jedną jednostkę krótszy od allelu, czasem dłuższy albo przesunięty o inną liczbę jednostek. Taki pik nazywa się stutter.

Stutter zależy od:

• locus i struktury allelu;
• wysokości piku macierzystego;
• zestawu i liczby cykli;
• typu stutter;
• sekwencji;
• warunków instrumentu.

W mieszaninie pik może być jednocześnie pozycją oczekiwanego stutter jednego allelu i prawdziwym allelem innego dawcy. Reguła „wszystko poniżej X% usuń” niszczy informację. Model musi ocenić możliwy udział obu mechanizmów.

Autosomalne STR i rekombinacja

Autosomalne loci leżą na 22 parach chromosomów. Markery na różnych chromosomach segregują zasadniczo niezależnie, ale loci na tym samym chromosomie mogą być sprzężone. Jeśli są dostatecznie daleko, rekombinacja osłabia zależność; jeśli blisko, haplotypy mogą być współdziedziczone.

W standardowych panelach identyfikacyjnych wybór loci i populacyjne testy zgodności wspierają określone modele. Nie wolno jednak przyjąć niezależności tylko dlatego, że test ma wiele kolumn. W dużych panelach SNP i w rozszerzonych zestawach STR problem sprzężenia staje się bardziej widoczny.

Iloczyn częstości genotypów jest końcem modelu, nie początkiem. Najpierw ustala się:

• populację odniesienia;
• model Hardy’ego-Weinberga w locus;
• zależność między loci;
• korektę struktury populacji;
• pokrewieństwo;
• sposób traktowania rzadkich alleli;
• niepewność oszacowania częstości.

Amelogenina nie jest rozpoznaniem płci osoby

Wiele zestawów STR zawiera marker amelogeniny, który zwykle daje produkty związane z chromosomami X i Y. Jest użyteczny do oceny, czy w próbce występuje sygnał chromosomu Y i do kontroli profilu.

Nie jest kompletnym badaniem płci biologicznej ani tożsamości płciowej. Delecje miejsca startera, aneuploidie, chimerowość, przeszczep, mała ilość DNA i mieszaniny mogą dawać nietypowe wyniki. Raport powinien odnosić się do wykrytego markera, a nie wyprowadzać z jednego locus szersze twierdzenie o osobie.

Y-STR: haplotyp linii ojcowskiej

Większa część chromosomu Y nie rekombinuje z X w każdej generacji. Markery Y-STR w tym regionie są przekazywane zasadniczo razem z ojca na syna. Wynik wielu loci tworzy haplotyp, a nie zestaw niezależnych genotypów.

Konsekwencje:

• biologiczni krewni po tej samej nieprzerwanej linii ojcowskiej mogą mieć identyczny albo bardzo podobny haplotyp;
• loci nie można traktować jak niezależnych autosomalnych STR i mnożyć ich częstości;
• populacyjna częstość haplotypu zależy od genealogii i struktury geograficznej;
• mutacja może odróżnić gałąź, ale nie daje gwarancji rozróżnienia braci, ojca i syna.

ISFG podkreśla, że współdziedziczenie Y-STR wyklucza prostą regułę iloczynu, a interpretacja musi obejmować zależność haplotypów na poziomie rodziny i populacji.⁴

Dlaczego Y-STR pomagają w mieszaninie

W próbce po przestępstwie seksualnym DNA osoby pokrzywdzonej może być ilościowo dominujące. Autosomalne STR amplifikują DNA wszystkich dawców i sygnał męski może zostać zasłonięty. Startery Y-STR celują w chromosom Y, dlatego redukują wkład osób bez Y.

To selekcja markera, nie fizyczne oczyszczenie konkretnego mężczyzny. Jeśli próbka zawiera DNA dwóch mężczyzn, Y-STR również utworzą mieszaninę. Jeśli osoba z chromosomem Y jest krewnym innego kandydata w linii ojcowskiej, profile mogą nie rozróżnić ich.

Y-STR są użyteczne także w:

• poszukiwaniu osób zaginionych przez krewnych ojcowskich;
• identyfikacji szczątków;
• badaniu ojcostwa syna przy braku innych krewnych;
• analizie historycznych linii;
• rozdzielaniu męskiego składnika w określonych mieszaninach.

Nie są jednak „męskim odpowiednikiem” autosomalnego profilu o tej samej sile indywidualizacji.

Loci wielokopijne i palindromy Y

Chromosom Y zawiera powtórzenia, duplikacje i palindromy. Niektóre markery Y-STR występują w kilku kopiach. Wynik może zawierać dwa lub więcej alleli bez możliwości jednoznacznego przypisania ich do konkretnej kopii.

Zapis locus wielokopijnego często traktuje wartości jako nieuporządkowany zestaw. Mikrowarianty, delecje, duplikacje i konwersja genowa komplikują nomenklaturę. Walidacja musi uwzględnić:

• maksymalną obserwowaną liczbę kopii;
• nierównowagę pików;
• allele poza drabiną;
• stutter;
• mieszaniny;
• sposób porównania i raportowania.

Próba „fazowania” wartości bez dodatkowych danych może tworzyć informację, której assay nie mierzył.

Szybko mutujące Y-STR

Panele rapidly mutating Y-STR wybierają loci o większym tempie mutacji. Mogą częściej różnicować bliskich krewnych po linii ojcowskiej niż standardowy panel. Cena to większa możliwość różnicy między rzeczywistymi krewnymi.

Nie wolno komunikować wyniku jako:

• standardowy Y-STR identyczny → „to ten konkretny mężczyzna”;
• RM Y-STR różny w jednym locus → „nie są spokrewnieni”.

Interpretacja wymaga modelu liczby transmisji, swoistych wskaźników mutacji i danych populacyjnych. Większa rozdzielczość nie usuwa genealogii.

YHRD i populacyjna wartość haplotypu

Y-Chromosome Haplotype Reference Database gromadzi haplotypy Y-STR z wielu populacji i wspiera estymację ich częstości. Baza nie jest katalogiem wszystkich mężczyzn. Jest próbką populacyjną z określonymi kryteriami jakości i strukturą metapopulacji.

Wyszukiwanie wymaga zgodnego zestawu loci i nomenklatury. Wynik „nie zaobserwowano” nie oznacza częstości zero. Estymacja uwzględnia rozmiar bazy, niepewność i strukturę pokrewieństwa. Dokumentacja YHRD opisuje zarówno metodę zliczania, jak i modele rozkładu haplotypów oraz ich ograniczenia.⁵

Geografia ma większe znaczenie dla Y niż dla wielu standardowych autosomalnych modeli, bo sukces reprodukcyjny linii, migracje, nazwiska i dryf tworzą skupienia haplotypów. Dobór populacji odniesienia nie może być oportunistyczny po zobaczeniu, która daje najmniejszą częstość.

mtDNA: wiele cząsteczek w komórce

Mitochondria mają własny mały, kolisty genom. Komórka może zawierać wiele mitochondriów, a każde — wiele kopii mtDNA. Ta liczebność sprawia, że mtDNA bywa odzyskiwane tam, gdzie autosomalnego jądrowego DNA jest za mało lub jest zbyt zdegradowane.

Typowe materiały:

• trzon włosa bez tkanki cebulki;
• stare kości i zęby;
• silnie zdegradowane tkanki;
• szczątki po katastrofie;
• próbki historyczne.

Zaletą jest dostępność kopii. Ograniczeniem — mniejsza moc rozróżniania i dziedziczenie linii matczynej.

Dziedziczenie matczyne i haplotyp

mtDNA jest przekazywane głównie od matki. Rodzeństwo tej samej matki, matka, jej rodzeństwo po tej samej matce oraz dalsi krewni w nieprzerwanej linii matczynej mogą dzielić haplotyp.

Zgodność mtDNA oznacza więc zwykle:

• badana osoba nie może zostać wykluczona jako źródło;
• jej krewni w linii matczynej również mogą być źródłem;
• niespokrewnione osoby mogą dzielić ten sam haplotyp;
• wartość wyniku zależy od częstości haplotypu w bazie jakościowej.

W identyfikacji szczątków ta właściwość jest atutem. Można porównać materiał z żyjącą krewną lub krewnym po linii matczynej mimo wielu transmisji. W identyfikacji indywidualnej jest ograniczeniem, bo zgodność nie wskazuje jednego członka rodu.

Region kontrolny i pełny mitogenom

Historycznie sekwencjonowano przede wszystkim hiperzmienne regiony części kontrolnej, często oznaczane jako HV1 i HV2. Dają one znaczną zmienność przy krótkim zakresie. Sekwencjonowanie całego genomu mitochondrialnego może rozróżnić haplotypy identyczne w regionie kontrolnym dzięki wariantom części kodującej.

Pełny mitogenom:

• zwiększa rozdzielczość;
• dostarcza więcej danych filogenetycznych;
• może ujawnić warianty o znaczeniu zdrowotnym;
• wymaga większej kontroli NUMT i heteroplazmii;
• potrzebuje właściwej bazy populacyjnej dla całego zakresu;
• nie usuwa wspólnego dziedziczenia matczynego.

W amerykańskim NDIS wymagany zakres mtDNA dla określonych wpisów obejmuje HV1 i HV2, co pokazuje wymogi konkretnej bazy, a nie naukową granicę możliwej analizy.

Heteroplazmia

Jedna osoba może mieć więcej niż jedną wersję mtDNA. Heteroplazmia punktowa oznacza współistnienie dwóch zasad w pozycji. Heteroplazmia długości dotyczy różnej liczby zasad, często w regionach homopolimerowych.

Poziom heteroplazmii może różnić się:

• między tkankami;
• z wiekiem;
• między włosami;
• wskutek wąskiego gardła transmisji;
• zależnie od metody i progu;
• przez dryf w komórkach.

Niska składowa może być prawdziwa albo pochodzić z błędu, NUMT lub kontaminacji. Porównanie nie powinno stosować progu bez danych walidacyjnych. Różnica poziomu heteroplazmii nie zawsze wyklucza wspólne źródło, a pełna zgodność mieszaniny baz nie zawsze jest wymagana w prosty sposób.

NUMT: mitochondrialna sekwencja w jądrze

Fragmenty mtDNA zostały w toku ewolucji włączone do genomu jądrowego. Nazywa się je NUMT. Startery albo pipeline mogą pomylić je z mitochondrialnym celem, szczególnie gdy:

• właściwego mtDNA jest mało;
• amplikon nie jest dostatecznie swoisty;
• sekwencjonuje się krótkie odczyty;
• wariant NUMT jest podobny do heteroplazmii;
• analizuje się zdegradowany materiał.

Projekt assay uwzględnia lokalizacje NUMT, długość produktów, stosunek kopii i sposób mapowania. Potwierdzenie alternatywnym zestawem starterów lub inną technologią może rozstrzygnąć trudny wariant.

EMPOP i kontrola filogenetyczna

EMPOP jest bazą populacyjnych haplotypów mtDNA przeznaczoną do zastosowań sądowych. Oprócz zliczania podobnych profili wykorzystuje kontrolę jakości, wyrównanie względem referencji i spójność filogenetyczną. Ta ostatnia pomaga wykrywać zamiany próbek, błędy pozycji, pominięte warianty i nierealistyczne kombinacje.

Baza opisuje wynik wobec zakresu sekwencji i jakości rekordów. Haplotyp zgodny tylko w regionie kontrolnym nie jest tym samym co zgodność całych mitogenomów. EMPOP podkreśla, że bazy mtDNA wymagają szczególnych zasad generowania, transferu i kontroli danych.⁶

„Zero trafień” pozostaje obserwacją w skończonej bazie, nie dowodem unikalności. Statystyka musi uwzględnić niepewność próby.

SNP: zmiana jednej zasady

Single nucleotide polymorphism to pozycja genomu, w której w populacji występują różne zasady. Najczęściej testuje się dwa allele, na przykład A/G. Pojedynczy SNP ma więc mniejszą zdolność rozróżnienia niż wieloalleliczny STR.

Zalety:

• krótki region potrzebny do odczytu;
• bardzo duża liczba dostępnych loci;
• niskie tempo mutacji wielu markerów;
• zgodność z masowym sekwencjonowaniem;
• możliwość budowy paneli do różnych pytań;
• dobre zastosowania w zdegradowanym DNA i pokrewieństwie dalekim.

Ograniczenia:

• konieczność typowania wielu loci;
• sprzężenie w gęstych panelach;
• większy potencjał ujawniania informacji poza tożsamością;
• zależność od bioinformatyki;
• allele balance i błędy sekwencjonowania;
• brak bezpośredniej zgodności z częścią historycznych baz STR.

NIST katalogował osobno SNP identyfikacyjne, pochodzeniowe, fenotypowe, Y-SNP i mtSNP, podkreślając różne przeznaczenia markerów.⁷

Cztery funkcje SNP

Identity-informative SNP (IISNP) dobiera się tak, aby zestaw rozróżniał osoby. Panel musi być wystarczająco duży, mieć dobre częstości populacyjne i możliwie małe zależności.

Ancestry-informative SNP (AISNP) ma różne częstości w populacjach o odmiennej historii. Wynik estymuje podobieństwo do próbek odniesienia, nie narodowość, obywatelstwo ani samoidentyfikację etniczną.

Phenotype-informative SNP (PISNP) wiąże się z prawdopodobieństwem cechy, na przykład pigmentacji. Nie jest fotografią. Model ma zakres populacyjny, kalibrację i błąd.

Kinship-informative SNP dostarcza wielu stabilnych markerów przydatnych w odleglejszym pokrewieństwie i zdegradowanych próbkach. Gęsty panel wymaga modelu segmentów współdzielonych przez pochodzenie, a nie prostego mnożenia wszystkich loci.

Jeden SNP może należeć do więcej niż jednej kategorii. To, że laboratorium zamierza używać go do identyfikacji, nie usuwa biologicznej informacji, którą niesie.

Krótki amplikon pomaga przy degradacji

Prawdopodobieństwo zachowania długiego fragmentu spada wraz z degradacją. Jeśli assay SNP potrzebuje tylko krótkiego otoczenia pozycji, może działać na fragmentach, których standardowy dłuższy STR nie obejmuje.

Nie jest to bezwarunkowa przewaga:

• setki krótkich celów nadal muszą się amplifikować;
• uszkodzenie chemiczne może tworzyć błędne zasady;
• mała liczba cząsteczek daje dropout;
• multiplex może mieć nierówną wydajność;
• biblioteka sekwencyjna może wprowadzić indeksową kontaminację;
• zbyt krótkie odczyty mogą mapować się w kilku miejscach.

MiniSTR skracają flankujące regiony klasycznych loci i zachowują zgodność z częścią baz długościowych. SNP i miniSTR są więc różnymi rozwiązaniami problemu fragmentacji.

SNP i masowe sekwencjonowanie równoległe

Massively parallel sequencing pozwala czytać setki lub tysiące celów w jednym przebiegu. Typowy pipeline obejmuje:

1. przygotowanie biblioteki i indeksów;
2. wzbogacenie lub multiplex PCR;
3. sekwencjonowanie;
4. demultipleksowanie;
5. kontrolę jakości odczytów;
6. mapowanie do referencji;
7. zliczenie alleli;
8. filtrowanie i wywołanie genotypu;
9. tworzenie profilu;
10. interpretację statystyczną.

Każdy etap ma metryki: głębokość, równomierność, strand balance, allele balance, odsetek odczytów celu, duplikaty, blank i kontrolę indeksów. Duża liczba odczytów nie kompensuje błędnego mapowania albo kontaminacji.

Sekwencjonowanie może jednocześnie odczytać STR sekwencyjne, autosomalne SNP, Y-SNP, Y-STR i mtDNA. Wspólny instrument nie czyni ich jednym systemem statystycznym.

Y-SNP i haplogrupy ojcowskie

Y-SNP o małym tempie mutacji definiują gałęzie filogenezy chromosomu Y. Zestaw wariantów może przypisać haplogrupę, czyli szeroką linię pochodzenia ojcowskiego. Y-STR zmieniają się szybciej i lepiej różnicują haplotypy wewnątrz gałęzi.

Haplogrupa:

• nie jest nazwiskiem;
• nie jest jednoznaczną lokalizacją geograficzną;
• nie określa narodowości;
• może być wspólna dla bardzo wielu mężczyzn;
• zależy od rozdzielczości badanego drzewa i panelu.

W badaniach osób zaginionych połączenie Y-SNP i Y-STR może dostarczyć zgodności linii oraz rozdzielczości. W śledztwie pochodzenie ojcowskie jest wskazówką probabilistyczną, nie identyfikacją.

mtSNP i filogeneza matczyna

Każda różnica w mtDNA jest technicznie wariantem pojedynczej pozycji albo małą zmianą, lecz w praktyce „mtSNP” może oznaczać wybrany panel wariantów części kodującej. Pomaga podzielić częsty haplotyp regionu kontrolnego na rzadsze podlinie.

Filogeneza mtDNA ma rolę kontrolną. Jeśli próbka ma zestaw wariantów charakterystyczny dla haplogrupy, ale brakuje wariantu bazowego, trzeba sprawdzić:

• dropout;
• błąd zapisu pozycji;
• mieszaninę;
• kontaminację;
• NUMT;
• niepoprawne wyrównanie;
• rzeczywistą rzadką rewersję.

Drzewo nie może automatycznie nadpisać danych. Wskazuje niezgodność do wyjaśnienia.

X-STR: specjalne układy pokrewieństwa

STR na chromosomie X nie są głównym systemem prostego porównania śladu, ale mogą być bardzo informacyjne w wybranych relacjach. Mężczyzna przekazuje swój X wszystkim córkom i żadnemu synowi. Kobieta przekazuje jeden z dwóch X każdemu dziecku.

X-STR pomagają między innymi w:

• analizie dwóch córek wspólnego ojca;
• relacjach babka–wnuczka w określonej linii;
• testach rodzeństwa;
• trudnych sprawach bez próbki domniemanego ojca.

Loci X tworzą grupy sprzężeń, więc potrzebne są częstości haplotypów i rekombinacja zależna od płci. Nie wolno liczyć ich jak niezależnych autosomalnych STR.

Tabela wyboru systemu

Cecha	Autosomalne STR	Y-STR	mtDNA	Autosomalne SNP
dziedziczenie	od obojga rodziców, rekombinacja	linia ojcowska	linia matczyna	od obojga, rekombinacja
wynik w locus	zwykle 1–2 allele	haploidalny lub wielokopijny	sekwencja populacji cząsteczek	zwykle 1–2 allele
rozróżnienie osoby	wysokie w panelu	ograniczone przez krewnych ojcowskich	ograniczone przez krewnych matczynych	wysokie w dużym panelu
zdegradowany materiał	zależy od długości amplikonu	zależy od panelu	często dobry dzięki liczbie kopii	dobre krótkie cele
mieszanina żeńska + mały składnik męski	możliwe zasłonięcie	selektywny sygnał Y	brak selekcji mężczyzny	zależy od panelu
statystyka	częstości genotypów/LR	haplotyp i genealogia	haplotyp i genealogia	model wielu loci i sprzężenia
typowe zastosowanie	ślad–osoba, baza	składnik męski, linia ojcowska	włos, kość, linia matczyna	degradacja, identyfikacja, pokrewieństwo

Tabela wskazuje tendencje, nie reguły absolutne. Nowy assay STR może mieć krótkie produkty, a nowoczesny panel SNP może być nieodpowiedni dla mieszaniny. Zawsze rozstrzyga walidacja.

Próbka jednego dawcy i mieszanina

W pojedynczym autosomalnym profilu dwa allele na locus można przypisać jednej osobie. W mieszaninie allele nie mają etykiet dawców. Wraz ze wzrostem liczby dawców i dropoutem rośnie liczba możliwych kombinacji.

Y-STR zmniejsza złożoność tylko wtedy, gdy problemem jest przewaga DNA osób bez Y. mtDNA bywa trudne w mieszaninie, bo wiele kopii, heteroplazmia i wspólne haplotypy nie dają prostego bilansu jak dwa autosomalne allele. Panele SNP potrzebują modeli błędów i liczby odczytów.

Nie wybiera się systemu dopiero po sprawdzeniu, który „pasuje” do profilu podejrzanego. Strategia i kryteria muszą wynikać z próbki oraz pytania, a nie z oczekiwanego wyniku.

Statystyczna jednostka zgodności

Dla autosomalnych STR jednostką może być wielolocusowy genotyp osoby. Dla Y-STR — haplotyp chromosomu Y. Dla mtDNA — haplotyp badanego zakresu. Dla SNP — zestaw genotypów albo haplotypów zależnie od panelu.

Pytanie statystyczne powinno brzmieć:

Jak prawdopodobne są obserwowane dane, jeśli materiał pochodzi od rozważanego dawcy, w porównaniu z tym, że pochodzi od odpowiednio zdefiniowanej alternatywy?

Alternatywa różni się między systemami. Dla Y-STR nie może ignorować mężczyzn z tej samej linii ojcowskiej, jeśli są realnymi kandydatami. Dla mtDNA analogicznie uwzględnia się linię matczyną. Dla autosomalnych markerów pokrewieństwo kandydata z rzeczywistym dawcą może znacząco zwiększać zgodność.

Bazy częstości nie są bazami podejrzanych

Baza populacyjna służy do estymacji częstości allelu lub haplotypu. Baza operacyjna profili służy do wyszukiwania kandydackich zgodności. To różne zasoby.

Baza populacyjna wymaga:

• udokumentowanego pobrania;
• odpowiedniej liczebności;
• jakości genotypów;
• kontroli niespokrewnienia albo modelowania krewnych;
• metadanych populacyjnych;
• wspólnej nomenklatury;
• wersjonowania;
• polityki błędów i korekt.

Baza operacyjna wymaga kategorii rekordów, reguł wprowadzania, przeszukiwania, potwierdzania, retencji, usuwania i kontroli dostępu. Trafienie w bazie jest wskazówką do potwierdzenia na próbce i oceny w kontekście, nie końcowym dowodem.

Co profil mówi o osobie

Standardowe autosomalne STR dobiera się głównie dla identyfikacji, często w regionach niekodujących. Nie oznacza to „braku informacji biologicznej”. Profil może ujawniać:

• pokrewieństwo;
• chromosomalne anomalie lub nietypowe wzorce;
• chimerowość albo przeszczep;
• populacyjne zależności częstości;
• czasem bliskość genu lub asocjacje.

SNP mogą bezpośrednio kodować informację o pochodzeniu, wyglądzie, chorobach lub krewnych. Pełny mitogenom zawiera warianty związane ze zdrowiem. Sekwencja Y wskazuje filogenezę ojcowską.

Zasada minimalizacji danych oznacza, że panel, analiza i przechowywanie powinny odpowiadać prawnie uzasadnionemu celowi. Techniczna możliwość odczytania więcej nie jest sama w sobie uzasadnieniem.

Niepewność nomenklatury i referencji

Wynik sekwencyjny zależy od:

• assembly i wersji genomu;
• sekwencji referencyjnej;
• orientacji nici;
• zakresu flankującego;
• sposobu wyrównania indeli;
• nazewnictwa powtórzeń;
• wersji drzewa haplogrup;
• wersji bazy częstości.

mtDNA jest często raportowane względem revised Cambridge Reference Sequence, ale analiza może używać innych zasobów filogenetycznych. Wariant „A73G” bez podania referencji i zakresu jest niepełny. STR sekwencyjny bez jawnej sekwencji referencyjnej może zostać inaczej nazwany przez dwa pipeline’y.

Laboratorium przechowuje zarówno zapis użyty historycznie, jak i możliwość przeliczenia do nowej nomenklatury. Aktualizacja bazy nie powinna bez śladu zmieniać starego raportu.

Studium 1: włos bez tkanki

Trzon włosa z miejsca zdarzenia nie daje użytecznego autosomalnego profilu STR. Sekwencjonowanie mtDNA daje haplotyp zgodny z osobą A.

Prawidłowy wniosek:

• A nie może zostać wykluczona jako źródło włosa;
• jej krewni po linii matczynej również nie mogą;
• inne osoby mogą dzielić haplotyp;
• wartość zależy od częstości w odpowiedniej bazie;
• wynik nie ustala czasu pozostawienia włosa.

Nieprawidłowy skrót: „włos należy do A”. Nawet pełny mitogenom zwykle nie tworzy aktu własności jednej osoby.

Studium 2: męski składnik w próbce

Autosomalny profil jest zdominowany przez DNA osoby pokrzywdzonej i ma słabe dodatkowe allele. Y-STR daje czysty haplotyp zgodny z osobą B.

Wniosek Y-STR może silnie wspierać obecność linii ojcowskiej B w badanym materiale. Nie rozróżnia automatycznie B od jego brata, ojca, syna lub dalszego krewnego tej samej linii. Jeśli któryś z nich jest realną alternatywą, musi wejść do propozycji.

Autosomalne i Y-STR nie są sprzeczne. Odpowiadają na różne warstwy tej samej mieszaniny.

Studium 3: zdegradowana kość

Z kości uzyskano częściowe STR, pełny mitogenom i panel SNP. Dostępna jest siostra domniemanej zmarłej oraz syn jej brata.

Siostra może dostarczyć informacji autosomalnej i — jeśli dzielą matkę — mtDNA. Syn brata nie ma mtDNA domniemanej zmarłej przez tę linię, ale może wnieść informację autosomalną. Jeśli zmarła była kobietą, Y-STR nie opisuje jej profilu.

Najlepszy model łączy wyniki, nie sumuje bezmyślnie „trzech zgodności”. Markery mogą być zależne, a relacje krewnych mają określone współczynniki.

Studium 4: SNP pochodzeniowe

Nieznany ślad ma profil autosomalnych STR bez trafienia w bazie. Panel AISNP wskazuje największe podobieństwo do próbek odniesienia z kilku regionów Europy.

Wynik nie mówi:

• że dawca ma konkretną narodowość;
• gdzie się urodził;
• jak się identyfikuje;
• gdzie mieszka;
• że nie ma przodków z innych regionów.

Opisuje prawdopodobieństwa lub udziały w ramach modelu, wybranych populacji referencyjnych i wersji panelu. Jeśli baza nie zawiera właściwej populacji, model może przypisać próbkę do najbliższej dostępnej.

Studium 5: identyczny Y-STR u dwóch braci

Dwaj bracia są kandydatami. Standardowy panel Y-STR jest zgodny u obu i ze śladem. Panel szybko mutujących Y-STR również nie wykazuje różnicy.

To nie awaria. Bracia odziedziczyli ten sam Y, a w analizowanych transmisjach nie zaszła wykrywalna mutacja. Rozstrzygnięcia trzeba szukać w autosomalnych markerach, innych dowodach albo bardziej bezpośredniej próbce. Dalsze mnożenie Y-STR nie gwarantuje indywidualizacji.

Najczęstsze błędy

„Więcej loci zawsze znaczy lepiej”. Loci zależne, słabo zwalidowane lub bez częstości mogą zwiększyć złożoność bez wartości.

Mnożenie Y-STR. Markery są współdziedziczone jako haplotyp.

Indywidualizacja przez mtDNA. Wspólna linia matczyna i częste haplotypy ograniczają rozróżnienie.

Haplogrupa jako narodowość. Filogeneza nie jest dokumentem tożsamości.

AISNP jako rasa. Model podobieństwa do baz referencyjnych nie tworzy biologicznych, ostrych kategorii ludzi.

Fenotyp jako portret. Predykcja cechy ma rozkład prawdopodobieństwa i zakres walidacji.

Amelogenina jako kompletna płeć. To marker chromosomalny z wyjątkami.

Profil długościowy równy sekwencyjnemu. Allele o tej samej długości mogą mieć inną sekwencję.

Brak trafienia równy częstości zero. Każda baza jest skończoną próbką.

Ta sama aparatura równy ten sam model. MPS może mierzyć wiele klas markerów, ale nie usuwa ich biologii.

Zgodność linii równy zgodności osoby. Y-STR i mtDNA obejmują krewnych.

Dobór bazy po wyniku. Populację i metodę powinno się uzasadnić przed poszukiwaniem najmniejszej liczby.

Jak dobrać panel

Praktyczna sekwencja decyzji:

1. zdefiniuj propozycje i jednostkę identyfikacji;
2. oceń materiał, ilość, degradację i mieszaninę;
3. określ, czy potrzebna jest osoba, linia genealogiczna, pokrewieństwo, pochodzenie czy cecha;
4. wybierz najmniejszy zwalidowany system dostarczający potrzebnej informacji;
5. zaplanuj kontrole i próbki odniesienia;
6. ustal bazę częstości i model zależności;
7. zdefiniuj kryteria porównania przed poznaniem kandydata;
8. zachowaj materiał na analizę uzupełniającą;
9. raportuj zakres, wersję i ograniczenia;
10. nie przenoś wniosku o profilu na poziom aktywności bez dodatkowego modelu.

Możliwa jest analiza sekwencyjna: najpierw standardowe STR, potem Y-STR przy małym składniku męskim, mtDNA przy włosie lub kości, albo SNP przy degradacji i dalekim pokrewieństwie. Kolejność musi uwzględniać zużycie próbki.

Co zapamiętać

1. Autosomalne STR są wieloalleliczne i dobrze rozróżniają osoby w zwalidowanym panelu.
2. Y-STR tworzą współdziedziczony haplotyp linii ojcowskiej; nie mnoży się ich jak niezależnych loci.
3. mtDNA ma wiele kopii i pomaga w trudnym materiale, ale opisuje linię matczyną.
4. Pojedynczy SNP jest zwykle dwualleliczny, dlatego identyfikacja wymaga dużego panelu.
5. SNP identyfikacyjne, pochodzeniowe, fenotypowe i pokrewieństwa mają różne cele.
6. Sekwencjonowanie ujawnia warianty niewidoczne w samym rozmiarze STR, ale wymaga nowej nomenklatury i baz.
7. Heteroplazmia, NUMT, stutter, mutacje i allele dropout są biologicznymi lub technicznymi elementami modelu.
8. Zgodność Y-STR albo mtDNA nie wskazuje automatycznie jednej osoby.
9. Baza populacyjna estymuje częstości; baza operacyjna wyszukuje kandydackie profile.
10. Wybór markera zaczyna się od pytania, nie od możliwości aparatury.