Kontrola, próba odniesienia i niepewność wyniku

Najkrótsza odpowiedź

Te trzy pojęcia odpowiadają na różne pytania.

Kontrola: czy procedura zadziałała i czy efekt ma prostsze wyjaśnienie?

Próba lub materiał odniesienia: względem czego przypisujemy wartość albo oceniamy zgodność?

Niepewność: jak szeroki jest zakres wartości zgodnych z wynikiem przy zastosowanej metodzie?

Wynik 5,0 bez jednostki, warunków, kontroli i informacji o jakości może być liczbą, lecz nie jest jeszcze wiarygodnym pomiarem.

Pomiar nie jest odczytaniem prawdy

Instrument wytwarza wskazanie. Wynik powstaje z:

• definicji wielkości;
• pobrania próbki;
• przygotowania;
• kalibracji;
• modelu;
• korekt;
• obliczeń;
• oceny jakości.

Termometr nie mierzy „temperatury próbki w ogóle”. Mierzy temperaturę w miejscu, czasie i warunkach kontaktu.

W biologii dodatkowo próbka może się zmieniać podczas pobrania i analizy.

Co jest wielkością mierzoną

Przed pomiarem trzeba zdefiniować measurand, czyli wielkość, której wartość chcemy przypisać.

„Ekspresja genu X” może oznaczać:

• liczbę cząsteczek RNA na komórkę;
• stężenie transkryptu;
• względny sygnał wobec genu referencyjnego;
• znormalizowaną liczbę odczytów;
• udział komórek dodatnich.

Każda definicja tworzy inny wynik. VIM porządkuje te podstawowe pojęcia metrologiczne, w tym wielkość, wynik, wzorcowanie i spójność pomiarową.¹

Kontrola nie jest jedną rzeczą

Kontrola ujemna

Powinna nie dawać badanego efektu.

Przykłady:

• reakcja PCR bez matrycy;
• komórki bez interwencji;
• rozpuszczalnik bez substancji aktywnej;
• przeciwciało pominięte w barwieniu;
• pusty wektor.

Jej sygnał pokazuje tło, zanieczyszczenie albo efekt procedury.

Kontrola dodatnia

Powinna dawać znany sygnał. Pokazuje, czy metoda była zdolna wykryć efekt.

Jeżeli kontrola dodatnia zawodzi, brak sygnału w próbce nie dowodzi braku analitu.

Kontrola proceduralna

Przechodzi przez krytyczne kroki podobnie jak próbka.

Może ujawnić:

• stratę w izolacji;
• inhibitor;
• błąd transportu;
• problem barwienia;
• wpływ elektroporacji;
• różnicę operatora.

Kontrola wewnętrzna

Znajduje się w tej samej reakcji lub próbce. Może sprawdzać amplifikację albo normalizację.

Nie może być uznana za stałą bez sprawdzenia. Gen referencyjny również może zmieniać ekspresję.

Kontrola odpowiada na konkretną alternatywę

Pusta studzienka ocenia tło odczynnika, ale nie kontroluje jakości pobrania.

Próbka bez matrycy wykrywa część zanieczyszczeń PCR, lecz nie dowodzi poprawnej identyfikacji pacjenta.

Kontrola dodatnia potwierdza zdolność metody, ale nie wyklucza zamiany etykiet.

Dlatego pytanie „czy była kontrola?” jest za mało precyzyjne. Trzeba zapytać, jakie wyjaśnienie kontrolowała.

Blank

Blank zawiera składniki pomiaru bez analitu lub bez próbki.

Może służyć do:

• ustalenia tła;
• korekty absorbancji;
• wykrycia zanieczyszczenia odczynników;
• sprawdzenia carry-over;
• wyzerowania wskazania.

Blank nie zawsze jest czystą wodą. Powinien reprezentować odpowiednią matrycę procesu.

Kontrola serii

Materiał kontrolny analizowany razem z próbkami pokazuje, czy bieżąca seria pozostaje pod kontrolą.

Wartość można nanosić na kartę kontrolną. Obserwuje się:

• przesunięcie;
• trend;
• wzrost rozrzutu;
• pojedynczy skrajny punkt;
• zmianę po nowej partii.

Granice kontrolne opisują zachowanie procesu. Nie są automatycznie granicami klinicznymi ani specyfikacją produktu.

Próba odniesienia

Sformułowanie może znaczyć próbkę używaną jako porównanie: zdrową, nieleczoną, wyjściową albo historyczną.

Jej przydatność zależy od podobieństwa:

• matrycy;
• pobrania;
• przechowywania;
• wieku;
• partii;
• procedury.

Kontrola biologiczna nie musi mieć wartości przypisanej metrologicznie.

Materiał odniesienia

Materiał odniesienia jest wystarczająco jednorodny i stabilny dla określonego zastosowania.

Może służyć do:

• kalibracji;
• sprawdzenia prawdziwości;
• walidacji;
• kontroli jakości;
• porównania laboratoriów.

Certyfikowany materiał odniesienia ma wartość i niepewność przypisane zgodnie z udokumentowaną procedurą oraz informację o spójności.

Nie każdy komercyjny „standard” jest CRM.

Kalibrator

Kalibrator ustanawia zależność między wskazaniem a wartością.

Przykładem jest seria znanych stężeń, z której powstaje krzywa.

Kalibracja wymaga ustalenia:

• zakresu;
• liczby punktów;
• modelu;
• ważenia;
• powtórzeń;
• kryteriów;
• sposobu obsługi punktów poza zakresem.

Linia narysowana przez punkty nie dowodzi, że model liniowy jest właściwy.

Wzorcowanie i regulacja to nie to samo

Wzorcowanie określa relację między wskazaniem a wartością odniesienia.

Regulacja zmienia instrument, aby wskazanie spełniało wymaganie.

Po regulacji potrzebne jest ponowne sprawdzenie. Samo „skalibrowanie” w języku potocznym często miesza obie operacje.

Spójność pomiarowa

Spójność oznacza możliwość powiązania wyniku z odniesieniem przez udokumentowany, nieprzerwany łańcuch wzorcowań, z których każde wnosi niepewność.

Nie jest to:

• podobieństwo dwóch wyników;
• zgodność z instrukcją;
• posiadanie certyfikatu urządzenia;
• użycie jednostki SI bez łańcucha.

W biologii pełna spójność do SI bywa trudna. Wtedy trzeba jasno wskazać odniesienie proceduralne lub arbitralną jednostkę.

Dokładność, prawdziwość i precyzja

W języku potocznym „dokładny” oznacza wszystko naraz.

Metrologicznie warto rozdzielić:

Prawdziwość — jak mały jest systematyczny błąd względem wartości odniesienia.

Precyzję — jak blisko siebie są powtarzane wskazania.

Dokładność — ogólną zgodność wyniku z wartością prawdziwą, bez prostego wyrażenia jedną liczbą.

Metoda może być precyzyjna i stale zawyżać.

Bias

Bias jest oszacowaniem systematycznej różnicy.

Może pochodzić z:

• kalibracji;
• ekstrakcji;
• matrycy;
• selektywności;
• operatora;
• algorytmu;
• utraty analitu;
• złej wartości odniesienia.

Jeżeli bias jest znany, można zastosować korektę. Niepewność korekty nadal pozostaje.

Powtarzalność

Dotyczy pomiarów w możliwie podobnych warunkach:

• ten sam operator;
• urządzenie;
• metoda;
• miejsce;
• krótki czas.

Pokazuje krótkoterminowy rozrzut.

Odtwarzalność i precyzja pośrednia

Zmiana dnia, operatora, instrumentu lub laboratorium daje szerszy obraz.

Precyzja pośrednia dotyczy zmian w jednym laboratorium.

Odtwarzalność zwykle obejmuje różne laboratoria.

Doskonała powtarzalność jednego operatora nie dowodzi, że metoda będzie stabilna w rutynie.

Powtórzenia techniczne i biologiczne

Trzykrotny odczyt tej samej probówki ocenia część zmienności pomiaru.

Trzy niezależne próbki oceniają zmienność biologiczną i przygotowania.

Uśrednienie technicznych studzienek nie zwiększa liczby dawców.

To rozróżnienie wpływa na:

• mianownik;
• model;
• niepewność;
• zakres wniosku.

Niepewność nie jest błędem ani pomyłką

Niepewność charakteryzuje rozrzut wartości, które można rozsądnie przypisać wielkości.

Wynik może mieć postać:

c = 5,2 mg/L ± 0,4 mg/L

Trzeba podać, co oznacza ±: odchylenie, niepewność standardową, rozszerzoną czy przedział statystyczny.

GUM opisuje klasyczne ramy identyfikacji składowych, ich łączenia i raportowania.²

Skąd bierze się niepewność

Źródła obejmują:

• pobranie;
• niejednorodność;
• objętość;
• masę;
• czystość;
• kalibrację;
• temperaturę;
• czas;
• odzysk;
• krzywą;
• powtarzalność;
• model;
• wartość materiału odniesienia.

Nie każda składowa jest niezależna. Nie należy bezmyślnie dodawać wszystkich liczb.

Podejście „od dołu”

Buduje model pomiaru i ocenia niepewność każdego wejścia.

Przykład stężenia:

c = m / V

Niepewność zależy od masy, objętości, korekt i ich współzależności.

To podejście jest przejrzyste, ale może pominąć źródło, którego nie wpisano do modelu.

Podejście „od góry”

Korzysta z danych walidacyjnych, kontroli jakości i precyzji pośredniej.

Może lepiej obejmować rzeczywistą rutynę, ale wymaga danych reprezentatywnych dla obecnego procesu.

Po zmianie urządzenia, matrycy lub zakresu historyczna ocena może przestać pasować.

Typ A i typ B

Ocena typu A korzysta z analizy statystycznej powtórzonych obserwacji.

Typ B opiera się na innych informacjach:

• certyfikacie;
• specyfikacji;
• rozdzielczości;
• wcześniejszych danych;
• literaturze;
• wiedzy o procesie.

Typ B nie znaczy gorszy. Oba typy powinny być przekształcone do porównywalnej postaci przed połączeniem.

Niepewność standardowa i rozszerzona

Połączona niepewność standardowa zachowuje skalę odpowiadającą odchyleniu standardowemu.

Niepewność rozszerzoną otrzymuje się przez mnożnik k, często około 2, aby uzyskać szerszy przedział przy określonych założeniach.

Nie wolno automatycznie tłumaczyć k=2 jako dokładnie 95% w każdym małym i nienormalnym zbiorze.

Budżet niepewności

Tabela może zawierać:

• składową;
• oszacowanie;
• rozkład;
• dzielnik;
• współczynnik czułości;
• niepewność standardową;
• wkład.

Budżet pokazuje, co dominuje. Jeżeli największy wkład ma pobranie, zakup dokładniejszej pipety niewiele zmieni.

Przewodnik Eurachem przekłada ogólne ramy GUM na analitykę chemiczną i pokazuje zarówno modelowanie źródeł, jak i użycie danych walidacyjnych oraz kontroli jakości.³

Niepewność pobierania próbek

Próbka ma reprezentować większy obiekt: partię, tkankę, populację albo środowisko.

Niejednorodność może przewyższać błąd instrumentu.

Przykłady:

• guz ma różne regiony;
• zawiesina osiada;
• proszek segreguje;
• biomarker zmienia się w czasie;
• wymaz pobiera różną ilość materiału.

Wynik dla dobrze zmierzonej, niereprezentatywnej próbki pozostaje mylący.

Granica wykrywalności

LoD dotyczy najniższego sygnału, który można wiarygodnie odróżnić od tła według przyjętej definicji.

Nie jest tym samym co:

• zero;
• najniższy kalibrator;
• granica oznaczalności;
• kliniczny próg.

Wynik poniżej LoD nie dowodzi absolutnego braku analitu.

Granica oznaczalności

LoQ dotyczy poziomu, przy którym wynik ilościowy spełnia przyjęte wymagania precyzji i biasu.

Można wykryć sygnał, którego stężenia nie da się jeszcze wiarygodnie podać liczbowo.

Raport 0 może być niepoprawny. Właściwe bywa <LoD albo <LoQ, zgodnie z procedurą.

Zakres pomiarowy

Wynik powyżej najwyższego kalibratora nie powinien być wyliczany przez odległą ekstrapolację bez walidacji.

Można:

• rozcieńczyć próbkę;
• użyć innego zakresu;
• zgłosić > zakres;
• zwalidować rozszerzenie.

Rozcieńczenie wnosi własną niepewność i może ujawnić efekt matrycy.

Selektywność i interferencje

Metoda powinna reagować na analit w obecności innych składników.

Interferencją może być:

• hemoliza;
• lipemia;
• bilirubina;
• podobna sekwencja;
• nieswoiste przeciwciało;
• inhibitor PCR;
• autofluorescencja.

Kontrola czystego analitu nie zawsze reprezentuje trudną matrycę biologiczną.

Odzysk

Do próbki można dodać znaną ilość analitu i sprawdzić odzysk.

Odzysk mniejszy niż 100% może wskazywać stratę lub wpływ matrycy. Większy niż 100% może wynikać z interferencji, biasu albo modelu.

Spike nie zawsze zachowuje się jak analit naturalnie związany w próbce.

Porównanie metod

Wysoka korelacja nie dowodzi zgodności.

Dwie metody mogą mieć r bliskie 1, a jedna stale zawyżać.

Porównanie powinno oceniać:

• różnicę;
• bias zależny od poziomu;
• zakres;
• niepewność obu metod;
• wpływ na decyzję.

Wykres różnic bywa bardziej informacyjny niż sama regresja.

Kryterium akceptacji

Kryterium określa, kiedy:

• kontrola jest ważna;
• partia przechodzi;
• metoda spełnia wymaganie;
• wynik wymaga powtórzenia;
• produkt można zwolnić.

Powinno powstać przed zobaczeniem wyniku.

Granica procesu, granica specyfikacji i granica biologiczna nie są tym samym.

Reguła decyzji

Jeżeli wynik jest blisko granicy, niepewność wpływa na ryzyko błędnej decyzji.

Przykład:

• wymaganie: ≤ 10;
• wynik: 9,8;
• niepewność rozszerzona: ± 0,7.

Samo 9,8 < 10 nie opisuje ryzyka. Reguła powinna określać, czy stosuje się pasmo ochronne i kto ponosi ryzyko fałszywej akceptacji.

Fałszywie dodatni i fałszywie ujemny

Test może:

• wykryć coś, czego nie ma;
• nie wykryć czegoś, co jest.

Częstość zależy od:

• progu;
• czułości;
• swoistości;
• jakości próbki;
• częstości zjawiska;
• etapu testowania.

Wynik dodatni rzadkiego zjawiska może wymagać metody potwierdzającej.

Niepewność a przedział ufności

Przedział ufności opisuje niepewność oszacowania parametru w modelu statystycznym.

Niepewność pomiaru dotyczy wartości przypisywanej measurandowi i może zawierać składowe kalibracji, przygotowania oraz modelu.

Pojęcia mogą używać podobnej matematyki, ale nie są automatycznie tym samym.

Niepewność a zmienność biologiczna

Stężenie może naprawdę zmieniać się między dniami i osobami.

Nie każda różnica jest błędem pomiaru. Trzeba rozdzielić:

• zmienność w osobie;
• zmienność między osobami;
• pobranie;
• analizę.

Pojedynczy bardzo precyzyjny pomiar nie opisuje całej dynamiki biologicznej.

Walidacja i weryfikacja

Walidacja dostarcza dowodu, że metoda nadaje się do zamierzonego celu.

Może obejmować:

• selektywność;
• zakres;
• liniowość;
• precyzję;
• bias;
• LoD;
• LoQ;
• odporność;
• niepewność.

Weryfikacja potwierdza, że laboratorium potrafi osiągnąć deklarowane właściwości gotowej metody w swoich warunkach.

Robustness

Odporność metody sprawdza małe, realistyczne zmiany:

• czas;
• temperaturę;
• operatora;
• partię;
• urządzenie;
• pH;
• kolejność.

Jeżeli wynik zmienia się po minucie opóźnienia, procedura musi szczególnie kontrolować czas albo zostać poprawiona.

Materiał kontrolny może się starzeć

Stabilność zależy od:

• temperatury;
• światła;
• wilgoci;
• rozmrożeń;
• pojemnika;
• czasu po otwarciu.

Kontrola z wartością historyczną nie jest wiarygodna, jeżeli była przechowywana poza zakresem.

Trend ważniejszy niż pojedyncza zgodność

Każda seria może jeszcze mieścić się w granicach, a proces stopniowo dryfować.

Trend może ujawnić:

• zużycie lampy;
• starzenie odczynnika;
• zmianę temperatury;
• bias operatora;
• nową partię.

Monitorowanie pozwala działać przed przekroczeniem granicy.

Porównania międzylaboratoryjne

Ta sama próbka trafia do wielu laboratoriów. Porównanie pokazuje:

• bias;
• rozrzut;
• problem metody;
• wpływ kalibracji;
• zgodność grupy.

Dobry wynik programu biegłości wspiera kompetencję, lecz nie zastępuje codziennej kontroli.

Jak czytać wynik laboratoryjny

Zapytaj:

1. Co dokładnie mierzono?
2. Jaka jest jednostka?
3. Jak pobrano próbkę?
4. Jaki był zakres?
5. Czy kontrole były ważne?
6. Co stanowiło odniesienie?
7. Jaka jest niepewność lub precyzja?
8. Czy wynik leży blisko granicy?
9. Czy metoda wykrywa interferencje?
10. Czy potrzebne jest potwierdzenie?

Przykład: liczba komórek

Automatyczny licznik podaje 1,02 × 10^6 komórek/ml.

Na niepewność wpływają:

• wymieszanie;
• agregaty;
• rozcieńczenie;
• objętość;
• pole komory;
• próg obrazu;
• definicja żywotności;
• powtórzenie.

Sześć cyfr nie oznacza sześciu cyfr wiarygodnych.

Przykład: qPCR

Wynik zależy od:

• jakości RNA;
• odwrotnej transkrypcji;
• wydajności starterów;
• progu;
• genu referencyjnego;
• różnic między płytkami;
• modelu względnego.

Różnica Ct nie jest bezpośrednio liczbą cząsteczek bez założeń.

Kontrola bez matrycy, bez odwrotnej transkrypcji oraz krzywa albo zwalidowana wydajność odpowiadają na różne problemy.

Przykład: test jakości produktu komórkowego

Partia może mieć kryteria:

• tożsamości;
• czystości;
• żywotności;
• sterylności;
• potency;
• dawki.

Każdy wynik ma inną metodę, czas i niepewność. Sterylność nie zastępuje tożsamości, a wysoka żywotność nie dowodzi funkcji.

Decyzja o zwolnieniu jest koniunkcją wymagań, nie średnią atrakcyjnych wyników.

Najczęstsze pomyłki

„Kontrola jest próbką wzorcową”

Czasem materiał pełni obie role, ale kontrola ważności i nadawanie skali są różnymi funkcjami.

„Trzy powtórzenia dają niepewność metody”

Pokazują tylko część krótkoterminowego rozrzutu.

„Kalibracja usuwa błąd”

Ustanawia relację i umożliwia korektę; sama ma niepewność.

„Poniżej LoD znaczy zero”

Znaczy, że metoda nie rozróżnia wiarygodnie sygnału na tym poziomie.

„Więcej miejsc po przecinku znaczy dokładniej”

Rozdzielczość wyświetlacza nie jest dokładnością pomiaru.

„Zgodność z granicą jest oczywista”

Blisko granicy zależy od reguły decyzji i niepewności.

Minimalna karta wyniku

Measurand: co dokładnie.

Próbka: źródło, czas, przygotowanie.

Metoda: wersja i zakres.

Kontrole: rodzaj i kryterium ważności.

Odniesienie: kalibrator, CRM albo procedura.

Wynik: wartość i jednostka.

Niepewność: rodzaj, zakres i współczynnik.

Ograniczenia: interferencje, LoD, LoQ.

Reguła decyzji: sposób porównania z granicą.

Jeżeli brakuje tych informacji, należy ograniczyć pewność wniosku.

Co warto zapamiętać

• Kontrola sprawdza ważność i alternatywne wyjaśnienia.
• Blank, kontrola ujemna i dodatnia pełnią inne role.
• Materiał odniesienia może nadawać wartość i porównywalność.
• Spójność wymaga udokumentowanego łańcucha.
• Precyzja nie gwarantuje braku biasu.
• Powtarzalność nie jest pełną odtwarzalnością.
• Niepewność obejmuje więcej niż rozrzut powtórzeń.
• Pobranie może dominować nad instrumentem.
• LoD, LoQ i zakres nie są tym samym.
• Decyzja blisko granicy wymaga jawnej reguły.

Dokąd dalej

Pełne podstawy rozwija Metrologia w laboratorium biologicznym.

Praktykę zapisu opisuje Zapisy laboratoryjne i identyfikowalność wyniku.

Konkretne narzędzia omawiają Pipety i dozowanie oraz Waga analityczna.

Źródła