Mejoza, rekombinacja, sprzężenie i haplotypy

Streszczenie

Mejoza jest programem podziału komórki, który po jednej replikacji DNA przeprowadza dwa kolejne rozdziały chromosomów. Najpierw rozdzielają się chromosomy homologiczne, a następnie chromatydy siostrzane. Dzięki temu z komórki diploidalnej powstają komórki haploidalne, zdolne połączyć się podczas zapłodnienia bez podwajania liczby zestawów chromosomów w każdym pokoleniu.

Mejoza nie jest tylko „mitozą wykonaną dwa razy”. W długiej profazie I homologi rozpoznają się, ustawiają parami i wymieniają fragmenty między chromatydami niesiostrzanymi. Crossing-over tworzy nowe połączenia alleli, ale pełni też rolę mechaniczną: wraz z kohezją utrzymuje homologiczne chromosomy jako biwalent, ułatwiając ich prawidłowy rozdział.

Pojęcia sprzężenie, rekombinacja, haplotyp i faza opisują skutki tego procesu:

• warianty leżące na tej samej fizycznej cząsteczce tworzą haplotyp;
• ich położenie na tej samej albo przeciwnej kopii chromosomu jest fazą;
• bliskie loci zwykle są dziedziczone razem, czyli są sprzężone;
• crossing-over może rozdzielić ich allele i utworzyć haplotyp rekombinowany;
• częstość rekombinacji pozwala budować mapę genetyczną, ale nie jest tym samym co odległość w parach zasad.

Najbezpieczniejszy łańcuch rozumowania wygląda tak:

homologi i chromatydy → parowanie i rekombinacja → chiazma i segregacja → haploidalna gameta → odziedziczony haplotyp → genotyp potomstwa.

Nie każdy rekombinacyjny punkt pęknięcia daje crossover. Nie każdy crossover rozdziela dwa badane markery. Dwa allele znalezione u jednej osoby nie muszą leżeć na tej samej kopii genu. A wynik 50% rekombinantów nie dowodzi, że loci znajdują się na różnych chromosomach.

Artykuł rozwija wspólny materiał trzech ponownie przejrzanych podręczników: Lewis łączy zachowanie chromosomów z analizą człowieka i mapowaniem, Robinson prowadzi od mejozy do praw Mendla, a tom pod redakcją Bala przenosi fazę oraz segregację do diagnostyki rodzin.^10,11,12

Cztery obiekty, których nie wolno pomylić

Przed replikacją komórka diploidalna ma po dwa chromosomy homologiczne każdego autosomu: jeden odziedziczony od matki i jeden od ojca. Homologi zawierają odpowiadające sobie loci, ale nie muszą mieć identycznych alleli.

Po replikacji każdy homolog składa się z dwóch chromatyd siostrzanych. Siostry są produktami kopiowania jednej cząsteczki DNA i początkowo powinny mieć niemal tę samą sekwencję. Homologi są natomiast dwiema odziedziczonymi wersjami całego chromosomu.

Obiekt	Co go łączy	Ile cząsteczek DNA zawiera po replikacji	Typowa pomyłka
chromatydy siostrzane	wspólne pochodzenie z jednej replikowanej cząsteczki	po jednej każda	nazywanie ich chromosomami matczynym i ojcowskim
chromosomy homologiczne	te same główne loci i podobna budowa	po dwie chromatydy każdy	uznawanie ich za identyczne kopie
biwalent	sparowane dwa zreplikowane homologi	cztery	utożsamianie czterech chromatyd z czterema homologami
chiazma	cytologiczny ślad po crossoverze podtrzymywany przez kohezję	nie jest osobną cząsteczką	traktowanie jej jak trwałego „węzła DNA”

To rozróżnienie zapobiega najczęstszemu błędowi: crossing-over zachodzi zwykle między niesiostrzanymi chromatydami dwóch homologów, nie między dwoma całymi chromosomami jako nierozdzielnymi blokami.

Liczba chromosomów i ilość DNA zmieniają się niezależnie

Oznaczenia n i C mierzą inne rzeczy:

• n — liczbę zestawów homologicznych chromosomów;
• C — ilość DNA względem haploidalnego genomu przed replikacją.

W uproszczonym schemacie ludzkiej mejozy:

Etap	Zestawy chromosomów	Ilość DNA	Co jest połączone
przed replikacją	2n	2C	pojedyncza chromatyda w każdym chromosomie
po fazie S	2n	4C	siostry połączone kohezyną
po mejozie I	n	2C	każdy chromosom nadal ma dwie siostry
po mejozie II	n	1C	pojedyncze chromatydy w gametach

Redukcja ploidalności następuje w pierwszym podziale, choć chromatydy siostrzane rozdzielają się dopiero w drugim. Ten rachunek został szerzej omówiony w artykule o cyklu komórkowym, ploidalności i ilości DNA.

Jedna replikacja, dwa podziały

Mejozę można potraktować jako system logistyczny z trzema zadaniami:

1. znaleźć właściwy homolog;
2. utworzyć stabilne połączenia pozwalające ustawić parę na wrzecionie;
3. zwolnić połączenia w odpowiedniej kolejności.

NHGRI ujmuje wynik jako redukcję liczby chromosomów w komórkach rozrodczych; diploidalna komórka przechodzi dwa podziały prowadzące do haploidalnych produktów.¹ Ten krótki opis mówi, po co jest mejoza, lecz nie pokazuje, ile mechanizmów musi zadziałać między replikacją i końcowym rozdziałem.

Mejoza I jest podziałem redukcyjnym

W anafazie I do przeciwnych biegunów odchodzą dwa homologi. Centromery chromatyd siostrzanych zachowują wspólną orientację, a kohezja w ich pobliżu pozostaje chroniona. Każda komórka potomna dostaje więc jeden z homologów, nadal złożony z dwóch chromatyd.

Mejoza II przypomina mitozę

Bez kolejnej pełnej replikacji DNA chromosomy ustawiają się ponownie. Kohezja centromerowa zostaje zwolniona, a chromatydy siostrzane rozchodzą się do oddzielnych produktów.

„Przypomina” nie znaczy „jest identyczna”. Materiał przeszedł już rekombinację, komórka ma jeden zestaw homologów, a przebieg dojrzewania gamet jest zależny od płci i gatunku.

Cztery produkty nie zawsze stają się czterema gametami

W spermatogenezie jedna komórka pierwszorzędowa może dać cztery haploidalne spermatydy. W oogenezie człowieka podziały cytoplazmy są asymetryczne: większość cytoplazmy zachowuje oocyt, a pozostałe produkty tworzą ciałka kierunkowe.

Podręcznikowy obraz czterech równych komórek opisuje rachunek jąder, nie uniwersalny los komórek. Warto odróżniać wynik mejozy od całego procesu gametogenezy, który obejmuje wzrost, różnicowanie, selekcję i dojrzewanie.

Profaza I jest osią całego programu

Profaza I dzieli się na etapy opisujące stopień parowania i rekombinacji.

Leptoten

Zreplikowane chromosomy zaczynają kondensować. Programowane pęknięcia obu nici inicjują rekombinację. Osie chromosomowe organizują chromatynę w pętle i tworzą rusztowanie dla dalszych reakcji.

Zygoten

Homologi zbliżają się i rozpoczyna się synapsis, czyli ścisłe ustawianie ich osi. Powstaje kompleks synaptonemalny, białkowa struktura utrzymująca homologi w regularnej odległości.

Pachyten

Kompleks synaptonemalny obejmuje parę na znacznej długości. Intermedianty rekombinacyjne dojrzewają; część zostanie rozwiązana jako crossovers, a część bez wymiany ramion.

Diploten

Kompleks synaptonemalny zanika. Homologi odsuwają się, ale pozostają związane w miejscach odpowiadających crossoverom. Te widoczne punkty to chiazmy.

Diakineza

Chromosomy silniej się kondensują, a biwalenty przygotowują się do ustawienia na wrzecionie. Połączenie chiazm i kohezji sprawia, że naprężenie może powstać między homologami przyłączonymi do przeciwnych biegunów.

Nazwy etapów są opisem morfologii, nie pięcioma przełącznikami. Procesy nakładają się w czasie, a dokładny przebieg różni się między organizmami i między oogenezą oraz spermatogenezą.

Rekombinacja zaczyna się od kontrolowanego uszkodzenia DNA

W komórkach somatycznych pęknięcie obu nici jest zagrożeniem. W mejozie takie pęknięcia są programowo wytwarzane, aby rozpocząć poszukiwanie homologicznej sekwencji.

Białko SPO11 tworzy pęknięcie i pozostaje chwilowo kowalencyjnie związane z końcami. Po jego usunięciu końce DNA są przetwarzane tak, by powstały jednoniciowe odcinki. Białka rekombinacyjne, w tym DMC1 i RAD51, pomagają jednej nici znaleźć podobną sekwencję i wejść w dwuniciową cząsteczkę homologu.

W uproszczeniu:

1. SPO11 tworzy DSB;
2. końce zostają zresekowane;
3. nić poszukuje homologii;
4. powstaje heterodupleks z nićmi pochodzącymi z różnych homologów;
5. DNA jest dosyntetyzowane;
6. intermediant zostaje rozwiązany jako crossover albo non-crossover.

Rekombinacja homologiczna nie jest „losowym sklejeniem”. Wymaga podobieństwa sekwencji i jest kontrolowana przez architekturę chromosomu. Mimo to powtarzające się fragmenty mogą zostać dopasowane nieallelicznie, co prowadzi do delecji, duplikacji lub inwersji omawianych w artykule o wariantach strukturalnych.

Crossover i non-crossover

Crossover wymienia duże odcinki flankujące miejsce rekombinacji. Po takim zdarzeniu jedna chromatyda zawiera część haplotypu jednego homologu i część drugiego.

Non-crossover naprawia pęknięcie z użyciem homologu bez wzajemnej wymiany całych ramion. Może pozostawić krótki odcinek konwersji genowej, w którym informacja z jednego homologu została przepisana na drugi.

Dlatego:

• liczba pęknięć jest większa niż liczba crossoverów;
• brak crossoveru nie oznacza braku rekombinacyjnej naprawy;
• mały odcinek może zmienić allel bez wymiany markerów flankujących;
• mapa crossoverów nie jest pełną mapą wszystkich zdarzeń rekombinacyjnych.

Kompletne mapy ludzkiej rekombinacji łączące crossovers i non-crossovers pokazują, że obie klasy mają powiązany, ale nie identyczny rozkład oraz różne relacje z mutacjami de novo.²

Heterodupleks i konwersja genowa

W heterodupleksie jedna nić pochodzi z jednego homologu, a druga z drugiego. Jeśli w miejscu wariantu zawierają różne zasady, powstaje niedopasowanie. System naprawy może wybrać jeden zapis jako wzorzec, zmieniając oczekiwany stosunek produktów.

Konwersja genowa jest nieodwzajemnionym przekazaniem krótkiej informacji. Nie łamie praw chemii, ale może sprawić, że konkretny marker nie segreguje w idealnym stosunku 1:1. W analizie bardzo krótkich odległości stanowi alternatywę dla prostego modelu crossoveru.

Chiazma jest mechanicznie ważniejsza niż ilustracja „wymiany koloru”

Popularny rysunek pokazuje dwa kolorowe chromosomy krzyżujące ramiona. Biologicznie ważne jest, że po rekombinacji:

• homologiczne chromatydy są połączone w miejscu wymiany;
• kohezyna nadal spaja siostry wzdłuż ramion;
• chiazma staje się pośrednim połączeniem całych homologów;
• mikrotubule mogą wytworzyć przeciwne naprężenie;
• po usunięciu kohezji z ramion homologi mogą się rozdzielić.

Crossing-over służy więc jednocześnie różnorodności i prawidłowej segregacji. Biwalent bez odpowiedniego crossoveru jest bardziej narażony na błędną orientację. Istnieją gatunki i szczególne chromosomy wykorzystujące dodatkowe rozwiązania, ale w typowym modelu ssaków co najmniej jeden odpowiednio położony crossover jest ważnym zabezpieczeniem pary.

Kohezja musi być zwalniana dwustopniowo

W mejozie I kohezja na ramionach zostaje usunięta, co pozwala rozwiązać chiazmy. Kohezja centromerowa jest chroniona, dlatego siostry odchodzą razem. W mejozie II ochrona zanika i rozdzielają się centromery sióstr.

Przedwczesna utrata kohezji może rozłączyć siostry lub osłabić chiazmy. Zbyt trwała kohezja może natomiast blokować prawidłową anafazę. Kluczowy jest czas i położenie, nie po prostu „obecność kohezyny”.

Crossovers nie są rozmieszczone równomiernie

Rekombinacja występuje częściej w hotspotach i rzadziej w coldspotach. Mapa genetyczna jest więc lokalnie rozszerzona lub ściśnięta względem mapy fizycznej.

W wielu ssakach ważną rolę pełni PRDM9. Jego domena palców cynkowych rozpoznaje motywy DNA, a domena enzymatyczna modyfikuje chromatynę i sprzyja skierowaniu maszynerii rekombinacyjnej w określone miejsca. Warianty PRDM9 zmieniają aktywność ludzkich hotspotów i mogą również wpływać na niestabilność niektórych rearanżacji.³

To nie znaczy, że:

• każdy motyw wiążący stanie się hotspotem;
• hotspot działa tak samo u wszystkich osób;
• wszystkie crossovers zależą od jednego allelu PRDM9;
• położenia hotspotów są niezmienne ewolucyjnie.

Motyw aktywnie używany jako wzorzec może być stopniowo usuwany przez tendencyjną konwersję genową. Nowe allele PRDM9 rozpoznające inne sekwencje zmieniają krajobraz — zjawisko bywa opisywane jako paradoks hotspotów.

Interferencja crossoverów

Crossovers nie są niezależnymi punktami rzucanymi losowo na chromosom. Powstanie jednego zmniejsza prawdopodobieństwo drugiego w pobliżu. Jest to interferencja.

Interferencja pomaga rozmieścić ograniczoną liczbę crossoverów wzdłuż biwalentu. Wraz z mechanizmami:

• assurance — zapewnienia co najmniej jednego crossoveru;
• homeostasis — stabilizowania liczby crossoverów mimo zmian liczby DSB;
• maturation — wyboru części intermediantów;

tworzy regulowany wzór, a nie prosty proces Poissona.⁴

W analizie rodowodów oznacza to, że prawdopodobieństwo dwóch bliskich crossoverów nie jest po prostu iloczynem średnich lokalnych częstości.

Płeć zmienia mapę rekombinacji

Mapa matczyna i ojcowska różnią się długością oraz rozmieszczeniem crossoverów. Analiza ponad 100 tysięcy mejoz wykazała u człowieka wyższą łączną częstość crossoverów u kobiet, natomiast w pobliżu telomerów często obserwuje się relatywnie większą aktywność męską.⁵

Nie wynika to z różnic sekwencji autosomów. Kontekst oogenezy i spermatogenezy — czas profazy, organizacja osi, chromatyna, selekcja gamet i regulatory — zmienia prawdopodobieństwa.

Dlatego jedno przeliczenie „1 cM ≈ 1 Mb” jest tylko bardzo luźną średnią. Na krótkim odcinku stosunek może być wielokrotnie inny, a do analizy rodzinnej należy wybierać mapę właściwą dla płci rodzica przekazującego haplotyp.

Niezależna segregacja działa na poziomie par chromosomów

Podczas metafazy I orientacja każdego biwalentu względem biegunów jest w dużej mierze niezależna od orientacji innych par. Bez uwzględniania rekombinacji osoba o 23 parach chromosomów może wytworzyć co najmniej 2^23, czyli ponad 8 milionów kombinacji homologów.

To ćwiczenie pokazuje skalę kombinatoryki, ale ma ograniczenia:

• chromosom po crossoverach nie jest już w całości „matczyny” albo „ojcowski”;
• chromosomy płci wymagają osobnego opisu;
• nowe warianty i konwersja genowa dodają różnice;
• gamety podlegają selekcji;
• nie wszystkie produkty mejozy są żywotne;
• mtDNA ma inny sposób dziedziczenia.

Prawo niezależnej segregacji dobrze działa dla loci na różnych chromosomach. Dla loci na tym samym chromosomie trzeba uwzględnić sprzężenie.

Haplotyp jest zapisem jednej fizycznej kopii

Haplotyp to zestaw alleli lub wariantów leżących na tej samej cząsteczce DNA i wykazujących tendencję do wspólnego dziedziczenia.⁶ Zakres słowa zależy od pytania:

• dwa warianty w jednym genie;
• allele kilku markerów w regionie;
• całe ramię chromosomu;
• sekwencja chromosomu przekazana przez jednego rodzica;
• haplotyp mtDNA lub chromosomu Y.

Nie istnieje jedna naturalna długość haplotypu. Rekombinacja w kolejnych pokoleniach dzieli stare segmenty na coraz krótsze bloki, ale lokalny rozkład hotspotów i historia populacji powodują duże różnice.

Faza odpowiada na pytanie „na której kopii?”

Załóżmy dwa heterozygotyczne loci:

• w locus 1 allele A/a;
• w locus 2 allele B/b.

Możliwe są co najmniej dwa układy:

• cis, coupling: AB / ab;
• trans, repulsion: Ab / aB.

Zapis A/a; B/b nie rozróżnia tych sytuacji. To genotyp niefazowany. Zapis z ukośnikiem między haplotypami wymaga danych o fazie.

Faza ma znaczenie w chorobie recesywnej. Dwa patogenne warianty tego samego genu:

• w trans mogą uszkadzać obie kopie;
• w cis pozostawiają drugą kopię bez tych wariantów.

Ma też znaczenie w farmakogenomice. Jeśli duplikowany allel zawiera wariant zmniejszający funkcję, całkowita aktywność będzie inna niż przy duplikacji allelu prawidłowego.

Faza rodzicielska i faza fizyczna

„Matczyny” i „ojcowski” bywają dwuznaczne. Mogą oznaczać:

• homolog odziedziczony przez badaną osobę od jej matki lub ojca;
• fragment chromosomu pochodzący od babki lub dziadka;
• chromatydę znajdującą się w oocycie albo plemniku.

Po wielu crossoverach chromosom przekazywany dziecku jest mozaiką fragmentów pochodzących od dwóch dziadków. Nadal jest w całości przekazany przez jednego rodzica. Trzeba więc podać pokolenie odniesienia.

Jak ustala się fazę

Badanie rodziców

Jeśli matka ma wariant A, ojciec wariant B, a dziecko oba, można często wnioskować, że są w trans. Trio pomaga też odróżniać wariant odziedziczony od de novo i kontrolować pomylenie próbki.

Ograniczenia:

• rodzic może mieć mozaikę;
• wariant może nie być wykryty z powodu dropout;
• pokrewieństwo może być inne niż założono;
• faza w powtórzonym lub wielokopiowym locus pozostaje niejednoznaczna;
• rekombinacja między markerami może zmienić dalszy haplotyp.

Odczyt obejmujący oba warianty

Jeżeli pojedynczy odczyt lub para odczytów łączy oba miejsca, można ustalić lokalną fazę fizyczną. Długie odczyty zwiększają zasięg, lecz powtórzenia i błędy nadal ograniczają wynik.

Read-backed phasing buduje bloki z zachodzących odczytów. Przerwa w pokryciu lub region homozygotyczny może przerwać blok. Dwa oddzielne bloki nie mają automatycznie wspólnej orientacji.

Klonowanie cząsteczek i allele-specific PCR

Rozdzielenie pojedynczych cząsteczek, klonowanie ampliconów lub primer swoisty dla allelu może odpowiedzieć na celowane pytanie. Metody wymagają kontroli chimer PCR, błędów polimerazy i reprezentacji obu alleli.

Faza statystyczna

W populacji pewne kombinacje alleli występują częściej. Algorytm może przypisać najbardziej prawdopodobne haplotypy na podstawie panelu referencyjnego. Jest to użyteczne w badaniach asocjacyjnych i imputacji, ale pozostaje wnioskowaniem.

Pewność spada dla:

• rzadkich wariantów;
• populacji słabo reprezentowanych w panelu;
• rearanżacji i CNV;
• osób o złożonym pochodzeniu;
• regionów o wysokiej rekombinacji;
• wariantów de novo.

Statystyczna faza nie powinna być przedstawiana jako bezpośredni odczyt cząsteczki.

Sprzężenie jest własnością dziedziczenia dwóch loci

Dwa loci na tym samym chromosomie są sprzężone, ponieważ ich allele częściej przechodzą razem niż gdyby segregowały całkowicie niezależnie. Siła obserwowanego sprzężenia zależy od częstości crossoveru między nimi.

W dwulocusowym układzie AB/ab gamety rodzicielskie to AB i ab, a rekombinowane — Ab i aB. Jeśli częstość rekombinacji wynosi r, przy prostych założeniach:

• każda klasa rodzicielska ma częstość (1-r)/2;
• każda klasa rekombinowana ma częstość r/2.

r mieści się między 0 i 0,5. Wartość 0 oznacza brak obserwowanych rekombinantów w badanym materiale, nie zerową odległość fizyczną. Wartość 0,5 oznacza zachowanie jak przy niezależnej segregacji, ale nie rozstrzyga, czy loci leżą na różnych chromosomach, czy daleko na tym samym.

Dlaczego częstość nie może przekroczyć 50%

Pojedynczy crossover między markerami zmienia układ rodzicielski na rekombinowany. Dwa crossovers mogą go przywrócić, trzy znów zmienić. Przy dużej odległości wielokrotne zdarzenia sprawiają, że końcowe klasy zbliżają się do proporcji 1:1, a obserwowana rekombinacja do 50%.

Dlatego:

• 10% rekombinantów można przybliżyć 10 cM dla krótkiego odcinka;
• 40% nie oznacza automatycznie 40 cM;
• 50% nie oznacza nieskończonej odległości;
• suma krótkich interwałów może dać mapę dłuższą niż wskazuje bezpośrednie porównanie skrajnych markerów.

Centimorgan nie jest jednostką długości DNA

Jeden centimorgan odpowiada 1% prawdopodobieństwa, że markery zostaną rozdzielone przez rekombinację w jednej mejozie.⁷ Jest jednostką mapy genetycznej.

Para zasad należy do mapy fizycznej. Przeliczenie zależy od:

• chromosomu i regionu;
• płci;
• populacji i alleli regulatorowych;
• użytej mapy;
• rozdzielczości danych.

Średnie „około miliona zasad na cM” może być pomocą orientacyjną dla człowieka, lecz nie wolno go stosować do lokalnego projektowania markerów.

Funkcje mapujące

Funkcja mapująca zamienia obserwowaną częstość rekombinacji na szacowaną odległość uwzględniającą wielokrotne crossovers. Różne funkcje przyjmują inne modele:

• funkcja Haldane’a zakłada brak interferencji;
• funkcja Kosambiego uwzględnia określony wzór interferencji.

Żadna prosta funkcja nie odtwarza całej biologii hotspotów i różnic płci. Jest modelem użytecznym w określonym zakresie, nie prawem natury.

Mapa genetyczna powstaje z wielu mejoz

Nie obserwuje się „odległości 12 cM” w jednej komórce. W pojedynczej mejozie między markerami crossover wystąpił albo nie. Odległość jest statystyką oszacowaną na podstawie wielu przekazań.

Historycznie mapy budowano, analizując fenotypy i markery w rodzinach. Obecnie można:

• genotypować rodziców i dzieci;
• odczytywać pojedyncze plemniki;
• analizować oocyty lub ciałka kierunkowe w badaniach rozrodu;
• sekwencjonować wielopokoleniowe rodowody;
• wnioskować o historycznej rekombinacji z populacyjnych haplotypów.

Każde źródło odpowiada na inne pytanie. Rodowód widzi crossovers przekazane żywemu potomstwu, a więc po selekcji gamet i zarodków. Pojedyncze plemniki obejmują wcześniejszy etap, ale tylko męską mejozę. Populacyjny LD integruje wiele pokoleń i procesów demograficznych.

Pierwsze wysokorozdzielcze mapy rodzinne pokazały różnice położenia maksimów rekombinacji między mapą matczyną i ojcowską.⁸ Późniejsze bezpośrednie mapy dziesiątek tysięcy par rodzic–dziecko zwiększyły rozdzielczość i ujawniły różnice między osobami oraz populacjami.⁹

Sprzężenie w rodowodzie to nie nierównowaga sprzężeń w populacji

Nazwy są podobne, ale poziomy analizy inne.

Linkage pyta, czy loci są wspólnie przekazywane w rodzinie częściej, niż oczekiwano przy niezależnej segregacji.

Linkage disequilibrium, czyli nierównowaga sprzężeń (LD), pyta, czy allele dwóch loci współwystępują w populacji częściej lub rzadziej niż wynikałoby z iloczynu ich częstości.

LD zależy nie tylko od fizycznej odległości i rekombinacji, lecz także od:

• wieku wariantu;
• dryfu genetycznego;
• doboru;
• migracji i domieszania populacji;
• efektu założyciela;
• wąskiego gardła;
• struktury próby;
• błędów genotypowania.

Dwa bliskie loci mogą mieć słaby LD w starej, dużej populacji. Dwa odległe albo niesprzężone loci mogą chwilowo wykazywać LD po domieszaniu populacji lub wskutek selekcji.

D, D′ i r² mierzą różne aspekty

Dla dwóch dwuallelicznych loci odchylenie:

D = p(AB) - p(A)p(B)

porównuje obserwowaną częstość haplotypu z oczekiwaną przy niezależności. Samo D zależy od częstości alleli.

D′ normalizuje wynik do maksymalnego możliwego odchylenia przy danych częstościach. Może być wysokie nawet wtedy, gdy jeden allel jest rzadki i mało użyteczny jako predyktor.

r² mierzy korelację alleli i lepiej odpowiada na pytanie, jak dobrze marker przewiduje drugi wariant. Niskie r² przy wysokim D′ nie jest sprzecznością; miary odpowiadają na inne pytania.

Blok haplotypowy nie jest murem

„Blok haplotypowy” jest regionem wyznaczonym według konkretnego algorytmu i progów LD. Granice:

• zależą od populacji;
• zależą od zestawu markerów;
• nie zatrzymują wszystkich crossoverów;
• nie są trwałą jednostką anatomiczną;
• mogą zmienić się przy większej próbie.

Bloki ułatwiają dobór tag SNP i imputację, ale nie powinny być traktowane jak geny albo chromosomy.

Analiza sprzężeń lokalizuje region, nie automatycznie wariant przyczynowy

W rodzinie z cechą dziedziczną można szukać markerów wspólnie przekazywanych z fenotypem. Statystyka LOD porównuje prawdopodobieństwo danych przy określonym sprzężeniu z prawdopodobieństwem braku sprzężenia.

Dodatni sygnał wskazuje region kandydujący. Nie dowodzi, że:

• najbliższy gen jest przyczynowy;
• wszyscy nosiciele haplotypu będą mieli fenotyp;
• wariant leży w eksonie;
• w rodzinie działa tylko jeden locus;
• model penetracji i częstości allelu był poprawny.

Rekombinanci są szczególnie informacyjni: miejsce zmiany odziedziczonego haplotypu może zawęzić region. Jeden błędny fenotyp, nieujawnione pokrewieństwo albo fenokopia może jednak silnie zmienić wynik w małej rodzinie.

Sekwencjonowanie nie unieważniło analizy sprzężeń. W dużej rodzinie linkage może wskazać, które z licznych rzadkich wariantów rzeczywiście podążają za cechą.

Faza zmienia interpretację dziedziczenia

Choroba autosomalna recesywna

Dziecko może mieć dwa różne warianty w jednym genie. Warunek „compound heterozygote” wymaga, by znajdowały się na przeciwnych kopiach. Jeśli oba odziedziczono od jednego rodzica i są w cis, zwykle nie tworzą biallelicznego genotypu.

Badanie rodziców odpowiada jednocześnie na kilka pytań:

• fazę;
• pochodzenie de novo;
• zgodność dziedziczenia;
• możliwą mozaikę;
• poprawność identyfikacji próbek.

Cecha dominująca i haplotyp ryzyka

Patogenny wariant dominujący może być śledzony razem z bliskimi markerami, lecz crossover między markerem i wariantem rozdzieli je. Marker nie jest więc nieomylnym zastępcą wariantu.

W cechach wieloczynnikowych „haplotyp ryzyka” oznacza statystyczną kombinację związaną z prawdopodobieństwem, nie deterministyczny pakiet choroby. Sygnał może wynikać z jednego wariantu przyczynowego pozostającego w LD z badanymi markerami.

Chromosom X

U osoby z jednym chromosomem X większość loci X występuje w jednej kopii. U osoby z dwoma X faza wariantów nadal ma znaczenie, a fenotyp zależy dodatkowo od inaktywacji X i jej rozkładu między tkankami.

Chromosomy X i Y łączą się oraz rekombinują w regionach pseudoautosomalnych. Poza nimi ich dziedziczenie i mapa sprzężeń różnią się od autosomów. Nie można zastosować jednego prostego modelu do całego X.

Rekombinacja a pokrewieństwo

Dziecko otrzymuje w przybliżeniu połowę autosomalnego DNA od każdego rodzica, ale konkretne fragmenty są losową mozaiką haplotypów dziadków. Rodzeństwo nie dzieli stałych 50% wszystkich markerów identycznych przez pochodzenie; wartość jest średnią z rozkładu.

Dla danego locus rodzeństwo może dzielić:

• zero haplotypów identycznych przez pochodzenie;
• jeden;
• dwa.

Po całym genomie segmenty tych trzech klas układają się w mozaikę. Długość oraz liczba wspólnych segmentów niosą informację o stopniu pokrewieństwa, lecz rozkłady są szerokie i nakładają się dla części relacji.

Identyczne przez stan i przez pochodzenie

Dwie osoby mogą mieć ten sam allel:

• IBS — identyczny przez stan, bez dowodu wspólnego przodka dla danego odcinka;
• IBD — identyczny przez pochodzenie, odziedziczony od wspólnego przodka.

Częsty allel A sam w sobie nie dowodzi IBD. Długi wspólny haplotyp jest bardziej informacyjny, bo rekombinacja skraca segmenty w kolejnych pokoleniach. Nadal potrzebny jest model częstości i jakości danych.

Segmenty stają się krótsze z pokoleniami

W każdej mejozie crossovers dzielą odziedziczone chromosomy. Niedawni krewni dzielą zwykle mniej, ale dłuższych segmentów; odlegli — potencjalnie większą liczbę krótkich segmentów, z których część może być trudna do odróżnienia od zgodności populacyjnej.

To podstawa genealogii genetycznej, ale również źródło niepewności:

• liczba crossoverów jest losowa;
• mapy różnią się płcią;
• populacje mają wspólne stare haplotypy;
• endogamia zwiększa wiele ścieżek wspólnego pochodzenia;
• algorytm może sztucznie łączyć lub dzielić segmenty.

Zastosowania w genetyce sądowej

Klasyczne autosomalne STR często traktuje się jako markery o słabym sprzężeniu, aby mnożenie prawdopodobieństw było rozsądnym przybliżeniem. Jeżeli loci są sprzężone lub osoby są spokrewnione, prosty model niezależności wymaga korekty.

Markery chromosomu Y są przekazywane jako rozległy haplotyp w linii ojcowskiej, z wyjątkiem regionów rekombinujących z X. Profil Y-STR może więc łączyć wielu męskich krewnych i ma mniejszą zdolność rozróżniania ich niż niezależne autosomalne loci.

mtDNA jest przekazywane głównie w linii matczynej i nie podlega temu samemu programowi mejotycznego crossing-over jak autosomy. Zgodność mtDNA może łączyć krewnych matrylinearnych, ale nie identyfikuje jednej osoby.

W genealogii śledczej szerokie panele SNP wykrywają odcinki IBD. Wniosek o pokrewieństwie zależy od:

• łącznej długości segmentów;
• ich liczby i rozkładu;
• fazy;
• jakości genotypów;
• bazy odniesienia;
• endogamii;
• alternatywnych rodowodów.

Nie można przeliczyć pojedynczej sumy cM na jedną pewną relację bez uwzględnienia całego kontekstu.

Co się dzieje, gdy segregacja zawodzi

Nondysjunkcja oznacza brak prawidłowego rozdziału homologów w mejozie I albo chromatyd siostrzanych w mejozie II. Gamety mogą wtedy zawierać dodatkowy lub brakujący chromosom.

Po zapłodnieniu powstaje:

• trisomia, gdy gameta wnosi dodatkową kopię;
• monosomia, gdy jednej kopii brakuje;
• inne układy, jeśli po błędzie dochodzi do kolejnych zdarzeń.

Nie każda aneuploidia prowadzi do urodzenia. Większość zaburza rozwój na tyle, że zarodek przestaje się rozwijać. Dane z żywych urodzeń są więc silnie przefiltrowanym podzbiorem błędów poczęcia.

Błąd mejozy I i II daje różne wzory markerów

Jeżeli do gamety trafiły oba różne homologi rodzica, w markerach wokół centromeru można obserwować heterodisomię. Jeśli trafiły dwie kopie tej samej chromatydy, możliwa jest izodisomia. Crossovers komplikują prosty wzór wzdłuż ramienia.

Analiza heterozygotyczności i fazy może więc pomóc ustalić etap błędu, lecz wymaga markerów rodziców oraz mapy rekombinacji.

Uniparentalna disomia

Zarodek początkowo trisomiczny może utracić jeden chromosom. Jeśli pozostaną dwie kopie od tego samego rodzica, powstaje uniparentalna disomia (UPD). Całkowita liczba chromosomów wraca do dwóch, ale ich pochodzenie jest nietypowe.

UPD może mieć znaczenie przez:

• imprinting rodzicielski;
• ujawnienie recesywnego allelu w regionie izodisomii;
• mozaikę;
• związek z pierwotnym błędem chromosomowym.

Prawidłowy wynik samego pomiaru liczby kopii nie wykryje każdej UPD. Potrzebne są markery alleliczne i porównanie rodzinne.

Wiek matki i długie zatrzymanie oocytu

Ludzkie oocyty rozpoczynają mejozę w życiu płodowym i mogą pozostawać zatrzymane w profazie I przez dziesięciolecia. Z wiekiem rośnie ryzyko niektórych aneuploidii. Proponowane mechanizmy obejmują osłabienie kohezji, zmiany wrzeciona, konfigurację crossoverów i selekcję oocytów.

Nie należy sprowadzać zjawiska do jednego „zużytego białka” ani zakładać, że każdy chromosom ma taki sam profil ryzyka. Wzór crossoverów wpływa na stabilność biwalentu, a skutki zależą od położenia chiazm.

Zmiana strukturalna może zaburzyć mejozę

Nosiciel zrównoważonej translokacji może być zdrowy, lecz podczas parowania homologów tworzy strukturę obejmującą kilka segmentów. Różne sposoby segregacji prowadzą do gamet z prawidłowym, zrównoważonym lub niezrównoważonym zestawem.

Inwersja może utworzyć pętlę. Crossover wewnątrz niej bywa źródłem chromatyd z delecjami i duplikacjami. Znaczenie zależy od typu inwersji, jej rozmiaru oraz położenia crossoveru.

To przykład, w którym „zrównoważony genom nosiciela” i „ryzyko niezrównoważonego potomstwa” są dwoma różnymi poziomami oceny.

Mejoza u człowieka nie jest identyczna w obu płciach

Poza mapą crossoverów różni się cały harmonogram.

W oogenezie:

• replikacja i początek profazy I zachodzą przed urodzeniem;
• zatrzymanie może trwać wiele lat;
• pierwszy podział kończy się w związku z owulacją;
• drugi zatrzymuje się i kończy po aktywacji związanej z zapłodnieniem;
• cytoplazma dzieli się asymetrycznie.

W spermatogenezie:

• komórki macierzyste odnawiają pulę po dojrzewaniu płciowym;
• kolejne kohorty przechodzą mejozę;
• podziały dają cztery produkty;
• spermatydy różnicują się w plemniki.

„Wiek rodzica” może więc działać przez inne mechanizmy. Wiek ojca częściej łączy się z liczbą podziałów prekursorów i wzrostem części wariantów punktowych de novo, a wiek matki silniej z ryzykiem aneuploidii oocytu. Jest to różnica statystyczna, nie reguła opisująca każdą ciążę.

Jak obserwuje się rekombinację

Cytologia

Barwienie kompleksu synaptonemalnego i białek rekombinacyjnych pokazuje osie, miejsca inicjacji oraz dojrzewające crossovers. Metoda zachowuje przestrzenny kontekst pojedynczej komórki, ale marker białkowy nie zawsze jest jednoznaczny z końcowym produktem DNA.

Analiza potomstwa

Porównanie fazowanych genotypów rodziców i dziecka wskazuje, gdzie przekazany haplotyp przechodzi z jednego homologu na drugi. Rozdzielczość zależy od gęstości markerów. Crossover może znajdować się w całym przedziale między ostatnim markerem jednego i pierwszym drugiego pochodzenia.

Pojedyncze gamety

Sekwencjonowanie plemników daje bezpośredni rozkład produktów wielu mejoz jednej osoby. Dla oocytów materiał jest znacznie trudniej dostępny; ciałka kierunkowe i zarodki z procedur wspomaganego rozrodu dają szczególny, wyselekcjonowany obraz.

Dane populacyjne

Historyczne crossovers zostawiają wzory LD i długości haplotypów. Algorytmy mogą wnioskować lokalne tempo rekombinacji, lecz wynik zależy od modelu demograficznego. Sygnał integruje wiele pokoleń i nie jest mapą jednej osoby.

Długie odczyty i trio

Długie odczyty fazują warianty w obrębie cząsteczki, a dane rodziców przypisują bloki do homologów. Połączenie umożliwia niemal chromosomowe haplotypy. Pozostają problemy regionów powtarzalnych, centromerów, błędów i przełączania fazy.

Mejoza w projektowaniu eksperymentów i hodowli

Krzyżówka nie przekazuje pojedynczego genu

W hodowli zwierząt lub roślin wybór markera blisko allelu docelowego ogranicza ryzyko rozdzielenia ich przez rekombinację, ale go nie usuwa. Wielokrotne krzyżowanie wsteczne przenosi coraz mniejszy fragment genomu dawcy wokół celu. Pozostały odcinek to linkage drag.

Jeżeli fenotyp przypisano edytowanemu allelowi, trzeba rozważyć, czy w linii nie pozostał inny wariant sprzężony. Izogeniczne kontrole, niezależne linie i naprawa wariantu ograniczają to ryzyko.

Edycja jednego homologu wymaga fazowania

Projekt CRISPR może wykorzystywać SNP obecny tylko na jednym allelu do selektywnego cięcia. Wtedy trzeba znać fazę SNP z wariantem docelowym. Błąd fazowania może skierować nukleazę na zdrową kopię.

Po edycji należy ustalić:

• który homolog został zmieniony;
• czy zamierzona zmiana i niepożądany indel są w cis;
• czy doszło do utraty heterozygotyczności;
• czy naprawa wykorzystała drugi homolog;
• czy w kulturze wyselekcjonowano inny haplotyp.

Klonowanie somatyczne omija mejozę, ale nie historię haplotypów

SCNT przekazuje diploidalny genom jądrowy jednej komórki somatycznej bez nowej mejozy i zapłodnienia. Homologi dawcy zachowują haplotypy ukształtowane przez mejozy jego rodziców. Klon nie otrzymuje nowej kombinacji homologów, lecz:

• może różnić się mtDNA oocytu;
• może pochodzić z mozaikowej komórki dawcy;
• może nabyć nowe warianty;
• przechodzi przeprogramowanie epigenetyczne;
• jego przyszłe gamety będą przechodziły zwykłą mejozę.

„Ominięcie rekombinacji przy powstaniu klonu” nie oznacza, że rekombinacja przestaje być istotna dla jego genomu i potomstwa.

Prosty przykład rachunkowy

Rodzic ma haplotypy A—B / a—b. W 1000 informatywnych gametach obserwujemy:

• 440 A—B;
• 450 a—b;
• 55 A—b;
• 55 a—B.

Rekombinantów jest 110/1000 = 0,11, czyli 11%. Dla krótkiego odcinka odpowiada to w przybliżeniu 11 cM.

Zanim uznamy wynik, pytamy:

1. Czy faza rodzicielska AB/ab była potwierdzona?
2. Czy wszystkie gamety lub potomstwo miały równą szansę wejść do próby?
3. Czy allele oznaczano bez dropout?
4. Czy klasy rekombinowane są wzajemnie podobne liczebnie?
5. Czy marker nie wpływa na przeżycie?
6. Czy między markerami możliwe są wielokrotne crossovers?
7. Czy dane pochodzą z mejoz matczynych, ojcowskich czy mieszanych?

Asymetria A—b i a—B może sugerować selekcję, konwersję, błąd oznaczenia albo małą próbę. Samo policzenie procentu nie kończy analizy.

Jak czytać raport fazowania

Raport powinien podawać:

• wersję referencji;
• identyfikatory wariantów;
• metodę fazowania;
• długość bloków;
• prawdopodobieństwo albo jakość fazy;
• źródło przypisania rodzicielskiego;
• regiony nieciągłości;
• ploidalność i CNV;
• możliwe przełączenia fazy.

Zapis:

[v1; v2] / [v3]

może znaczyć, że v1 i v2 leżą na jednym haplotypie, a v3 na drugim. Nie mówi jednak, który haplotyp pochodzi od którego rodzica, chyba że wykonano dodatkowe przypisanie.

W locus o trzech kopiach ukośnik dwóch haplotypów może być niewystarczający. Należy określić liczbę kopii każdego allelu oraz ich strukturę. Faza sekwencyjna i faza liczby kopii spotykają się tu w jednym problemie.

Najczęstsze błędy rozumowania

1. „Po replikacji są cztery chromosomy homologiczne.” Są dwa homologi, każdy z dwiema chromatydami.
2. „Mejoza I rozdziela siostry.” Najpierw rozdzielają się homologi.
3. „Każde pęknięcie rekombinacyjne daje crossover.” Większość może zostać rozwiązana bez wymiany ramion.
4. „Crossover zachodzi między siostrami.” Typowy mejotyczny crossover łączy chromatydy niesiostrzane.
5. „Rekombinacja służy tylko różnorodności.” Chiazmy wspierają poprawną segregację.
6. „Crossovers są losowe i równomierne.” Działają hotspoty, interferencja i różnice płci.
7. „1 cM to milion par zasad.” To tylko przybliżenie genomowej średniej.
8. „50% rekombinacji dowodzi różnych chromosomów.” Odległe loci jednego chromosomu zachowują się podobnie.
9. „Dwa warianty w genie są na tej samej kopii.” Bez fazowania tego nie wiadomo.
10. „Haplotyp ma stałe granice.” Zakres zależy od pytania, populacji i historii rekombinacji.
11. „Wysokie LD dowodzi bliskości.” Demografia i dobór także tworzą LD.
12. „Brak LD oznacza brak sprzężenia.” Populacyjna asocjacja i rodzinne przekazywanie są różnymi analizami.
13. „Klon nie ma związku z mejozą.” Niesie haplotypy utworzone w mejozach przodków i sam może tworzyć gamety.
14. „Prawidłowe dwie kopie wykluczają błąd rodzicielski.” UPD może zachować liczbę kopii.

Schemat analizy problemu

1. Określ poziom

Czy pytasz o mechanizm komórkowy, fazę wariantów, segregację w rodzinie, mapę populacyjną czy pokrewieństwo? Te poziomy mają inne dane.

2. Narysuj fizyczne kopie

Zapisz osobno dwa homologi i przypisz warianty do chromatyd. Jeśli faza jest nieznana, narysuj alternatywne układy zamiast wybierać jeden.

3. Wskaż informatywnego rodzica

Rekombinację można wykryć tylko tam, gdzie rodzic jest heterozygotyczny, a fazę markerów da się ustalić. Homozygotyczny odcinek nie pokazuje, który homolog przekazano.

4. Dobierz mapę

Użyj odpowiedniej wersji genomu, lokalnej mapy genetycznej i płci osoby przechodzącej mejozę. Nie przeliczaj mechanicznie Mb na cM.

5. Uwzględnij strukturę

CNV, inwersja lub translokacja może zmienić fazę, mapowanie odczytów i sam przebieg parowania. Standardowy model dwóch liniowych homologów może być niewłaściwy.

6. Oddziel obserwację od wniosku

„Zmiana haplotypu między markerami” jest obserwacją. „Crossover w punkcie X” jest wnioskiem z przedziałem niepewności. „Błąd mejozy I” jest dalszym wnioskiem wymagającym wzoru markerów.

7. Podaj niepewność

Faza statystyczna ma prawdopodobieństwo, położenie crossoveru ma przedział, a relacja pokrewieństwa ma rozkład możliwych wartości. Jedna kategoria nie powinna ukrywać tego rozrzutu.

Co warto umieć po przeczytaniu

Czytelnik powinien potrafić:

• rozróżnić homolog, chromatydę siostrzaną, biwalent i chiazmę;
• przeprowadzić rachunek n i C przez oba podziały;
• wyjaśnić, dlaczego DSB może dać crossover albo non-crossover;
• połączyć crossover z segregacją homologów;
• odróżnić haplotyp od genotypu;
• rozpoznać układ cis i trans;
• obliczyć prostą częstość rekombinacji;
• wyjaśnić ograniczenie 50%;
• odróżnić mapę fizyczną od genetycznej;
• nie mylić rodzinnego linkage z populacyjnym LD;
• wskazać kilka metod fazowania;
• rozumieć, jak nondysjunkcja i UPD zmieniają dziedziczenie;
• zastosować fazę w diagnostyce, edycji genomu i genetyce sądowej.

To stanowi podstawę dla dalszych tekstów o prawach Mendla, rodowodach, asocjacjach genomowych, interpretacji wariantów, pokrewieństwie i identyfikacji sądowej.

Literatura i źródła