Penetracja, ekspresywność, plejotropia i epistaza

Streszczenie

Penetracja, ekspresywność, plejotropia i epistaza opisują cztery różne przyczyny, dla których prosty schemat „wariant daje cechę” jest niewystarczający.

• Penetracja pyta, jaka część osób z określonym genotypem spełnia kryterium fenotypu.
• Ekspresywność pyta, jaki jest rodzaj i stopień fenotypu wśród osób, u których się ujawnił.
• Plejotropia oznacza, że jeden gen lub wariant wpływa na więcej niż jedną cechę.
• Epistaza oznacza, że skutek jednego locus zależy od genotypu w innym locus.

Te pojęcia nie są alternatywnymi nazwami „zmienności objawów”. Osoba może nie spełniać progu choroby — problem penetracji — ale mieć subtelny fenotyp molekularny. Dwie osoby mogą spełniać ten sam próg, lecz różnić się narządami i nasileniem — problem ekspresywności. Jeden mechanizm molekularny może uruchamiać kilka następstw — plejotropia. Inny gen może zaś zmieniać wielkość albo kierunek skutku — epistaza.

Każda liczba penetracji wymaga pięciu elementów:

wariant lub klasa wariantów + fenotyp i próg + populacja + przedział wieku + sposób doboru i obserwacji.

Bez nich „penetracja wynosi 70%” nie daje się bezpiecznie zastosować do konkretnej osoby. Podobnie „gen jest plejotropowy” nie wyjaśnia, czy jeden produkt działa niezależnie w kilku tkankach, czy jeden skutek pierwotny wywołuje kaskadę wtórną.

Cztery pytania, cztery mianowniki

Pojęcie	Pytanie	Jednostka analizy	Typowy wynik
penetracja	czy nosiciel przekroczył zdefiniowany próg?	osoby z genotypem	odsetek lub funkcja wieku
ekspresywność	jaki fenotyp mają osoby z genotypem?	osoby, tkanki lub komórki	rozkład nasilenia i cech
plejotropia	ile odrębnych cech zależy od jednego locus?	cechy i mechanizmy	sieć skutków
epistaza	czy skutek locus A zależy od locus B?	kombinacje genotypów	interakcja biologiczna lub statystyczna

MedlinePlus ujmuje penetrację jako odsetek osób z wariantem, u których występują oznaki lub objawy, a ekspresywność jako zakres cech u osób z tym samym stanem genetycznym.¹ To dobry punkt startu, lecz do pracy badawczej potrzebna jest operacyjna definicja pomiaru.

Podręczniki Lewisa, Robinson i Bala wprowadzają te zjawiska odpowiednio przez genetykę człowieka, odstępstwa od prostych krzyżówek oraz diagnostyczną interpretację wariantów.^9,10,11 Wspólny rdzeń można streścić tak: genotyp ogranicza zbiór możliwości, ale nie jest pełnym opisem historii rozwoju.

Penetracja jest prawdopodobieństwem fenotypu przy genotypie

W najprostszej postaci:

penetracja = liczba osób z genotypem i fenotypem / liczba osób z genotypem możliwych do oceny.

Sformułowanie „możliwych do oceny” jest kluczowe. Noworodek nie jest osobą bez późno ujawniającej się choroby. Osoba po zabiegu profilaktycznym nie dostarcza naturalnej obserwacji ryzyka po zabiegu. Krewny bez dokumentacji nie powinien być automatycznie liczony jako zdrowy.

Pełna i niepełna penetracja

Przy penetracji pełnej każda osoba z genotypem ujawnia zdefiniowany fenotyp w odpowiednim okresie obserwacji. Przy penetracji niepełnej część nosicieli nie przekracza progu.

NCI określa niepełną penetrację jako sytuację, w której część osób z patogennym wariantem ujawnia cechę, a część nie.² Nie oznacza to, że wariant „czasem istnieje”. Genotyp jest obecny; zmienia się obserwowany skutek.

Penetracja nie jest własnością samej nazwy genu

Różne warianty tego samego genu mogą mieć:

• inny mechanizm;
• inną pozostałą aktywność produktu;
• inny wpływ na splicing;
• inny rozkład tkankowy;
• inną penetrację.

Nawet dla jednego wariantu oszacowanie może zależeć od:

• płci;
• wieku;
• pochodzenia populacyjnego;
• wariantów modyfikujących;
• środowiska;
• nadzoru medycznego;
• kryterium fenotypu.

Zdanie „gen X ma penetrację 80%” jest więc zwykle nadmiernym skrótem. Lepsze brzmi: „u osób z wariantami utraty funkcji określonej klasy, w tej badanej populacji, skumulowane ryzyko fenotypu zdefiniowanego w ten sposób do wieku 70 lat oszacowano na…”.

Próg tworzy fenotyp binarny z cechy ciągłej

Wiele fenotypów ma rozkład ciągły:

• stężenie metabolitu;
• długość odstępu w EKG;
• gęstość mineralna kości;
• aktywność enzymu;
• liczba zmian skórnych;
• tempo wzrostu komórek.

Ustalenie progu dzieli wartości na „fenotyp obecny” i „nieobecny”. Przesunięcie progu zmienia penetrację bez zmiany biologii.

Załóżmy, że wariant podnosi średnią wartość pomiaru, ale rozkłady nosicieli i osób bez wariantu się nakładają. Przy wysokim progu penetracja będzie niska. Przy niższym — wyższa, kosztem większej liczby osób bez wariantu spełniających kryterium.

Dlatego raport powinien podawać:

• skalę i jednostkę;
• próg;
• metodę;
• powtarzalność;
• warunki pomiaru;
• sposób postępowania z wynikiem granicznym.

Subtelny fenotyp nie znosi niepełnej penetracji klinicznej

Możliwe, że każdy nosiciel ma wykrywalną zmianę ekspresji RNA, ale tylko część rozwija chorobę. Wtedy penetracja fenotypu molekularnego może być bliska pełnej, a penetracja rozpoznania klinicznego — niepełna.

Nie jest to sprzeczność. Są to dwa różne fenotypy i dwa progi.

Penetracja zależna od wieku jest funkcją, nie jedną liczbą

Dla fenotypu o późnym początku penetrację warto zapisać jako:

P(fenotyp do wieku t | genotyp, pozostałe warunki).

Dwudziestoletni nosiciel bez objawów nie jest dowodem tej samej siły co osiemdziesięcioletni nosiciel. Rodowód powinien zawierać wiek, a analiza — uwzględniać cenzorowanie, czyli zakończenie obserwacji przed wystąpieniem zdarzenia.

Krzywa skumulowanego ryzyka

Krzywa pokazuje, jaka część nosicieli doświadczyła zdarzenia do danego wieku. Nie mówi, że osoba znajdująca się w punkcie 40% ma „40% choroby”. Mówi o prawdopodobieństwie przekroczenia zdefiniowanego kryterium w badanej grupie.

W analizie czasu do zdarzenia:

• osoby bez zdarzenia nadal wnoszą informację do czasu ostatniej obserwacji;
• zgon z innej przyczyny może być ryzykiem konkurencyjnym;
• zabieg profilaktyczny zmienia dalszą historię;
• intensywny nadzór może przyspieszać wykrycie.

Ryzyko całego życia jest zależne od kalendarza

Zmiany diagnostyki, leczenia, ekspozycji i długości życia mogą sprawić, że kohorta urodzona w 1950 roku ma inne oszacowanie niż kohorta urodzona w 2000 roku. „Lifetime risk” nie jest stałą biologiczną odłączoną od społeczeństwa i medycyny.

Jak dobór próby zniekształca penetrację

Rodziny trafiają do kliniki dlatego, że mają wiele przypadków, wczesny początek albo ciężki fenotyp. Jeśli policzymy penetrację tylko w takich rodzinach, wynik będzie zwykle zawyżony.

To ascertainment bias. Źródła obejmują:

• wybór probanda z chorobą;
• publikowanie wielopokoleniowych rodzin;
• testowanie krewnych dopiero po rozpoznaniu;
• nieuwzględnienie nosicieli bezobjawowych;
• kierowanie cięższych przypadków do ośrodków specjalistycznych.

Z drugiej strony populacyjna baza ochotników może niedoreprezentować ciężko chore osoby i zaniżać ryzyko.

Rodziny i populacja odpowiadają na inne pytania

Rodowód jest świetny do wykrywania segregacji i wariantów rzadkich. Kohorta populacyjna lepiej pokazuje zakres fenotypu poza wyselekcjonowanymi rodzinami. Biobank z połączonymi danymi genotypowymi i medycznymi pozwala znajdować osoby, których nigdy nie skierowano do genetyka.

Najlepsze oszacowanie łączy źródła, ale nie miesza ich bez korekty.

Zdrowa osoba w bazie nie zawsze obala patogenność

Przy ocenie wariantu trzeba sprawdzić:

• wiek;
• płeć i narząd, którego dotyczy ryzyko;
• jakość fenotypowania;
• penetrację;
• mozaikę;
• poprawność genotypu;
• interwencje profilaktyczne.

ClinGen rozwija odrębną terminologię dla wariantów o zmniejszonej penetracji i alleli ryzyka, ponieważ klasyczny podział na „patogenny” i „łagodny” nie zawsze dobrze opisuje ciągłość ryzyka.³

Ekspresywność jest rozkładem fenotypów

Ekspresywność może dotyczyć:

• nasilenia jednej cechy;
• liczby zajętych narządów;
• wieku początku;
• przebiegu w czasie;
• odpowiedzi na leczenie;
• kombinacji objawów.

„Zmienna ekspresywność” nie powinna zastępować opisu. Trzeba wskazać, co się zmienia i jak to zmierzono.

Skala porządkowa i pomiar ciągły

Fenotyp można zapisać jako:

• brak / łagodny / umiarkowany / ciężki;
• wynik punktowy;
• wartość laboratoryjną;
• czas do zdarzenia;
• liczbę cech;
• profil wielowymiarowy.

Skala porządkowa jest łatwa klinicznie, ale osoby w tej samej klasie nadal mogą się różnić. Pomiar ciągły daje więcej informacji, lecz wymaga kalibracji i uwzględnienia błędu.

Ekspresywność wewnątrz- i międzyrodzinna

Członkowie jednej rodziny dzielą wariant, część tła genomowego i środowisko. Mimo to mogą mieć różny fenotyp. Zmienność wewnątrzrodzinna wskazuje, że sam główny wariant nie wystarcza do przewidywania.

Różnice między rodzinami mogą wynikać z:

• innego wariantu w tym samym genie;
• wspólnego modyfikatora;
• pochodzenia populacyjnego;
• środowiska;
• sposobu wykrywania;
• przypadku.

Porównanie rodzin bez ujednoliconych kryteriów łatwo myli biologię z praktyką diagnostyczną.

Penetracja i ekspresywność można opisać jednym rozkładem

Wyobraźmy sobie ukrytą wielkość „obciążenia fenotypowego”. W populacji nosicieli ma ona pewien rozkład.

• penetracja jest polem rozkładu powyżej progu;
• ekspresywność jest rozkładem wartości, zwłaszcza wśród osób powyżej progu;
• modyfikator przesuwający średnią może zmienić oba parametry;
• zmiana wariancji może zwiększyć liczbę skrajnych wyników bez dużej zmiany średniej.

Ten model progu nie pasuje do każdej choroby, ale dobrze pokazuje, dlaczego pojęcia są powiązane i zarazem różne.

Skąd bierze się zmienność przy tym samym wariancie

Warianty modyfikujące

Inne loci mogą zmieniać:

• ilość produktu;
• aktywność szlaku równoległego;
• transport;
• próg odpowiedzi;
• naprawę uszkodzeń;
• reakcję immunologiczną.

Modyfikator może być rzadki o dużym efekcie albo stanowić sumę wielu częstych alleli o małych efektach. To drugie łączy chorobę mendlowską z tłem poligenowym.

Środowisko

Środowisko obejmuje nie tylko toksynę lub dietę. To także:

• temperatura;
• infekcje;
• aktywność;
• leki;
• mikrobiom;
• warunki prenatalne;
• dostęp do diagnostyki;
• zachowania zmieniające ekspozycję.

Klasycznym przykładem jest fenyloketonuria: warianty zaburzają metabolizm fenyloalaniny, ale odpowiednia dieta zasadniczo zmienia fenotyp neurologiczny. Genotyp pozostaje ten sam; zmienia się dopływ substratu.

Płeć i hormony

Fenotyp może być:

• ograniczony do jednej płci;
• częstszy w jednej płci;
• różny w nasileniu;
• zależny od ciąży, dojrzewania albo menopauzy.

Cecha ograniczona płcią nie musi być sprzężona z chromosomem płci. Autosomalny wariant może ujawniać się tylko w określonym narządzie lub kontekście hormonalnym.

Epigenetyka i losowość komórkowa

Inaktywacja X, imprinting, dostępność chromatyny i stabilne stany ekspresji mogą różnić komórki o tej samej sekwencji. W rozwoju małe różnice czasu sygnału lub liczby komórek założycielskich mogą zostać wzmocnione.

„Losowość” nie oznacza braku mechanizmu. Oznacza, że wynik pojedynczej realizacji nie jest w pełni przewidywalny z obserwowanych warunków początkowych.

Mozaika

Udział i rozmieszczenie komórek z wariantem może decydować o fenotypie. Ta sama średnia VAF w krwi nie mówi, jaki udział ma serce, mózg albo gonady.

Mozaika nie jest zwykłą ekspresywnością konstytucyjnego genotypu. Jest dodatkową różnicą genotypową między komórkami, którą trzeba mierzyć.

Pleiotropia: jeden locus, kilka cech

Plejotropia występuje, gdy zmiana jednego locus wpływa na wiele fenotypów. Mackay i Anholt definiują ją jako wpływ jednego polimorfizmu na wiele cech, odróżniając od epistazy jako nieliniowej interakcji wariantów.⁴

Pleiotropia pozioma

Jeden produkt może działać niezależnie w kilku tkankach lub procesach. Wariant białka macierzy zewnątrzkomórkowej może wpływać na układ kostny, oko i ścianę naczynia, ponieważ produkt jest potrzebny w każdym z nich.

Pleiotropia pionowa

Jeden skutek pierwotny uruchamia kaskadę. Utrata aktywności enzymu zmienia metabolit, ten uszkadza komórki, a uszkodzenie daje wtórne cechy w wielu narządach.

W badaniach asocjacyjnych rozróżnienie jest ważne:

• pozioma plejotropia może naruszać założenia instrumentalne;
• pionowa może być częścią tego samego łańcucha przyczynowego.

Pozorna plejotropia

Jeden marker może być skojarzony z dwiema cechami, bo:

• pozostaje w LD z dwoma wariantami;
• region zawiera dwa geny;
• próbki częściowo się pokrywają;
• jedna cecha wpływa na rozpoznanie drugiej;
• wystąpił bias selekcji;
• fenotypy są różnymi miarami tego samego procesu.

Samo wspólne p-value nie dowodzi jednego plejotropowego mechanizmu.

Jak udowadniać plejotropię

Przydają się:

1. dokładne mapowanie wariantu;
2. fazowanie i analiza LD;
3. kolokalizacja sygnałów;
4. ekspresja w odpowiednich tkankach;
5. doświadczenie funkcjonalne;
6. mediacja między fenotypami;
7. replikacja w niezależnych próbach.

W modelu komórkowym warto sprawdzić kilka wyjść. Jeśli knockout zmienia proliferację i różnicowanie, wolniejszy wzrost może wtórnie zmieniać skład populacji. Nie musi to być dwoje niezależnych działań genu.

Pleiotropia kliniczna a nazwa zespołu

Zespół jest rozpoznawalną kombinacją cech, ale nie każda osoba ma wszystkie. Pleiotropia tworzy katalog możliwych skutków, penetracja określa częstość poszczególnych cech, a ekspresywność — ich zakres.

Raport powinien unikać zdania „wariant powoduje zespół w pełnej postaci”. Lepsza jest lista ryzyk zależnych od wieku i narządu.

Epistaza: skutek zależy od drugiego locus

NHGRI definiuje epistazę jako sytuację, w której ekspresja jednego genu jest modyfikowana, maskowana lub hamowana przez inne geny.⁵ W genetyce ilościowej definicja jest szersza: łączny efekt genotypów odbiega od przyjętego modelu addytywnego.

Epistaza biologiczna

Dwa produkty mogą:

• działać kolejno w szlaku;
• tworzyć kompleks;
• konkurować o substrat;
• regulować swoją ekspresję;
• działać w szlakach zapasowych;
• ustalać dostępność receptora i ligandu.

Jeśli pierwszy gen jest potrzebny do wytworzenia pigmentu, wariant drugiego określający kolor nie będzie widoczny przy braku pigmentu. Pierwszy locus maskuje drugi na poziomie fenotypu.

Epistaza statystyczna

W modelu:

fenotyp = efekt A + efekt B + interakcja A×B + błąd

składnik interakcji mierzy odchylenie od wybranej skali addytywnej. Wynik zależy od:

• skali fenotypu;
• kodowania genotypów;
• częstości alleli;
• struktury populacji;
• mocy próby;
• współzmiennych.

Brak statystycznej interakcji nie dowodzi braku kontaktu białek. Biologiczna epistaza może wyglądać addytywnie na użytej skali. Statystyczna interakcja może zaś powstać bez bezpośredniej interakcji molekularnej.
Współczesne przeglądy architektury cech podkreślają właśnie tę różnicę oraz fakt, że epistazę łatwiej wykrywa się w kontrolowanych populacjach organizmów modelowych niż w badaniach częstych cech człowieka.⁸

Skala zmienia wniosek

Dwa czynniki mogą być addytywne dla ryzyka bezwzględnego, ale nie dla logarytmu ilorazu szans. Badanie powinno wskazać, na jakiej skali definiuje interakcję.

Zdanie „geny oddziałują” bez modelu może oznaczać:

• fizyczne wiązanie białek;
• wspólny szlak;
• zależność fenotypową;
• składnik statystyczny;
• współekspresję.

Te dowody nie są zamienne.

Klasyczne proporcje epistatyczne są narzędziem dydaktycznym

W krzyżówkach dwóch loci odchylenia od 9:3:3:1 mogą dawać proporcje takie jak 9:3:4, 12:3:1 lub 9:7. Pomagają rozpoznać logiczne zależności w szlaku.

W realnej biologii człowieka proporcje są rzadko widoczne, ponieważ:

• rodziny są małe;
• penetracja jest niepełna;
• allele mają wiele poziomów aktywności;
• działają kolejne loci;
• fenotyp jest ciągły;
• występuje selekcja.

Nie należy dopasowywać ludzkiego rodowodu do proporcji z roślin bez modelu molekularnego.

Modyfikator nie zawsze jest epistazą

Jeśli wariant B zmienia fenotyp osób z wariantem A, można nazwać go modyfikatorem. Czy jest epistatyczny, zależy od pytania i modelu.

• Jeśli efekt B istnieje tylko przy A, interakcja jest oczywista.
• Jeśli B przesuwa fenotyp tak samo u wszystkich, może działać addytywnie.
• Jeśli B zmienia ekspozycję środowiskową, mechanizm może być pośredni.
• Jeśli sygnał wynika z LD, nie ma dwóch niezależnych loci.

Najpierw opisuje się dane, potem termin.

Tło poligenowe może modyfikować wariant mendlowski

Osoby z tym samym rzadkim wariantem różnią się tysiącami częstych alleli. Suma małych efektów może przesuwać ich bazowe ryzyko lub ilościowy fenotyp.

W uproszczonym modelu:

obciążenie = efekt wariantu głównego + wynik poligenowy + środowisko + interakcje.

Wysoki wynik poligenowy może zwiększać penetrację wariantu głównego, a niski ją zmniejszać. Nie oznacza to, że rzadki wariant staje się „nieważny”. Oznacza, że działa w genomie, nie w pustym tle.

Praktyczne ograniczenia:

• wynik zależy od populacji referencyjnej;
• modele słabiej przenoszą się między pochodzeniami;
• efekt dla nosicieli rzadkiego wariantu może być słabo skalibrowany;
• wspólne dane treningowe tworzą pozorną replikację;
• zastosowanie kliniczne wymaga osobnej walidacji.

Interakcja gen–środowisko

Skutek genotypu może zależeć od ekspozycji. Formalnie:

efekt genotypu przy E1 ≠ efekt genotypu przy E0.

Przykłady mechanizmów:

• enzym metabolizuje związek obecny w diecie;
• wariant naprawy DNA zmienia skutek promieniowania;
• receptor zmienia odpowiedź na lek;
• allel odpornościowy zmienia przebieg infekcji.

Korelacja gen–środowisko

Genotyp może wpływać na prawdopodobieństwo ekspozycji. Osoba wybiera aktywność, zawód albo dietę częściowo powiązaną z cechami dziedzicznymi. Wtedy gen i środowisko są skorelowane.

Bez odpowiedniego projektu korelację łatwo pomylić z interakcją.

Ekspozycja musi być mierzona

„Styl życia” jest zbyt szeroki. Potrzebne są:

• dawka;
• czas;
• okno rozwojowe;
• sposób pomiaru;
• zmienność w czasie;
• czynniki zakłócające.

Pojedynczy kwestionariusz może nie reprezentować wieloletniej ekspozycji.

Penetracja a klasyfikacja wariantu

Patogenny opisuje siłę dowodów, że wariant może powodować chorobę w określonym mechanizmie. Penetracja opisuje prawdopodobieństwo fenotypu u nosiciela.

Wariant może być:

• patogenny i wysoko penetrujący;
• patogenny ze zmniejszoną penetracją;
• allelem ryzyka o małym efekcie;
• VUS z nieznaną penetracją;
• łagodny.

Niepełna penetracja nie zmienia automatycznie wariantu w VUS. VUS nie staje się zaś „nisko penetrujący” tylko dlatego, że znaleziono go u zdrowej osoby.
Klasyczne zalecenia ACMG/AMP wymagają łączenia niezależnych linii dowodów i interpretowania ich w kontekście mechanizmu choroby; sama obserwacja zdrowego nosiciela nie ma stałej wagi dla wszystkich genów.⁷

Zdrowe obserwacje w ACMG/AMP

Obecność wariantu u zdrowych dorosłych może wspierać łagodność, jeżeli choroba:

• ma wczesny początek;
• wysoką penetrację;
• łatwo rozpoznawalny fenotyp;
• porównywalny mechanizm.

ClinGen tworzy specyfikacje genowo-chorobowe, ponieważ ta sama obserwacja ma inną wagę w cukrzycy monogenowej, kardiomiopatii i chorobie rozwojowej.⁶

Klasyfikacja dla wariantu, ryzyko dla osoby

Raport powinien rozdzielić:

1. klasyfikację wariantu;
2. zgodność z fenotypem osoby;
3. oszacowanie ryzyka zależne od wieku;
4. zalecenia wynikające z wytycznych.

Jedna etykieta nie zastępuje czterech kroków.

Jak szacować penetrację

Badania rodzinne

Zalety:

• bogaty fenotyp;
• potwierdzona segregacja;
• możliwość fazowania;
• podobne warianty i tło.

Wady:

• bias doboru;
• zależność obserwacji;
• mała liczba rodzin;
• wspólne środowisko;
• nadreprezentacja ciężkich przypadków.

Kohorty populacyjne

Zalety:

• obserwacja poza kliniką;
• grupa porównawcza;
• szeroki zakres fenotypów;
• możliwość analizy wieku.

Wady:

• efekt zdrowego ochotnika;
• niepełne dane medyczne;
• słabe wykrywanie subtelnych fenotypów;
• mała liczba nosicieli rzadkiego wariantu.

Case-control

Iloraz szans nie jest penetracją. Pokazuje relatywną nadreprezentację wariantu w przypadkach, ale do ryzyka bezwzględnego potrzeba częstości choroby, sposobu doboru i kalibracji.

Metaanaliza

Łączenie badań zwiększa liczebność, ale tylko jeśli definicje są zgodne. Niejednorodność może wynikać z wieku, populacji, wariantów, nadzoru i progów.

Błędy oszacowania

Każda wartość powinna mieć przedział ufności. Dla dziesięciu nosicieli, z których siedmiu ma fenotyp, punktowe 70% jest bardzo niepewne. Dla tysiąca — znacznie precyzyjniejsze, choć bias może pozostać.

Trzeba odróżnić:

• niepewność losową — ograniczoną liczebność;
• bias — systematyczne przesunięcie;
• heterogeniczność — różne prawdziwe ryzyka;
• błąd klasyfikacji — błędny fenotyp lub genotyp.

Wąski przedział wokół obciążonego oszacowania nie daje prawdy.

Przykłady, które rozdzielają pojęcia

Predyspozycja nowotworowa

Wariant zaburzający gen supresorowy może zwiększać ryzyko kilku nowotworów.

• penetracja: ilu nosicieli rozwinie określony nowotwór do wieku t;
• ekspresywność: wiek początku, liczba guzów i narządy;
• plejotropia: ryzyko różnych typów nowotworu;
• epistaza/modyfikacja: wpływ innych loci na ryzyko;
• środowisko: ekspozycje i interwencje.

„Dziedziczny nowotwór” nie znaczy, że guz jest obecny od urodzenia. Dziedziczona jest predyspozycja.

Choroba tkanki łącznej

Jeden produkt występuje w wielu strukturach. Wariant może dawać cechy szkieletowe, oczne i naczyniowe — plejotropia. Jedna osoba ma tylko łagodny fenotyp kostny, inna groźny fenotyp aorty — ekspresywność. Część cech może mieć inną penetrację i wiek początku.

Fenyloketonuria

Główny gen wpływa na metabolizm jednego związku, ale nagromadzenie metabolitu oddziałuje na wiele funkcji — plejotropia pionowa. Dieta silnie zmienia ekspresję fenotypu — interakcja gen–środowisko.

Fenotyp grupy krwi

Allele ABO określają enzym modyfikujący prekursor, ale wytworzenie substratu zależy od innego locus. Brak funkcjonalnego substratu może maskować oczekiwany fenotyp ABO. Jest to przykład epistazy szlakowej i ostrzeżenie, że fenotyp serologiczny nie zawsze bezpośrednio ujawnia genotyp jednego locus.

Te pojęcia w eksperymencie komórkowym

W linii komórkowej odpowiednik penetracji można zdefiniować jako odsetek klonów albo komórek przekraczających próg. Trzeba jednak powiedzieć, co jest jednostką:

• niezależny klon;
• komórka;
• organoid;
• studzienka;
• eksperyment.

Traktowanie tysięcy komórek jednego klonu jako tysięcy niezależnych realizacji jest pseudoreplikacją.

Ekspresywność między klonami

Po tej samej edycji klony mogą różnić się:

• produktem naprawy;
• fazą;
• liczbą kopii;
• off-targetami;
• stanem epigenetycznym;
• pasażem;
• udziałem subklonów.

Zanim uznamy zmienność za ekspresywność jednego genotypu, trzeba potwierdzić, że genotypy naprawdę są porównywalne.

Pleiotropia w omikach

Knockout zmienia setki transkryptów. Nie oznacza to setek niezależnych funkcji genu. Wiele zmian jest wtórnych wobec:

• zatrzymania cyklu;
• stresu;
• zmiany proporcji typów komórek;
• różnicy tempa wzrostu.

Analiza czasu, rescue i pomiar bezpośrednich celów pomagają oddzielić skutek pierwotny od kaskady.

Epistaza w przesiewach

Podwójny knockout może:

• pogłębiać fenotyp;
• znosić fenotyp pierwszego;
• nie zmieniać go;
• być syntetycznie letalny.

Do wniosku potrzebne są wszystkie pojedyncze perturbacje, podwójna perturbacja, kontrole i model oczekiwanej addytywności.

Znaczenie dla SCNT i przeprogramowania

Klon z tego samego dawcy nie jest powtórzeniem identycznego rozwoju. Zmienność może wynikać z:

• różnego stanu komórki dawcy;
• losu mtDNA;
• przeprogramowania epigenetycznego;
• warunków oocytu;
• łożyska;
• środowiska prenatalnego;
• nowych wariantów;
• losowości rozwoju.

Jeśli tylko część zarodków z tym samym głównym genotypem rozwija fenotyp, można mówić o penetracji w zdefiniowanym systemie. Jeśli fenotyp ma różne nasilenie — o ekspresywności. Nie należy jednak pomijać różnic molekularnych i nazywać wszystkiego „niepełną penetracją”.

W doświadczeniu SCNT mianownikiem może być:

• rekonstruowany oocyt;
• zarodek aktywowany;
• blastocysta;
• transfer;
• ciąża;
• urodzenie;
• zdrowe potomstwo.

Każdy daje inną „skuteczność” i inny warunek.

Allelic series: jeden gen nie oznacza jednego efektu

W locus może istnieć szereg alleli o różnej aktywności:

• allel o aktywności zbliżonej do referencyjnej;
• częściowa utrata funkcji;
• całkowita utrata funkcji;
• zwiększenie funkcji;
• nowa funkcja;
• działanie dominująco negatywne;
• wariant wpływający tylko na jedną izoformę.

Łączenie ich w jedną grupę może ukryć różnice penetracji. Z drugiej strony szacowanie osobno dla każdego ultrarzadkiego wariantu daje zbyt małe mianowniki. Rozsądnym kompromisem bywa grupowanie według zwalidowanego mechanizmu, domeny białka albo mierzalnej pozostałej aktywności.

Genotyp bialleliczny też ma gradację

W chorobie recesywnej nie wystarczy etykieta „dwa warianty patogenne”. Kombinacje:

• null/null;
• null/hipomorf;
• hipomorf/hipomorf;
• wariant splicingowy z resztkowym prawidłowym transkryptem;
• wariant tkankowo swoisty;

mogą mieć inny wiek początku i zakres fenotypu. Faza, ilość produktu i wybór transkryptu należą do modelu genotyp–fenotyp.

Dominujący ujemny i haploinsuficjencja nie są zamienne

Przy haploinsuficjencji problemem jest niedostateczna ilość prawidłowego produktu. Przy działaniu dominująco negatywnym produkt zmieniony zaburza produkt prawidłowy, na przykład w kompleksie wielopodjednostkowym.

Delecja całego genu i wariant missense mogą więc mieć różną ekspresywność, choć oba występują w jednej kopii. Wniosek o penetracji jednej klasy nie powinien być automatycznie przenoszony na drugą.

Fenotyp jest wielowymiarowy i zmienia się w czasie

Jedna ocena „łagodny/ciężki” spłaszcza trajektorię. Dwie osoby mogą mieć ten sam wynik punktowy, ale:

• jedna ma wcześnie stabilny fenotyp;
• druga szybko postępujący;
• jedna ma ciężką cechę narządową;
• druga wiele łagodnych cech;
• jedna odpowiedziała na leczenie;
• druga nie była leczona.

Lepszy opis może obejmować wektor:

fenotyp = [wiek początku, narząd 1, narząd 2, biomarker, tempo zmiany, odpowiedź].

Powtarzany pomiar

Badanie podłużne rozdziela:

• różnice między osobami;
• zmianę w czasie;
• błąd pomiaru;
• efekt leczenia;
• regresję do średniej.

Pojedynczy wynik skrajny może po powtórzeniu zbliżyć się do średniej bez biologicznej poprawy. To szczególnie ważne przy biomarkerach o dużej zmienności dobowej lub przedanalitycznej.

Ontologia fenotypu pomaga porównywać

Standaryzowane terminy fenotypowe pozwalają kodować konkretne cechy zamiast samej nazwy zespołu. Warto rejestrować:

• cechę obecną;
• cechę wyraźnie nieobecną;
• cechę nieocenioną;
• wiek początku;
• metodę potwierdzenia;
• ciężkość.

„Nieobecna” i „nieoceniona” muszą pozostać różnymi wartościami. W przeciwnym razie algorytm dopasowania fenotypu traktuje brak danych jako dowód przeciw diagnozie.

Płeć ograniczona i zależna od płci

Fenotyp ograniczony płcią ujawnia się tylko w jednym kontekście anatomicznym lub fizjologicznym, mimo że wariant może być autosomalny i przekazywany przez wszystkie płcie.

Fenotyp zależny od płci ma różną penetrację albo ekspresywność. Przyczyny mogą obejmować:

• hormony;
• ekspresję tkankową;
• dawkę chromosomu X;
• inaktywację X;
• zachowania i ekspozycje;
• różnice diagnostyczne.

Rodowód z chorymi osobami jednej płci nie dowodzi więc sprzężenia z X albo Y. Potrzebna jest analiza transmisji, położenia genu i mechanizmu.

Transmisja przez osobę bez fenotypu

Osoba, u której fenotyp nie może się ujawnić z powodu braku odpowiedniego narządu lub kontekstu, nadal może przekazać autosomalny wariant. Taki „przeskok” nie jest klasyczną niepełną penetracją; wynika z definicji fenotypu ograniczonego płcią.

Imprinting: znaczenie zależy od rodzica pochodzenia

W loci imprintowanych aktywność allelu może zależeć od tego, czy został odziedziczony od matki czy ojca. Dwie osoby z podobną zmianą liczby kopii albo wariantem mogą mieć inny fenotyp w zależności od pochodzenia.

To nie jest zwykła dominacja. Model wymaga:

• fazy rodzicielskiej;
• stanu metylacji;
• regionu kontrolnego;
• możliwości uniparentalnej disomii;
• mozaiki.

W rodowodzie wariant może być przekazywany przez osobę bez fenotypu, a ujawnić się po zmianie rodzica pochodzenia w następnym pokoleniu. „Penetracja wariantu” bez tej informacji łączy odmienne genotypy funkcjonalne.

Kanały przyczynowe pomagają rozdzielić plejotropię

Załóżmy trzy zmienne:

• G — wariant;
• M — biomarker pośredni;
• Y — choroba.

Możliwe modele:

1. G → M → Y — skutek mediowany;
2. G → M i niezależnie G → Y — plejotropia pozioma;
3. G → M, a Y → M — odwrócony kierunek dla części związku;
4. G jest w LD z dwoma wariantami działającymi osobno.

Samo skojarzenie G z M i Y nie rozstrzyga. Pomagają:

• czas pomiaru;
• funkcjonalne perturbacje;
• precyzyjne mapowanie;
• kolokalizacja;
• analiza mediacji;
• niezależne warianty instrumentalne.

Korekta o mediator może usuwać prawdziwy efekt

Jeśli biomarker leży w drodze przyczynowej, dodanie go jako współzmiennej „korygującej” usuwa część działania wariantu. Jeśli jest czynnikiem zakłócającym, korekta jest potrzebna. Diagram przyczynowy powinien poprzedzać model regresji.

Epistaza może zmieniać kierunek efektu

Najprostszy modyfikator osłabia lub wzmacnia efekt. Bardziej złożona interakcja może odwrócić kierunek:

• allel A zwiększa fenotyp przy B/B;
• nie ma efektu przy B/b;
• zmniejsza fenotyp przy b/b.

Uśrednienie po populacji może wtedy dać efekt bliski zeru, choć w każdej warstwie genotypowej efekt jest duży.

Częstość tła wpływa na średni efekt

Jeżeli allel modyfikujący ma różną częstość w populacjach, obserwowany średni efekt głównego wariantu może się różnić bez zmiany jego mechanizmu molekularnego. To jedna z przyczyn, dla których oszacowania ryzyka nie przenoszą się automatycznie.

Nie należy jednak przypisywać każdej różnicy epistazie. Konkurencyjne wyjaśnienia to:

• inny dobór próby;
• środowisko;
• opieka medyczna;
• struktura populacji;
• inne warianty główne;
• błąd.

Rescue jest silnym testem, ale nie rozwiązuje wszystkiego

W doświadczeniu komórkowym przywrócenie prawidłowego produktu i odwrócenie fenotypu wzmacnia związek przyczynowy. Trzeba jednak sprawdzić:

• poziom ekspresji konstruktu;
• miejsce integracji;
• izoformę;
• czas podania;
• wpływ na inne szlaki;
• czy rescue odwraca wszystkie czy jedną cechę.

Nadekspresja może nieswoiście kompensować problem. Częściowy rescue jednej cechy przy braku innych może ujawnić plejotropię, niewłaściwy model lub nieodwracalne skutki rozwojowe.

Test szeregu dawek

Porównanie 0%, 25%, 50%, 100% i nadmiaru aktywności produktu może pokazać:

• próg;
• nieliniowość;
• okno optymalne;
• toksyczność nadmiaru;
• różne progi dla różnych fenotypów.

To bogatszy dowód niż samo porównanie knockout–kontrola.

Jak czytać twierdzenie o penetracji

Zadaj kolejno:

1. Jaki wariant lub klasa wariantów?
2. Jaki genotyp i faza?
3. Jaka populacja?
4. Jak zdefiniowano fenotyp?
5. Do jakiego wieku?
6. Jak wybrano uczestników?
7. Czy uwzględniono probanda?
8. Jak traktowano profilaktykę i zgony?
9. Jaki jest przedział ufności?
10. Czy wynik zreplikowano?

Jeśli brakuje odpowiedzi, liczba powinna być traktowana jako orientacyjna, nie indywidualna prognoza.

Jak analizować zmienną ekspresywność

1. Ujednolić kryteria fenotypu.
2. Zmierzyć genotyp i fazę.
3. Sprawdzić CNV i mozaikę.
4. Rejestrować wiek oraz leczenie.
5. Mierzyć fenotyp ilościowo.
6. Oddzielić cechy pierwotne od wtórnych.
7. Szukać wariantów modyfikujących.
8. Uwzględnić środowisko.
9. Stosować niezależne replikaty.
10. Raportować cały rozkład, nie tylko średnią.

Jak testować epistazę

W doświadczeniu

Potrzebne są co najmniej cztery stany:

• kontrola;
• perturbacja A;
• perturbacja B;
• perturbacja A+B.

Następnie wybiera się jawny model oczekiwanego wyniku. Bez pojedynczych perturbacji nie wiadomo, czy podwójny fenotyp jest interakcją.

W danych ludzkich

Potrzebne są:

• duża próba;
• kontrola struktury populacji;
• poprawne genotypy;
• korekta wielokrotnego testowania;
• replikacja;
• sens biologiczny;
• właściwa skala.

Liczba par wariantów rośnie kwadratowo. Przesiew wszystkich interakcji ma znacznie większy problem mocy niż zwykły GWAS.

Najczęstsze błędy

1. „Penetracja to nasilenie.” Nasilenie należy do ekspresywności.
2. „Bezobjawowy nosiciel obala wariant.” Trzeba uwzględnić wiek, kryterium i penetrację.
3. „Penetracja genu wynosi X%.” Potrzebny jest wariant, fenotyp, populacja i czas.
4. „Brak choroby znaczy brak fenotypu.” Subtelny fenotyp może istnieć poniżej progu.
5. „Zmienna ekspresywność wyjaśnia każdą różnicę.” Najpierw trzeba wykluczyć różne genotypy, mozaikę i błąd pomiaru.
6. „Jeden gen związany z dwiema cechami jest plejotropowy.” Możliwe są LD, mediacja i bias.
7. „Plejotropia to epistaza.” Pierwsza łączy locus z wieloma cechami, druga loci w kształtowaniu cechy.
8. „Interakcja statystyczna dowodzi kontaktu białek.” Zależy od modelu i skali.
9. „Brak interakcji statystycznej wyklucza wspólny szlak.” Moc i skala mogą ją ukrywać.
10. „Wysoka penetracja oznacza ciężką chorobę.” Częstość ujawnienia i nasilenie są niezależne.
11. „Patogenny oznacza 100% ryzyka.” Klasyfikacja wariantu i penetracja są różne.
12. „Każda komórka jest niezależnym replikatem.” Komórki jednego klonu dzielą historię.

Co warto umieć po przeczytaniu

Czytelnik powinien potrafić:

• zdefiniować penetrację z pełnym mianownikiem;
• odróżnić penetrację od ekspresywności;
• wyjaśnić wpływ wieku i progu;
• rozpoznać bias rodzin klinicznych;
• odróżnić plejotropię poziomą, pionową i pozorną;
• odróżnić epistazę biologiczną od statystycznej;
• wskazać rolę tła poligenowego i środowiska;
• nie mylić patogenności z indywidualnym ryzykiem;
• zaplanować czterostanowy test interakcji;
• właściwie określić jednostkę w doświadczeniu komórkowym;
• zastosować te pojęcia do rodowodu, edycji genomu i SCNT.

Genotyp jest ważnym warunkiem początkowym. Penetracja, ekspresywność, plejotropia i epistaza pokazują, dlaczego nie jest kompletną przepowiednią organizmu.

Literatura i źródła