Transkryptomika single-cell i spatial

Streszczenie

Klasyczny RNA-seq mierzy średnią z wielu komórek. Single-cell RNA-seq rozdziela tę średnią na profile pojedynczych komórek lub jąder, lecz najczęściej traci ich położenie. Transkryptomika przestrzenna zachowuje współrzędne, płacąc za to rozdzielczością, liczbą genów, czułością albo polem widzenia. Połączenie obu metod może opisać skład tkanki, stany komórek i ich sąsiedztwa, ale nie tworzy automatycznie katalogu „prawdziwych typów”.

Ten artykuł prowadzi przez pełny projekt: jednostkę biologiczną, dysocjację, wybór komórki lub jądra, barcodes i UMI, konstrukcję macierzy zliczeń, ambient RNA, doublets, normalizację, integrację, klasteryzację, adnotację, differential expression, pseudotime, multimodalność i przestrzeń. Szczególny nacisk kładzie na pseudoreplikację: tysiące komórek od jednego dawcy nie zastępują niezależnych dawców.

Trzy poziomy pytania biologicznego

Przed wyborem platformy trzeba ustalić, czy pytanie dotyczy:

1. Składu — jakie komórki występują i w jakich proporcjach?
2. Stanu — co robią komórki danego typu w określonym warunku?
3. Organizacji — gdzie te komórki leżą i z kim sąsiadują?

Bulk RNA-seq dobrze odpowiada na średni program próbki. Single-cell pomaga rozdzielić skład od stanu. Spatial dodaje geometrię. Żadna warstwa sama nie mierzy całej funkcji tkanki.

Efekt składu może udawać zmianę ekspresji

Załóżmy, że gen X jest silnie eksprymowany w makrofagach, a słabo w komórkach nabłonkowych. Jeśli w chorej tkance rośnie udział makrofagów, bulk pokaże wzrost X, nawet gdy żadna komórka nie zmieniła własnej ekspresji.

Single-cell pozwala zapytać osobno:

• czy zmienił się udział makrofagów;
• czy makrofagi zmieniły stan;
• czy pojawił się nowy podtyp;
• czy wynik wynika z jakości lub partii.

To nie oznacza, że bulk jest metodą gorszą. Przy odpowiedniej liczbie replikatów daje stabilny pomiar średniego efektu i często większą moc dla zmian ekspresji w całej próbce.

Jednostką biologiczną jest dawca lub hodowla

Komórki nie są niezależnymi replikatami, jeśli pochodzą od tego samego organizmu, organoidu lub naczynia. Dzielą genotyp, historię, środowisko i proces przygotowania.

Hierarchia może wyglądać tak:

warunek → dawca → fragment tkanki → biblioteka → komórka → UMI

Test statystyczny musi respektować poziom, na którym przypisano warunek. Jeśli leczenie otrzymało trzech dawców, a kontrolę trzech innych, podstawową liczebnością porównania jest zwykle sześć dawców, nie 30 tysięcy komórek.

Analizy traktujące komórki jak niezależne obserwacje mogą dramatycznie zaniżać wartości p i zwiększać liczbę fałszywych odkryć. Porównania metod single-cell wykazały, że agregacja zliczeń do pseudobulk per dawca lub modele mieszane lepiej kontrolują błąd niż naiwny test komórka-po-komórce.⁵

Replikat techniczny i biologiczny

Replikat biologiczny pochodzi z niezależnej jednostki biologicznej: innego dawcy, niezależnej hodowli albo osobnego różnicowania.

Replikat techniczny powtarza pomiar tego samego materiału:

• druga biblioteka;
• druga lane;
• drugi capture;
• ponowne sekwencjonowanie.

Techniczne powtórzenie ocenia proces, ale nie poszerza zmienności biologicznej. Dwie biblioteki jednego organoidu nie zastępują dwóch niezależnych organoidów.

Projekt partii trzeba rozwiązać przed eksperymentem

Najgorszy układ to wszystkie kontrole przygotowane jednego dnia, a wszystkie przypadki innego. Wtedy warunek jest idealnie spleciony z partią. Integracja obliczeniowa nie wie, czy różnica wynika z choroby, operatora, czasu niedokrwienia czy lotu odczynników.

Lepszy projekt:

• miesza warunki w każdej partii;
• randomizuje kolejność;
• używa tych samych lotów lub rejestruje ich zmianę;
• multipleksuje próbki przed capture, jeśli to możliwe;
• zachowuje identyfikator dawcy;
• równoważy płeć, wiek i inne współzmienne;
• uwzględnia klatkę, płytkę i lane w metadanych.

Sample multiplexing

Próbki można znakować przeciwciałami z oligonukleotydem, lipidowymi tagami albo rozpoznawać po naturalnych wariantach genetycznych. Po zmieszaniu przechodzą wspólnie przez capture i bibliotekę, co zmniejsza efekt partii.

Multiplexing nie usuwa wszystkich problemów:

• tag może być słaby lub nieswoisty;
• doublet może zawierać komórki różnych dawców;
• dawcy spokrewnieni są trudniejsi do demultipleksowania genotypowego;
• mieszanina po dysocjacji nie wyrównuje wcześniejszych różnic;
• brak tagu tworzy kategorię nieprzypisaną.

Od tkanki do zawiesiny

Największa selekcja często zachodzi przed sekwencjonowaniem. Tkankę trzeba rozdrobnić, rozluźnić macierz zewnątrzkomórkową i uwolnić komórki. Enzymy, czas, temperatura oraz mechanika różnie wpływają na typy komórek.

Można utracić:

• duże neurony;
• adipocyty;
• komórki o rozgałęzionej morfologii;
• komórki mocno przytwierdzone;
• kruche komórki umierające;
• komórki otoczone gęstą macierzą.

Otrzymany atlas opisuje komórki, które przetrwały protokół i zostały wychwycone, nie koniecznie wszystkie obecne w tkance.

Dysocjacja uruchamia odpowiedź stresową

Natychmiast po pobraniu zmieniają się:

• niedotlenienie;
• temperatura;
• sygnały mechaniczne;
• kontakt komórka–komórka;
• aktywność proteaz;
• transkrypcja immediate-early genes.

Program stresowy może zostać pomylony ze stanem chorobowym. Czas od pobrania do utrwalenia lub lizy powinien być mierzony, a nie opisywany jako „szybko”.

Viability nie jest wystarczającym QC

Wysoka żywotność barwieniowa nie gwarantuje:

• reprezentatywnego składu;
• braku ambient RNA;
• zachowania delikatnych typów;
• właściwego stanu transkrypcyjnego;
• braku agregatów;
• odpowiedniej liczby komórek.

Kontrola zawiesiny obejmuje stężenie, rozkład wielkości, agregaty, debris, żywotność i porównanie ze składem tkanki metodą niezależną, na przykład histologią lub cytometrią.

Komórka czy jądro

W scRNA-seq izoluje się całe komórki. W snRNA-seq — jądra. Jądra są praktyczne dla tkanki zamrożonej, mózgu, serca, mięśni i materiałów trudnych do łagodnej dysocjacji. DroNc-seq pokazał, że profilowanie jąder można skalować w systemie mikroprzepływowym.³

Co zmienia pomiar jądra

Jądro zawiera:

• pre-mRNA;
• więcej odczytów intronowych;
• mniej dojrzałego cytoplazmatycznego mRNA;
• inne proporcje transkryptów;
• sygnał genów długich i aktywnej transkrypcji.

snRNA-seq może lepiej zachować skład tkanki i umożliwić analizę archiwalnych próbek. Nie jest jednak identycznym pomiarem o mniejszej czułości. Porównanie komórek i jąder wymaga dostosowania referencji oraz interpretacji.

Izolacja jąder również selekcjonuje

Detergent, mechanika i sortowanie mogą:

• rozrywać część jąder;
• faworyzować określoną wielkość;
• usuwać jądra o nietypowej chromatynie;
• zwiększać debris;
• zmieniać udział ambient RNA.

Nie istnieje bezbiasowy protokół. Istnieje protokół, którego bias jest opisany i możliwy do kontroli.

Jak działa kropla z kulką

W metodach kroplowych strumień komórek spotyka się z kulkami pokrytymi oligonukleotydami. Kropla ma idealnie zawierać jedną komórkę i jedną kulkę. Po lizie mRNA wiąże się do oligo-dT.

Każdy oligonukleotyd zawiera:

• sekwencję potrzebną do amplifikacji i sekwencjonowania;
• cell barcode wspólny dla kulki;
• UMI losowy dla cząsteczki;
• oligo-dT wiążące ogon poli(A).

Drop-seq był jednym z przełomowych opisów skalowalnego profilowania kroplowego.¹ Późniejsze systemy z żelowymi kulkami i gotowym workflow zwiększyły liczbę komórek i standaryzację.²

Cell barcode mówi skąd, UMI — ile molekuł

Cell barcode przypisuje read do kropli. UMI ma rozróżniać pierwotne cząsteczki przed PCR. Reads o tym samym genie, barcode i UMI są redukowane do jednego zliczenia po korekcie błędów.

UMI nie:

• przywraca niewychwyconego RNA;
• usuwa bias oligo-dT;
• rozpoznaje wszystkich chimer;
• gwarantuje niezależność przy kolizjach;
• mierzy bezpośrednio liczbę białek;
• poprawia błędnego przypisania genu.

Kolizja UMI

Przestrzeń UMI jest skończona. Przy dużej liczbie molekuł dwa niezależne transkrypty mogą otrzymać ten sam UMI. Naiwna deduplikacja zaniży wynik. Z drugiej strony błąd sekwencjonowania w UMI może sztucznie utworzyć nową molekułę.

Korekta używa odległości między sekwencjami, jakości i liczebności, ale wymaga założeń.

Capture jest losowaniem

Nie każde mRNA zostaje uwolnione, związane, przepisane na cDNA i odczytane. Dane są rzadkie. Zero w macierzy może oznaczać:

• prawdziwy brak transkryptu;
• niską ekspresję i brak wychwycenia;
• utratę cząsteczki;
• słabą jakość komórki;
• niedopasowanie do adnotacji;
• filtr.

Dlatego pojedynczy brak markera nie powinien sam wykluczać typu komórki.

3′, 5′ i pełna długość

Metody 3′ zliczają koniec poliadenylowany i dobrze skalują liczbę komórek. Metody 5′ ułatwiają łączenie z V(D)J receptorów limfocytów. Metody płytkowe pełnej długości dostarczają więcej informacji o izoformach i wariantach, ale zwykle dla mniejszej liczby komórek i przy większym koszcie na komórkę.

Wybór zależy od endpointu:

• atlas składu — wiele komórek;
• rzadka populacja — duża liczba wejściowa;
• izoformy — pełna długość lub long reads;
• klonotypy — 5′ i biblioteka V(D)J;
• niska ekspresja — większa czułość per komórka.

Doublets wynikają z probabilistyki loadingu

Przy losowym ładowaniu część kropli jest pusta, część zawiera jedną komórkę, a część dwie lub więcej. Zwiększenie stężenia podnosi odzysk, ale także odsetek multipletów.

Doublet może wyglądać jak:

• hybrydowy typ z markerami dwóch linii;
• komórka o nadzwyczaj dużej liczbie genów;
• stan przejściowy;
• rzadka populacja.

Jak wykrywa się doublets

Metody obliczeniowe symulują sztuczne pary lub szukają nietypowych sąsiedztw. Sample multiplexing i genotypy wykrywają doublets różnych dawców, lecz nie doublets dwóch komórek tego samego dawcy.

Nie należy usuwać każdej komórki z markerami dwóch typów. Może być prawdziwym stanem biologicznym, fagocytozą, kontaktem albo ambient RNA. Potrzebna jest kombinacja:

• score;
• liczby UMI i genów;
• oczekiwanego odsetka;
• markerów;
• niezależnego potwierdzenia;
• położenia przestrzennego.

Ambient RNA tworzy sygnał bez komórki

Uszkodzone komórki uwalniają RNA do zawiesiny. Krople bez komórki i krople z inną komórką mogą je wychwycić. Gen silnie eksprymowany w jednym typie pojawia się wtedy słabo w całym zbiorze.

Przykłady:

• hemoglobina z erytrocytów;
• albumina z hepatocytów;
• immunoglobuliny z plazmocytów;
• enzymy trzustkowe;
• mitochondrialne RNA z uszkodzonych komórek.

Empty droplets są źródłem informacji

Profil pustych kropli pomaga oszacować tło. Modele korekcji ambient RNA używają go do estymacji kontaminacji per komórka. Korekta jest przybliżeniem: jeśli prawdziwa komórka ekspresjonuje ten sam gen, nie da się mechanicznie odjąć „obcej” części bez niepewności.

Metadane powinny zachować surową macierz wszystkich barcode, nie tylko finalne komórki.

Od FASTQ do macierzy

Pipeline:

1. odczytuje strukturę R1, indeksów i R2;
2. koryguje cell barcodes względem whitelist;
3. mapuje lub pseudoalignuje część transkryptową;
4. przypisuje read do genu;
5. grupuje UMI;
6. rozpoznaje barcode zawierające komórkę;
7. tworzy macierz gen × komórka;
8. raportuje metryki.

Referencja zmienia macierz

Wynik zależy od:

• wersji genomu;
• GTF;
• definicji genów;
• włączenia intronów;
• rozdzielenia paralogów;
• pseudogenów;
• sekwencji mitochondrialnej;
• transgenów i reporterów.

W snRNA-seq liczenie tylko eksonów marnuje dużą część sygnału. W modelu organoidu transgen powinien być jawnie dodany do referencji. Porównanie dwóch pipeline wymaga tej samej referencji i reguł.

Cell calling nie jest prostym progiem

Barcode o dużej liczbie UMI prawdopodobnie zawiera komórkę, ale mała prawidłowa komórka może mieć niewiele RNA. Empty droplet z ambient RNA może mieć dużo zliczeń.

Metody używają:

• rank plot;
• modelu tła;
• oczekiwanej liczby komórek;
• cech ekspresji;
• informacji obrazowej.

Zbyt agresywny próg usuwa małe limfocyty. Zbyt łagodny zachowuje puste krople.

Liczba komórek i głębokość rozwiązują inne problemy

Więcej komórek zwiększa szansę znalezienia rzadkiej populacji i pozwala lepiej opisać zróżnicowanie. Więcej reads na komórkę zwiększa liczbę wykrytych cząsteczek i stabilność profilu. Przy stałym budżecie te cele konkurują.

Projekt atlasu może preferować:

• wiele komórek;
• umiarkowaną głębokość;
• wielu dawców;
• szerokie pokrycie typów.

Projekt dotyczący subtelnej odpowiedzi w jednym typie może potrzebować:

• wystarczającej liczby tego typu per dawca;
• większej głębokości;
• większej liczby dawców;
• mniejszego multipleksowania.

Sequencing saturation nie jest procentem „poznanego transkryptomu”

Saturation szacuje, jaki udział kolejnych reads trafia do już obserwowanych kombinacji UMI. Wysoka wartość oznacza, że dodatkowe sekwencjonowanie tej biblioteki przyniesie relatywnie mało nowych molekuł. Nie oznacza, że wychwycono wszystkie RNA obecne w komórce.

Utracona cząsteczka przed reverse transcription nigdy nie pojawi się po głębszym sekwencjonowaniu. Dlatego trzeba rozdzielić:

• złożoność biologiczną;
• wydajność capture;
• złożoność biblioteki;
• głębokość odczytu;
• nasycenie PCR.

Krzywa rarefaction

Subsampling reads pokazuje, jak liczba genów i UMI rośnie z głębokością. Można porównać:

• czy biblioteka jest niedosekwencjonowana;
• czy próbki różnią się złożonością;
• czy dalsze reads są opłacalne;
• czy wyrównanie głębokości zmienia wnioski.

Nie powinno się wyrównywać przez arbitralne odrzucenie większości danych bez sprawdzenia, jaki problem statystyczny ma to rozwiązać.

Moc badania zależy od dawców i komórek na typ

Dodanie kolejnych komórek jednego dawcy zmniejsza niepewność profilu tego dawcy, ale nie estymuje lepiej zmienności między ludźmi. Po pewnym poziomie więcej dawców daje większą moc niż więcej komórek od tych samych osób.

Planowanie uwzględnia:

• spodziewany efekt;
• wariancję między dawcami;
• częstość typu;
• odzysk po QC;
• doublets;
• nierównowagę capture;
• liczbę warunków;
• testy wielu genów;
• model statystyczny.

Rzadka populacja jest podwójnie kosztowna

Jeśli typ stanowi 0,1%, średnio jedna na tysiąc wychwyconych komórek do niego należy. Aby uzyskać 100 takich komórek, trzeba odzyskać około 100 tysięcy komórek — przed uwzględnieniem strat i zmienności.

Alternatywy:

• wzbogacenie FACS;
• depletion dominującego typu;
• selekcja markerem;
• większa liczba capture;
• celowany panel;
• spatial, jeśli lokalizacja jest znana.

Wzbogacenie zmienia możliwość estymacji pierwotnej proporcji. Należy zachować próbkę niewzbogaconą albo udokumentować wydajność sortowania.

Toolstack jest wymienny, logika pozostaje

Przetwarzanie może wykonać Cell Ranger, STARsolo, kallisto|bustools lub alevin-fry. Analizę prowadzą między innymi Seurat i Scanpy. Doublets wykrywają narzędzia symulacyjne, ambient RNA — modele tła, integrację — anchors, Harmony, scVI lub inne przestrzenie latentne.

Lista nazw nie jest pipeline. Odtwarzalny workflow musi zapisać:

• wersje;
• parametry;
• kolejność;
• referencję;
• losowe ziarna;
• obiekty pośrednie;
• liczbę komórek na etap;
• etykiety i ich autorstwo;
• zmiany ręczne.

Obiekt analityczny nie zastępuje danych surowych

Plik Seurat lub AnnData zawiera przetworzone macierze, embeddingi i etykiety. Powinien wskazywać:

• które layer zawiera raw counts;
• które normalized values;
• czy integrated assay służy tylko do grafu;
• jakie geny usunięto;
• jakie komórki odrzucono;
• skąd pochodzą metadane.

Bez surowej macierzy i barcode nie można niezależnie odtworzyć filtrów.

Stabilność wniosków trzeba testować

Wynik nie powinien zależeć od jednego arbitralnego parametru. Analiza wrażliwości może zmieniać:

• progi QC;
• liczbę PC;
• k grafu;
• resolution;
• metodę integracji;
• zestaw zmiennych genów;
• model doublet;
• referencję adnotacji.

Prawdziwa główna populacja powinna pozostawać rozpoznawalna. Mały klaster znikający po drobnej zmianie może być słabo wsparty.

Leave-one-donor-out

Powtórzenie analizy bez jednego dawcy pokazuje, czy klaster lub marker jest napędzany przez jedną osobę. Dobrze wyglądać na zbiorczym UMAP może populacja obecna wyłącznie w jednym sample.

Wynik biologiczny powinien być widoczny:

• w wielu dawcach;
• w surowych zliczeniach;
• w odpowiedniej tkance;
• przy rozsądnych filtrach;
• w niezależnej walidacji.

QC komórki nie sprowadza się do trzech liczb

Najczęściej ogląda się:

• liczbę UMI;
• liczbę wykrytych genów;
• procent mitochondrialny;
• procent rybosomalny;
• złożoność;
• doublet score;
• ambient contamination;
• geny stresu;
• rozkład per próbka.

Wysoki procent mitochondrialny może wskazywać uszkodzenie, ale zależy od typu komórki i tkanki. Kardiomiocyt ma inną biologię niż limfocyt. Sztywny globalny próg może selektywnie usunąć prawdziwą populację.

Praktyczny proces:

1. ogląda rozkłady per próbka;
2. porównuje znane typy;
3. identyfikuje wielowymiarowe odstające profile;
4. sprawdza wrażliwość wyników na filtry;
5. dokumentuje liczbę komórek po każdym kroku.

Best-practice workflow powinien traktować QC, normalizację, redukcję wymiarów i testowanie jako łańcuch zależnych decyzji, a nie zestaw domyślnych funkcji.⁴

Normalizacja nie „usuwa biologii”

Komórki różnią się całkowitą liczbą UMI z powodu capture, wielkości, ilości RNA i stanu biologicznego. Prosta normalizacja dzieli przez sumę zliczeń i skaluje do wspólnej wartości, a następnie logarytmuje.

Założenie, że większość genów nie zmienia się globalnie, może zawieść:

• przy przejściu z małej do dużej komórki;
• w aktywacji transkrypcyjnej;
• między komórką a jądrem;
• przy zmianie całkowitej zawartości RNA.

Modele count-based mogą uwzględniać zależność wariancji od średniej. Niezależnie od metody trzeba zachować surowe zliczenia do testów.

Regresowanie współzmiennych

Można modelować:

• liczbę UMI;
• procent mitochondrialny;
• cykl komórkowy;
• partię.

Nie każdą korelację należy usuwać. Jeśli cykl komórkowy jest częścią odpowiedzi na leczenie, regresowanie go usuwa biologiczny endpoint. Decyzja powinna wynikać z pytania.

Redukcja wymiarów jest wizualizacją modelu

Macierz ma tysiące genów. Wybiera się zmienne geny, skaluje dane i wykonuje PCA. Na przestrzeni głównych składowych buduje się graf najbliższych sąsiadów.

UMAP lub t-SNE rzutuje ten graf do dwóch wymiarów. Odległość na obrazku nie jest wierną miarą całej transkryptomicznej różnicy. Oddzielne „wyspy” mogą powstać przez:

• parametry;
• partię;
• małą liczbę połączeń;
• filtr;
• prawdziwą separację;
• nadmierną integrację.

Nie należy mierzyć procesu biologicznego linijką na UMAP.

Klaster nie jest typem komórki

Leiden lub Louvain dzieli graf na społeczności. Parametr resolution zmienia ich liczbę. Ta sama populacja może być jednym klastrem albo pięcioma podklastrami.

Klaster jest wynikiem:

• wybranych genów;
• normalizacji;
• liczby PC;
• grafu sąsiadów;
• algorytmu;
• resolution;
• składu zbioru.

Adnotacja wymaga wielu dowodów

Nazwa typu powinna opierać się na:

• kombinacji markerów dodatnich;
• markerach ujemnych;
• funkcji;
• lokalizacji;
• atlasie referencyjnym;
• zgodności między dawcami;
• białkach powierzchniowych;
• dostępności chromatyny;
• walidacji obrazowej lub cytometrycznej.

Pojedynczy marker często nie jest swoisty. Nazwy powinny odpowiadać rozdzielczości dowodu: „komórka śródbłonka” może być uzasadniona, gdy dokładny podtyp pozostaje niepewny.

Reference mapping może utrwalić błąd

Automatyczny klasyfikator przypisuje query do etykiet atlasu. Jeśli atlas:

• nie zawiera nowego stanu;
• pochodzi z innej tkanki lub wieku;
• używa innych protokołów;
• ma błędne etykiety;
• słabo reprezentuje populację,

model może wybrać najbliższą niepoprawną nazwę. Powinna istnieć opcja „unknown” lub niski confidence.

Integracja ma usuwać technikę, nie stan

Metody integracji szukają wspólnych struktur między próbkami. Mogą używać anchors, korekty przestrzeni latentnej, modeli probabilistycznych albo mutual nearest neighbors.

Dobry wynik:

• miesza partie w obrębie tych samych typów;
• zachowuje różnicę biologiczną między warunkami;
• nie tworzy sztucznych połączeń;
• nie usuwa populacji obecnej tylko w chorobie.

Overcorrection i undercorrection

Undercorrection pozostawia klastry partii.

Overcorrection łączy różne stany lub typy tylko dlatego, że algorytm oczekuje odpowiedników.

Ocena używa:

• znanych markerów;
• mieszania per typ;
• zachowania warunku;
• markerów spike-in lub kontroli;
• porównania przed i po;
• wyników per dawca;
• metryk lokalnych i biologicznych.

Integrated representation służy często do wizualizacji i klasteryzacji. Differential expression powinno wracać do surowych zliczeń i modelu dawcy.

Differential expression wymaga właściwego poziomu

Najbezpieczniejszy prosty model:

1. wybiera typ komórki;
2. sumuje zliczenia per gen i dawca — pseudobulk;
3. zachowuje niezależne próbki;
4. używa modeli bulk RNA-seq;
5. uwzględnia batch, płeć i inne współzmienne;
6. raportuje efekt oraz niepewność.

Pseudobulk nie jest idealny dla każdego pytania. Gdy interesuje rozkład odpowiedzi komórek lub wielopoziomowy model, można użyć modeli mieszanych. Wciąż trzeba respektować dawców.

Proporcje komórek też mają niepewność

Udział typu zależy od:

• biologii;
• dysocjacji;
• przeżycia;
• capture;
• cell calling;
• filtrów;
• adnotacji.

Porównanie proporcji wymaga replikatów i modelu danych kompozycyjnych. Wzrost udziału jednej populacji automatycznie zmniejsza udziały pozostałych, nawet bez zmiany ich liczby bezwzględnej.

Pseudoczas nie jest czasem zegarowym

Algorytm porządkuje komórki wzdłuż osi podobieństwa. Wynik może sugerować przejście od progenitora do stanu dojrzałego, ale komórki zostały zwykle zniszczone podczas pomiaru i nie obserwowano ich historii.

Pseudoczas wymaga:

• wyboru root;
• wystarczającego pokrycia stanów pośrednich;
• grafu o właściwej topologii;
• braku dominującego batchu;
• niezależnej wiedzy o kierunku.

Branch nie dowodzi decyzji losu

Rozgałęzienie może wynikać z:

• dwóch linii rozwojowych;
• cyklu komórkowego;
• stresu;
• różnicy dawcy;
• brakującego stanu;
• parametrów grafu.

Potwierdzenie wymaga lineage tracing, perturbacji, pomiarów czasowych lub markerów dziedziczenia.

RNA velocity

Modele velocity używają relacji unspliced i spliced RNA do estymacji lokalnego kierunku zmian. Zakładają kinetykę transkrypcji, splicingu i degradacji. Założenia mogą nie pasować do gwałtownej regulacji, różnych typów lub stanu ustalonego.

Strzałka na UMAP jest hipotezą dynamiczną, nie nagraniem ruchu komórki.

Multimodalność dodaje osie pomiaru

CITE-seq mierzy RNA i białka powierzchniowe za pomocą przeciwciał znakowanych oligonukleotydami. scATAC-seq mierzy dostępność chromatyny. Multiome może łączyć RNA i ATAC z tego samego jądra. V(D)J dodaje klonotyp receptorów limfocytów.

Zintegrowana analiza wielomodalna może budować wspólny graf, nadając różne wagi RNA, białku i chromatynie.⁹

Modalności mają własne tło

Antibody-derived tags wymagają:

• titration;
• kontroli nieswoistego wiązania;
• korekty ambient antibodies;
• znajomości klonu przeciwciała;
• interpretacji nasycenia.

ATAC wymaga oceny:

• fragmentów w peakach;
• TSS enrichment;
• fragmentów mono- i dinukleosomalnych;
• doublets;
• głębokości;
• jakości jąder.

Wspólny barcode nie sprawia, że każda warstwa jest równie czuła.

Spatial nie jest jedną technologią

Metody można podzielić na:

1. capture-based — RNA przejmuje barcode pozycji, a później jest sekwencjonowane;
2. imaging-based — transkrypty są wykrywane w miejscu przez rundy hybrydyzacji lub odczytu;
3. region-based — wybrane obszary są profilowane osobno;
4. in situ sequencing — sekwencja lub barcode jest odczytywana bezpośrednio w tkance.

Pierwsza praca określana jako spatial transcriptomics użyła powierzchni z kodowanymi pozycjami pod skrawkiem tkanki.⁶ Slide-seq zwiększył rozdzielczość dzięki losowo rozmieszczonym, wcześniej zdekodowanym kulkom.⁷ MERFISH pokazał skalowalne, błędoodporne kodowanie wielu RNA w obrazowaniu.⁸

Cztery kompromisy

Każda metoda wybiera punkt między:

• liczbą genów;
• czułością;
• rozdzielczością;
• polem widzenia.

Capture całotranskryptomowy może mierzyć wiele genów, ale spot obejmuje kilka komórek. Obrazowanie może lokalizować cząsteczki subkomórkowo, lecz często używa panelu wybranych genów i wymaga segmentacji.

Tkanka jest częścią assay spatial

Jakość zależy od:

• niedokrwienia;
• utrwalenia;
• mrożenia lub parafiny;
• grubości skrawka;
• orientacji;
• morfologii;
• permeabilizacji;
• autofluorescencji;
• degradacji RNA;
• powierzchni objętej capture.

Skrawek zawiera tylko przekrój trójwymiarowej struktury. Dwie sąsiednie sekcje nie są identyczne, a mała zmiana płaszczyzny może zmienić skład.

Optymalizacja permeabilizacji

Za krótka permeabilizacja zmniejsza odzysk RNA. Za długa powoduje dyfuzję i utratę lokalizacji. Optimum zależy od tkanki, utrwalenia i grubości.

Test optymalizacyjny jest częścią metody, nie niepotrzebnym zużyciem materiału.

Spot nie zawsze jest komórką

W capture-based spatial spot może zawierać kilka komórek, fragmenty komórek albo przestrzeń bez jąder. Macierz spot × gen jest mieszaniną.

Dekonwolucja używa sygnatur single-cell do estymacji:

• typów obecnych w spocie;
• ich proporcji;
• czasem stanów.

Referencja scRNA-seq musi pasować

Jeśli referencja utraciła delikatny typ podczas dysocjacji, dekonwolucja nie może go przypisać. Jeśli pochodzi z innego dawcy, wieku lub warunku, sygnatury mogą nie pasować. Zbyt podobne typy są trudne do rozdzielenia przy małej liczbie UMI.

Wynik jest modelem, nie obserwacją każdej komórki.

Segmentacja jest ukrytym źródłem błędu

W imaging-based spatial punkty RNA trzeba przypisać do komórek. Segmentacja zwykle zaczyna od jąder i rozszerza granice na podstawie błony lub obrazu.

Błędy:

• dwie komórki połączone;
• jedna podzielona;
• RNA przypisane sąsiadowi;
• długie wypustki pominięte;
• komórka bez widocznego jądra utracona;
• autofluorescencja uznana za sygnał.

Profil „komórki” zależy więc od obrazu i algorytmu. Należy przechowywać maski, wersję segmentacji i punkty RNA.

Subkomórkowa lokalizacja

RNA może leżeć w jądrze, cytoplazmie, wypustce lub przy błonie. Wymuszenie wszystkich punktów do jednego wektora komórki traci tę informację. Dla neuronów i spolaryzowanego nabłonka lokalizacja może być biologicznym endpointem.

Sąsiedztwo nie dowodzi komunikacji

Spatial może pokazać, że dwa typy leżą blisko. Nie dowodzi, że ligand jednego aktywuje receptor drugiego.

Analiza ligand–receptor wymaga:

• ekspresji ligandu;
• ekspresji receptora;
• zgodności przestrzennej;
• znajomości kompleksów;
• downstream response;
• kontroli wielokrotnego testowania;
• perturbacji lub walidacji.

RNA receptora nie gwarantuje białka na powierzchni. Ligand może działać na odległość lub być związany z macierzą.

Null model dla przestrzeni

Komórki nie są losowo rozmieszczone. Warstwy tkanki, gęstość i geometria wpływają na liczbę sąsiadów. Test wzbogacenia kontaktów powinien porównywać z null model zachowującym odpowiednie cechy.

Prosta liczba par może odzwierciedlać tylko wysoką częstość obu typów.

Integracja single-cell i spatial

Typowy workflow:

1. buduje atlas single-cell;
2. definiuje stabilne typy i stany;
3. tworzy sygnatury;
4. mapuje lub dekonwoluuje spoty;
5. sprawdza markery in situ;
6. analizuje domeny i sąsiedztwa;
7. wraca do histologii;
8. waliduje kluczowe relacje.

Circular validation

Jeśli te same markery służą do zdefiniowania typu, mapowania go w przestrzeni i „potwierdzenia” lokalizacji, dowód jest kolisty. Potrzebne są niezależne markery, białka, morfologia lub perturbacja.

Organoidy i różnicowanie

Single-cell może ujawnić:

• oczekiwane linie;
• populacje off-target;
• niedojrzałość;
• stres;
• proliferację;
• różnice między partiami;
• ciąg stanów różnicowania.

Spatial dodaje:

• strefy;
• polaryzację;
• lumen;
• gradient niedotlenienia;
• sąsiedztwo linii;
• zaburzoną architekturę.

Benchmark wobec tkanki nie jest prostym podobieństwem

Organoid może być podobny do tkanki płodowej, ale brakować mu naczyń, odporności i mechaniki. Mapping do atlasu wybiera najbliższą referencję, nawet jeśli model nie odpowiada żadnemu prawidłowemu etapowi.

Należy ocenić:

• wiele atlasów;
• markery funkcjonalne;
• trajektorię;
• proporcje;
• strukturę;
• fizjologię;
• reprodukowalność partii.

Produkt komórkowy

W terapii komórkowej single-cell może opisać heterogeniczność produktu, resztkowe komórki niezróżnicowane i program stresu. Nie jest samodzielnym testem mocy biologicznej.

Ważne pytania:

• czy próbka do scRNA-seq reprezentuje cały lot;
• jaki jest limit detekcji rzadkiej niepożądanej populacji;
• czy dysocjacja selektywnie ją usuwa;
• czy atlas training obejmuje wszystkie ryzyka;
• czy wynik jest wystarczająco szybki;
• jak zostanie potwierdzony testem rutynowym.

Rzadkość zerowa w przebadanych komórkach nie oznacza zerowej częstości w produkcie.

Jak policzyć rzadką populację

Jeśli losowo przebadano n niezależnych komórek i nie znaleziono zdarzenia, przybliżona górna granica 95% częstości wynosi 3/n — reguła trzech.

Dla 10 000 komórek:

3 / 10 000 = 0,0003 = 0,03%

To założenie idealnego losowania i doskonałej detekcji. W praktyce capture, QC i klasyfikacja pogarsza limit.

Walidacja wyniku

Single-cell lub spatial powinno generować hipotezę, a nie kończyć projekt.

Metody ortogonalne:

• immunofluorescencja;
• RNA-FISH;
• cytometria;
• sortowanie i funkcja;
• qPCR pseudobulk;
• histologia;
• lineage tracing;
• perturbacja;
• niezależna kohorta.

Walidacja powinna zmieniać źródło błędu. Ten sam antibody clone w dwóch modalnościach nie jest całkowicie niezależny.

Jak raportować badanie

Projekt

• liczba dawców i replikatów;
• kryteria włączenia;
• randomizacja;
• partie;
• czas pobrania;
• tkanka i region;
• sample multiplexing.

Laboratorium

• protokół dysocjacji;
• czas i temperatura;
• viability i skład;
• cell/nucleus;
• platforma i kit;
• target loading;
• biblioteki;
• głębokość;
• kontrole.

Analiza

• referencja i GTF;
• pipeline i wersje;
• cell calling;
• QC per próbka;
• doublets i ambient RNA;
• normalizacja;
• integracja;
• parametry grafu;
• adnotacja i confidence;
• model statystyczny;
• poziom replikacji.

Spatial

• utrwalenie i grubość;
• orientacja skrawka;
• permeabilizacja;
• segmentacja;
• rozdzielczość;
• panel lub pełny transkryptom;
• dekonwolucja;
• null model sąsiedztwa.

Najczęstsze błędy

1. „Dziesięć tysięcy komórek to dziesięć tysięcy replikatów.” Replikatem jest dawca.
2. „Zero oznacza brak ekspresji.” Może oznaczać brak capture.
3. „UMI usuwa wszystkie błędy PCR.” Ma kolizje i błędy.
4. „Wysoki procent mitochondrialny zawsze oznacza martwą komórkę.” Zależy od typu.
5. „UMAP pokazuje prawdziwe odległości.” Jest projekcją grafu.
6. „Klaster jest typem.” Nazwa wymaga dowodów.
7. „Integracja usuwa tylko batch.” Może usunąć biologię.
8. „Pseudoczas odtwarza historię.” Porządkuje różne komórki.
9. „Spot to komórka.” Często jest mieszaniną.
10. „Segmentacja jest neutralna.” Definiuje profil komórki.
11. „Sąsiedztwo oznacza sygnalizację.” Jest dopiero warunkiem.
12. „Brak rzadkiej populacji dowodzi bezpieczeństwa.” Obowiązuje limit detekcji.

Co warto umieć po przeczytaniu

Czytelnik powinien potrafić:

• rozdzielić skład, stan i organizację;
• wskazać prawdziwą jednostkę replikacji;
• zaprojektować zbalansowane partie;
• porównać komórkę i jądro;
• wyjaśnić barcode, UMI i capture;
• rozpoznać doublets i ambient RNA;
• opisać drogę FASTQ–macierz;
• dobrać QC per próbka i typ;
• interpretować UMAP i klaster jako wynik modelu;
• użyć pseudobulk do porównania dawców;
• odróżnić pseudoczas od lineage;
• porównać capture i imaging spatial;
• ocenić dekonwolucję i segmentację;
• zaplanować walidację ortogonalną.

Powiązane artykuły

• Biblioteka sekwencyjna — adaptery, indeksy, UMI i amplifikacja.
• Platformy krótkich odczytów — jak powstaje FASTQ.
• Jak czyta się epigenom — dostępność chromatyny i modyfikacje.
• Genetyka rozwoju — los, stan i trajektorie rozwojowe.

Literatura i źródła