Streszczenie

SCNT może wytworzyć kilka zwierząt wywodzących się z tej samej komórki albo tej samej linii komórkowej. Dzięki temu mają bardzo podobny genom jądrowy, również wtedy, gdy przed transferem jądra wprowadzono do komórek określoną zmianę. Taki układ bywa użyteczny do badania penetracji mutacji, wpływu środowiska, terapii, fizjologii dużego zwierzęcia lub zgodności narządu.

Klony nie są jednak powtórzeniami tej samej obserwacji w takim sensie jak ponowne zmierzenie jednej probówki. Każde zwierzę przechodzi osobny rozwój, ma własne łożysko, mitochondria, mikrobiom, historię chorób i doświadczenia. Dodatkowo sam SCNT może pozostawić zmienność epigenetyczną. Zmniejszenie wariancji genetycznej nie usuwa wariancji biologicznej.

Najważniejsze zastosowania obejmują:

  • pary i grupy o podobnym genomie do rozdzielenia wpływu genów i środowiska;
  • zwierzęta z wcześniej zweryfikowaną zmianą genomu;
  • duże modele chorób, zwłaszcza świnie;
  • zwierzęta-dawców tkanek i narządów w badaniach ksenotransplantacji;
  • rzadkie modele naczelnych, gdy pytania nie da się rozwiązać mniej obciążającym systemem.

Największym błędem metodologicznym jest uznanie, że pięć klonów jednej linii reprezentuje pięć niezależnych genotypów. Dla wniosku o działaniu konkretnego allelu mogą być pięcioma zwierzętami. Dla wniosku o całej populacji są nadal tylko jednym tłem genetycznym.

Edycja wprost w zygocie grozi mozaiką. Edycja linii komórek pozwala wcześniej sprawdzić oba allele i miejsca poza celem, wybrać właściwy klon komórkowy i dopiero wtedy przez SCNT stworzyć zwierzę o znanym genotypie.
Edycja wprost w zygocie grozi mozaiką. Edycja linii komórek pozwala wcześniej sprawdzić oba allele i miejsca poza celem, wybrać właściwy klon komórkowy i dopiero wtedy przez SCNT stworzyć zwierzę o znanym genotypie.

Po co ujednolicać genom

W zwykłej grupie zwierząt każdy osobnik niesie inny zestaw wariantów. Jeżeli interwencja działa tylko u części z nich, trudno rozstrzygnąć, czy przyczyną jest:

  • badany gen;
  • modyfikator w innym locus;
  • płeć;
  • mikrobiom;
  • żywienie;
  • przypadkowa różnica rozwojowa;
  • efekt leczenia.

Grupa klonów usuwa część tej zmienności. Nie oznacza to automatycznie lepszego badania. Ujednolicenie jest zaletą tylko wtedy, gdy odpowiada pytaniu.

Pytania, dla których wspólne tło pomaga
  • Czy dwie diety różnie wpływają na zwierzęta o tym samym genotypie?
  • Jaka jest penetracja edytowanej mutacji?
  • Czy terapia odwraca określony fenotyp?
  • Jak duża część zmienności powstaje mimo wspólnego genomu?
  • Czy przeszczepione narządy tej samej linii dawcy zachowują się podobnie?
  • Jak zmienia się odpowiedź po kontrolowanej ekspozycji środowiskowej?
Pytania, dla których wspólne tło przeszkadza
  • Czy lek zadziała w zróżnicowanej populacji?
  • Jak wiele alleli modyfikuje chorobę?
  • Jak często wystąpi działanie niepożądane w różnych rasach?
  • Czy efekt powtarza się przy innych haplotypach?
  • Jak szeroka jest relacja dawka–odpowiedź w populacji?

Jedna linia klonalna może dać bardzo precyzyjny wynik, który jest prawdziwy tylko dla niej.

Co jest wspólne, a co pozostaje różne

Wspólny genom jądrowy

Jeżeli wszystkie zwierzęta powstały z tej samej linii:

  • mają zgodny zestaw chromosomów jądrowych;
  • dzielą badany allel;
  • dzielą większość wariantów tła;
  • nie przechodzą nowej mejozy przy tworzeniu klona.

Przed przyjęciem tej wspólności trzeba potwierdzić tożsamość STR/SNP i pełny genotyp modyfikacji. Etykieta fiolki nie jest dowodem.

Różne mitochondria

Oocyty mogą pochodzić od różnych samic, a więc nieść różne haplotypy mtDNA. Jeśli metabolizm energetyczny jest endpointem, różnica może stać się istotnym czynnikiem. Możliwe strategie:

  • jedno źródło oocytów;
  • blokowanie według haplotypu;
  • genotypowanie mtDNA;
  • uwzględnienie dawczyni oocytu w modelu;
  • replikacja na innym tle mitochondrialnym.
Różne ciąże

Każda biorczyni tworzy własne środowisko:

  • przepływ krwi;
  • hormony;
  • odporność;
  • odżywienie;
  • temperatura;
  • stres;
  • choroby;
  • leki;
  • mikrobiom.

Jeżeli kilka zarodków rozwija się w jednej macicy, współdzielą część środowiska i nie są w pełni niezależne. Jeżeli każdy rozwija się u innej biorczyni, rośnie niezależność ciąży, lecz również wariancja prenatalna.

Różny epigenom

Przeprogramowanie nie jest matrycowym kopiowaniem stanu dawcy. Każdy zrekonstruowany oocyt może inaczej:

  • usunąć H3K9me3;
  • odtworzyć metylację;
  • aktywować genom;
  • regulować XIST;
  • utrzymać imprinting;
  • tworzyć trofoblast.

Wspólna linia komórkowa nie gwarantuje wspólnego epigenomu przy urodzeniu.

Różny mikrobiom i wychowanie

Sposób porodu, siara, matka zastępcza, kojec, pasza, opiekunowie i antybiotyki kształtują mikrobiom i zachowanie. W badaniu odporności lub metabolizmu trzeba je traktować jako element projektu, nie szum po fakcie.

Mutacje po rozdzieleniu

Komórki gromadzą mutacje podczas hodowli, a organizmy podczas życia. Klony zaczynają od bardzo podobnego genomu, lecz nie pozostają atomowo identyczne.

Klon nie jest technicznym replikatem

Replikat techniczny

To ponowny pomiar tej samej próbki lub materiału. Pomaga ocenić błąd procedury pomiarowej.

Replikat biologiczny

To niezależna jednostka, na której realizuje się biologiczny proces i do której losuje się interwencję. W badaniu zwierzęcym może nim być:

  • pojedyncze zwierzę;
  • miot;
  • klatka;
  • biorczyni;
  • grupa społeczna;
  • partia hodowlana.

Wytyczne ARRIVE 2.0 wymagają jawnego wskazania jednostki eksperymentalnej, randomizacji, zaślepienia i sposobu ustalenia liczebności.1

Co jest jednostką w grupie klonów

To zależy od interwencji:

  • lek podawany indywidualnie — zwykle zwierzę;
  • dieta podawana całemu kojcowi — kojec;
  • leczenie biorczyni w ciąży — biorczyni lub ciąża;
  • procedura wspólna dla miotu — miot może tworzyć klaster;
  • przeszczep organów od jednego dawcy — trzeba uwzględnić dawstwo i partię.

Nie można zwiększyć liczby n, mierząc dziesięć tkanek jednego klona i nazywając je dziesięcioma zwierzętami.

Trzy różne poziomy wnioskowania

Poziom 1: ten konkretny genotyp

Pytanie: czy interwencja działa u zwierząt o tym genomie? Kilka klonów może stanowić niezależne jednostki biologiczne, jeśli otrzymują interwencję niezależnie.

Poziom 2: ten allel na kilku tłach

Pytanie: czy efekt wynika z edytowanego allelu, a nie z unikatowego tła? Potrzebne są co najmniej:

  • niezależne klony komórkowe z tą samą edycją;
  • linie kontrolne przechodzące proces;
  • inne tła genetyczne;
  • odwrócenie lub rescue.
Poziom 3: gatunek albo przyszli pacjenci

Pytanie: czy mechanizm uogólnia się na populację? Jedna grupa klonów nie wystarcza, nawet jeśli liczy wiele zwierząt. Potrzebna jest różnorodność:

  • genetyczna;
  • płci;
  • wieku;
  • środowiska;
  • ośrodków;
  • niezależnych modeli.

Precyzja wewnątrz linii i uogólnialność między liniami są oddzielnymi własnościami.

Projekty eksperymentalne wykorzystujące klony

Projekt parowany

Dwa klony tego samego genotypu trafiają do różnych warunków:

klon A → interwencja

klon B → kontrola

Zaleta: zmniejszenie różnic genetycznych.

Ograniczenie: para jest tylko jedną parą. Aby oszacować wariancję i oddzielić efekt od losowego rozwoju, potrzeba wielu par, najlepiej pochodzących z więcej niż jednej linii.

Split-clone design

Z każdej linii klonalnej część zwierząt trafia do leczenia, a część do kontroli. Linia staje się blokiem:

Linia Kontrola Terapia
A 2 2
B 2 2
C 2 2

Model może rozdzielić:

  • efekt terapii;
  • efekt linii;
  • interakcję terapia × linia.

To znacznie silniejszy dowód uogólnienia niż osiem klonów linii A.

Cross-over

To samo zwierzę otrzymuje w różnym czasie obie interwencje. Ma sens, gdy:

  • efekt jest odwracalny;
  • istnieje washout;
  • kolejność jest randomizowana;
  • choroba nie postępuje szybko;
  • pierwsze leczenie nie zmienia trwale drugiej fazy.

Klonowanie nie jest konieczne do cross-over, ale klony mogą zwiększyć kontrolę równoległą.

Badanie discordant twins

Klonalne odpowiedniki „bliźniąt rozdzielonych” mogą badać wpływ:

  • diety;
  • aktywności;
  • zakażenia;
  • mikrobiomu;
  • stresu;
  • leczenia prenatalnego.

Eksperyment musi zdefiniować, czy interesuje go różnica średnia, wariancja czy próg fenotypu. Sama fotografia dwóch inaczej wyglądających zwierząt nie jest analizą.

Projekt jednej linii z głębokim fenotypowaniem

Może być zasadny w badaniu mechanistycznym lub pilotażowym. Wtedy wniosek powinien pozostać wąski: „u tej linii zaobserwowano…”. Głębia pomiaru nie zastępuje replikacji genetycznej.

Losowanie i blokowanie

Klony powinny być losowane do grup, o ile interwencja na to pozwala. Losowanie może być warstwowe według:

  • płci;
  • masy;
  • biorczyni;
  • miotu;
  • haplotypu mtDNA;
  • daty urodzenia;
  • kojca;
  • wyjściowej wartości endpointu.
Czego nie robić

Nie wolno przeznaczyć:

  • wszystkich klonów z pierwszej serii do kontroli;
  • wszystkich z drugiej serii do terapii;
  • wszystkich lżejszych do jednej grupy;
  • wszystkich od jednej biorczyni do jednego ramienia.

Wtedy efekt leczenia jest nierozdzielny od efektu partii.

Sekwencja losowania

Należy zapisać:

  • kto ją wygenerował;
  • kiedy;
  • jaką metodą;
  • jaka była jednostka;
  • czy przydział był ukryty;
  • jakie odstępstwa nastąpiły.

NC3Rs podkreśla, że randomizacja daje każdej jednostce jednakową szansę przydziału i ogranicza systematyczny bias.2

Zaślepienie

Widoczna mutacja albo różnica zabiegu może utrudnić pełne zaślepienie, ale można rozdzielić role:

  • opiekun zna grupę;
  • osoba wykonująca obrazowanie nie zna;
  • próbki mają kody;
  • patolog nie zna interwencji;
  • analityk otrzymuje zablokowaną tabelę;
  • kod otwiera się po zatwierdzeniu kryteriów.

Jeżeli zaślepienie jest niemożliwe, trzeba wskazać etap i zastosować obiektywny endpoint.

Efekty partii SCNT

Partią może być:

  • dzień pobrania oocytów;
  • dawczyni oocytów;
  • seria dojrzewania;
  • operator;
  • pożywka;
  • urządzenie;
  • aktywacja;
  • inkubator;
  • linia komórkowa;
  • numer pasażu;
  • dzień transferu;
  • stado biorczyń.
Batch nie jest zwykłą datą

Partia jest wspólną historią biologiczną. Jeżeli wszystkie zwierzęta leczone pochodzą z partii 1, a kontrolne z partii 2, żadna analiza statystyczna nie odzyska informacji, której projekt nie rozdzielił.

Minimalizacja
  • mieszać grupy w każdej serii;
  • przenosić zarodki różnych ramion do biorczyń w tym samym okresie;
  • używać kilku operatorów z kalibracją;
  • rejestrować loty odczynników;
  • nie zmieniać wielu parametrów naraz;
  • powtórzyć wynik w niezależnej serii.
Modelowanie

Efekty biorczyni, miotu, linii i partii można traktować jako efekty losowe lub stałe zależnie od pytania i liczby poziomów. Najważniejsze, by struktura danych została zaplanowana przed analizą.

Moc statystyczna: mniej wariancji nie znaczy „wystarczą dwa”

Ujednolicenie genomu może zmniejszyć wariancję wybranych cech, ale:

  • SCNT może dodać wariancję rozwojową;
  • endpoint może być naturalnie zmienny;
  • klaster obniża efektywną liczebność;
  • mała próba źle szacuje odchylenie;
  • brak różnych linii zawęża wniosek.
Co wchodzi do obliczenia
  • oczekiwana wielkość efektu;
  • wariancja;
  • błąd I rodzaju;
  • moc;
  • korelacja wewnątrz klastra;
  • straty i wykluczenia;
  • liczba linii;
  • liczba zwierząt w linii;
  • analiza główna.
Zwierzęta kontra linie

Dwadzieścia klonów jednej linii może dać dużą moc dla efektu leczenia w tej linii i niemal żadną podstawę do wniosku o zmienności między genotypami. Pięć linii po cztery zwierzęta odpowiada na szersze pytanie, choć ma mniej powtórzeń wewnątrz każdej linii.

Nie zwiększaj n pomiarami

Jeżeli z jednego zwierzęcia pobrano:

  • 10 skrawków;
  • 100 pól obrazu;
  • 10 000 komórek;

to nadal jest jedno zwierzę na poziomie interwencji. Pomiary zagnieżdżone zwiększają precyzję opisu tego zwierzęcia, nie liczbę niezależnych osobników.

Mapa hierarchii danych

W badaniu klonów obserwacje są zwykle zagnieżdżone:

pole obrazu ⊂ skrawek ⊂ narząd ⊂ zwierzę ⊂ biorczyni/miot ⊂ linia ⊂ partia

Nie każdy poziom występuje w każdym projekcie, ale pominięcie istniejącego poziomu prowadzi do zawyżonej pewności.

Pola i komórki

Tysiące komórek z jednego preparatu pozwalają dobrze opisać rozkład komórkowy tego preparatu. Nie reprezentują tysiąca niezależnych zwierząt. Można:

  • agregować wynik do zwierzęcia;
  • użyć modelu wielopoziomowego;
  • losować pola według ustalonej reguły;
  • zaślepić segmentację;
  • zachować surowe obrazy.
Narządy

Wątroba i nerka jednego zwierzęcia są różnymi tkankami, ale dzielą genom, ciążę i leczenie. Jeżeli hipoteza dotyczy narządowo swoistej odpowiedzi, narząd jest czynnikiem wewnątrzosobniczym, nie kolejnym osobnikiem.

Zwierzęta

To najczęstsza jednostka interwencji, lecz dwa zwierzęta z jednej ciąży albo jednego kojca mogą być skorelowane. Wspólna biorczyni oddziałuje prenatalnie, a wspólny kojec może narzucać dietę, mikrobiom i hierarchię społeczną.

Linie

Linia komórkowa jest jednostką dla wniosku o niezależnym efekcie edycji. Dziesięć zwierząt z jednej kolonii nie kompensuje braku drugiej, niezależnie edytowanej kolonii, jeżeli istnieje ryzyko prywatnej zmiany genomowej.

Partie

Partia może obejmować kilka linii i zwierząt. Jeżeli wszystkie linie edytowane wykonano miesiąc później niż kontrolne, data produkcji staje się konkurencyjnym wyjaśnieniem.

Plan analizy przed powstaniem kohorty

SCNT jest zbyt kosztowne, by dopiero po urodzeniu zwierząt zastanawiać się, jaka analiza będzie możliwa.

Estymand

Trzeba określić, co dokładnie ma zostać oszacowane:

  • średnia różnica po określonym czasie;
  • zmiana względem wartości wyjściowej;
  • pole pod krzywą;
  • czas do zdarzenia;
  • prawdopodobieństwo odpowiedzi;
  • efekt w tej linii;
  • średni efekt między liniami;
  • interakcja genotyp × leczenie.

Różne estymandy wymagają innego projektu.

Populacja docelowa

Może nią być:

  • pięć wyprodukowanych klonów;
  • wszystkie zwierzęta tej linii;
  • wszystkie świnie z określoną edycją;
  • gatunek;
  • pacjenci z określoną chorobą.

Im szersza populacja, tym więcej niezależnych teł i warunków potrzeba.

Intercurrent events

Z góry trzeba ustalić, jak traktować:

  • śmierć;
  • leczenie ratunkowe;
  • zmianę dawki;
  • infekcję;
  • ciążę;
  • wykluczenie weterynaryjne;
  • brak pomiaru;
  • uszkodzenie urządzenia.

Usunięcie wszystkich „nietypowych” zwierząt po obejrzeniu wyników może stworzyć pozornie jednorodną kohortę.

Analiza intencji i analiza per protocol

W badaniach interwencyjnych główna analiza może zachować jednostki w grupach, do których je losowano, nawet jeśli nie zrealizowały idealnie procedury. Analiza per protocol odpowiada na inne pytanie i może być uzupełniająca. Zasada powinna być określona przed otwarciem kodów.

Wielokrotność

Duży model generuje setki biomarkerów. Należy oddzielić:

  • jeden lub kilka endpointów potwierdzających;
  • endpointy wtórne;
  • analizy eksploracyjne;
  • omiki generujące hipotezy.

Bez tego dowolny pojedynczy sygnał może zostać przedstawiony jako sukces.

Prerejestracja i zamrożenie decyzji

Plan powinien istnieć w wersjonowanym dokumencie przed przydziałem interwencji, a przynajmniej przed analizą. Zawiera:

  • hipotezę;
  • kryteria włączenia;
  • główny endpoint;
  • liczebność;
  • jednostkę;
  • randomizację;
  • model;
  • wykluczenia;
  • punkty humanitarne;
  • warunki wcześniejszego zakończenia.

Zmiana planu może być naukowo uzasadniona. Musi jednak pozostać widoczna z datą i powodem. Prerejestracja nie zakazuje uczenia się; rozdziela test zaplanowany od analizy odkrywczej.

Analiza etapowa

Jeżeli badanie ma zatrzymywać się po wykazaniu skuteczności, braku skuteczności albo szkody, progi trzeba skorygować do liczby spojrzeń na dane. Nieformalna praktyka „sprawdzamy co dwa zwierzęta i kończymy, gdy p < 0,05” zwiększa ryzyko fałszywego wyniku.

Komitet monitorujący

W projekcie wysokiego ryzyka niezależny zespół może przeglądać:

  • zdarzenia niepożądane;
  • dobrostan;
  • jakość danych;
  • kryteria przerwania;
  • dane odkodowane, których zespół wykonawczy nie powinien znać.

Od odkrycia do wyniku translacyjnego

Klonalna kohorta może być pierwszym szczeblem, ale nie powinna być ostatnim.

Etap mechanistyczny

Cel: wykazać, że określony allel albo szlak zmienia proces. Użyteczne są:

  • pary izogeniczne;
  • głęboka biologia;
  • rescue;
  • omiki;
  • histologia;
  • zależność czasowa.
Etap powtarzalności

Cel: sprawdzić, czy wynik wraca:

  • w nowej partii SCNT;
  • u innego operatora;
  • w drugiej linii;
  • u obu płci;
  • w niezależnym laboratorium.

Powtórzenie nie powinno korzystać z dokładnie tego samego ukrytego zestawu warunków.

Etap uogólnienia

Cel: zbadać kilka teł genetycznych, dawek, wieku i warunków. Na tym etapie celowo zwiększa się heterogeniczność. Wariancja, którą wcześniej ograniczano, staje się obiektem pomiaru.

Etap predykcyjny

Cel: określić, czy wynik przewiduje odpowiedź w bardziej zbliżonym do zastosowania układzie:

  • naturalnej chorobie;
  • materiale ludzkim;
  • drugim gatunku;
  • narządzie ex vivo;
  • badaniu bezpieczeństwa.

Brak przejścia między etapami jest informacją o granicy modelu, a nie powodem do ukrywania wcześniejszego wyniku.

SCNT po edycji genomu

To zastosowanie różni się od prostego „ujednolicenia stada”. Najpierw tworzy się i kwalifikuje produkt komórkowy, potem odtwarza z niego organizm.

Etap 1: projekt allelu

Definiuje się:

  • oczekiwaną sekwencję;
  • wszystkie zmieniane kopie;
  • funkcję;
  • możliwe produkty uboczne;
  • sposób potwierdzenia;
  • fenotyp komórkowy;
  • plan rescue.
Etap 2: dostarczenie edytora

Do komórek można wprowadzić:

  • RNP;
  • RNA;
  • plazmid;
  • donor DNA;
  • wektor wirusowy.

Metoda wpływa na czas ekspozycji, integrację i toksyczność.

Etap 3: izolacja klonów komórkowych

Pojedyncza komórka daje kolonię. Każda może mieć inny allel. Screening powinien wykrywać nie tylko małą zmianę w miejscu cięcia, lecz również:

  • duże delecje;
  • insercje matrycy;
  • rearanżacje;
  • utratę heterozygotyczności;
  • zmiany liczby kopii;
  • translokacje;
  • aneuploidię.
Etap 4: niezależne linie

Jedna prawidłowa kolonia nie daje niezależności. Dobrze mieć co najmniej dwie linie z tym samym zaprojektowanym efektem, powstałe niezależnie. Jeżeli obie dają podobny fenotyp, słabnie hipoteza, że odpowiada przypadkowa mutacja tła.

Etap 5: kontrola procesu

Kontrola „wild type” powinna przejść porównywalnie:

  • hodowlę;
  • transfekcję lub procedurę sham;
  • selekcję;
  • izolację kolonii;
  • liczbę pasaży;
  • SCNT.

Zwykłe zwierzę z fermy nie kontroluje skutków długiej hodowli komórek i klonowania.

Etap 6: SCNT

Wybrana komórka trafia do oocytu. Zarodek musi przejść przeprogramowanie, rozwój i ciążę. Genotyp komórki jest konieczny, ale nie wystarcza do przewidzenia kompetencji rozwojowej.

Etap 7: kwalifikacja zwierzęcia

Po urodzeniu wykonuje się:

  • STR/SNP tożsamości;
  • pełny genotyp miejsca docelowego;
  • ocenę mozaicyzmu w kilku tkankach;
  • liczbę kopii transgenu;
  • brak niezamierzonych integracji;
  • kariotyp lub analizę strukturalną;
  • RNA i białko;
  • właściwy fenotyp;
  • zdrowie ogólne.

SCNT ogranicza mozaicyzm typowy dla późnej edycji zygoty, ale nie zwalnia z jego pomiaru.

Pary izogeniczne

Najsilniejszy układ porównuje dwie linie różniące się zaplanowaną zmianą:

  • WT → SCNT → zwierzę kontrolne;
  • EDIT → SCNT → zwierzę zmodyfikowane.
Dlaczego „prawie izogeniczne”

Linie mogły rozdzielić się przed edycją i gromadzić inne mutacje. Mogą też różnić się:

  • liczbą pasaży;
  • presją selekcyjną;
  • wariantem off-target;
  • stanem epigenetycznym;
  • kompetencją rozwojową.
Rescue

Dowód przyczynowy wzmacnia:

  • przywrócenie prawidłowej sekwencji;
  • dostarczenie prawidłowego produktu genu;
  • farmakologiczne odwrócenie szlaku;
  • skrzyżowanie i segregacja allelu;
  • niezależna metoda perturbacji.

Jeżeli rescue usuwa fenotyp, hipoteza o roli genu jest znacznie mocniejsza.

Świnia jako platforma biomedyczna

Świnia jest szczególnie użyteczna, ponieważ ma:

  • rozmiar narządów zbliżony do człowieka;
  • anatomię przydatną dla chirurgii i urządzeń;
  • fizjologię krążenia i przewodu pokarmowego;
  • mioty;
  • rozwinięte technologie rozrodu;
  • możliwość wielogenowej modyfikacji komórek i SCNT.

Nie jest „dużą myszą”. Różnice immunologiczne, metaboliczne, anatomiczne i długości życia trzeba dopasować do pytania.

Modele chorób

Edytowane świnie wykorzystuje się lub rozwija jako modele:

  • mukowiscydozy;
  • dystrofii mięśniowej;
  • chorób sercowo-naczyniowych;
  • cukrzycy;
  • neurodegeneracji;
  • nowotworów;
  • gojenia i regeneracji.

Przegląd modeli transgenicznych podkreśla rolę SCNT w przenoszeniu zweryfikowanych zmian do świń, mimo ograniczonej wydajności procedury.3

Model urządzenia

Duży organizm umożliwia ocenę:

  • cewników;
  • zastawek;
  • implantów;
  • systemów obrazowania;
  • dostępu chirurgicznego;
  • długoterminowej funkcji.

Wspólny genom może zmniejszyć część wariancji, ale anatomia i masa nadal różnią się między zwierzętami.

Ksenotransplantacja

W tym obszarze SCNT jest etapem produkcji dawcy o zdefiniowanym genomie.

Dlaczego edytuje się świnię

Bariera obejmuje:

  • przeciwciała przeciw antygenom świni;
  • dopełniacz;
  • krzepnięcie;
  • zapalenie;
  • komórki odpornościowe;
  • wzrost narządu;
  • patogeny;
  • porcine endogenous retroviruses.

W komórkach można usuwać geny kodujące antygeny i dodawać ludzkie regulatory. Następnie SCNT tworzy zwierzę niosące zestaw zmian w całym ciele.

PERV jako przykład skali

W 2017 roku opisano inaktywację wielu kopii PERV w pierwotnej linii komórek świni i wytworzenie żywych zwierząt przez SCNT.4 Przykład pokazuje przewagę sekwencji:

edycja komórki → analiza → wybór → SCNT

nad próbą interpretacji mozaikowego zwierzęcia po edycji zarodka.

„Ten sam dawca” jako kontrola

Kilka klonów tej samej linii może dostarczać narządy o wspólnym zestawie modyfikacji. Ułatwia porównanie:

  • schematów immunosupresji;
  • metod perfuzji;
  • czasu przechowywania;
  • urządzeń;
  • odpowiedzi biorców.

Nie oznacza to, że narządy są identyczne. Różnią je rozwój, wiek, stan zdrowia, zakażenia i procedura pobrania.

Bioasekuracja

Model wymaga kontrolowanego stada, monitoringu mikrobiologicznego i śledzenia:

  • pochodzenia linii;
  • wszystkich edycji;
  • transmisji germinalnej;
  • statusu patogenów;
  • kontaktów;
  • paszy;
  • próbek archiwalnych;
  • losu biorców.

SCNT nie zastępuje kwalifikacji produktu narządowego.

Bydło, owce i kozy

Duże przeżuwacze mogą modelować:

  • laktację;
  • metabolizm;
  • rozwój płodu;
  • łożysko;
  • choroby mięśni;
  • produkcję białek w mleku;
  • implanty i chirurgię.

Ich wady to długi czas generacji, koszt utrzymania i silne obciążenie ciąż SCNT. Jeżeli pytanie dotyczy wyłącznie funkcji komórki, duże zwierzę może być nieproporcjonalnym modelem.

Bioreaktor zwierzęcy

Zmodyfikowana koza lub owca może wydzielać białko do mleka. SCNT pozwala przenieść wcześniej sprawdzony konstrukt. Badanie musi oddzielić:

  • obecność transgenu;
  • liczbę kopii;
  • miejsce integracji;
  • stabilność ekspresji;
  • skład mleka;
  • zdrowie gruczołu;
  • oczyszczanie produktu.

Klon jest nośnikiem systemu produkcyjnego, a nie samym lekiem.

Psy

Pies ma znaczenie dla:

  • chorób spontanicznych;
  • onkologii porównawczej;
  • neurologii;
  • zachowania;
  • weterynarii translacyjnej.

SCNT psa jest technicznie trudne przez nietypowy cykl i dojrzewanie oocytu. Tworzenie modeli wymaga więc szczególnie mocnego uzasadnienia, ponieważ liczba dawczyń i biorczyń może być duża.

Spontaniczna choroba kontra zaprojektowana mutacja

Psy rasowe już mają naturalne warianty chorób. Czasem lepiej badać heterogeniczną populację pacjentów weterynaryjnych niż klonować jednego osobnika. Klonowanie ma przewagę, gdy potrzebna jest:

  • konkretna edycja;
  • para kontrolna;
  • kontrolowany czas początku;
  • standaryzacja tła.

Naczelne inne niż człowiek

Bliskość fizjologiczna i zachowanie czynią naczelne potencjalnie informacyjnymi w neurologii, odporności, metabolizmie i rozrodzie. Jednocześnie ich potrzeby poznawcze i społeczne oraz niski lejek SCNT tworzą najwyższy próg etyczny.

Przypadek BMAL1

W badaniu z 2019 roku fibroblasty makaka z obustronnie zmienionym BMAL1 wykorzystano do SCNT. Z 325 zarodków przeniesionych do 65 biorczyń uzyskano 16 ciąż i pięć żywych klonów.5

Ten pełny mianownik jest równie ważny jak możliwość stworzenia grupy o wspólnym tle. Pięć zwierząt nie powstało z pięciu prostych procedur.

Co można zyskać
  • wspólny genotyp jądrowy;
  • brak mozaicyzmu badanego allelu;
  • porównywalny wiek;
  • głębokie monitorowanie;
  • model funkcji trudnej do odwzorowania u gryzonia.
Czego to nie rozwiązuje
  • małej liczby zwierząt;
  • jednej linii;
  • skutków SCNT;
  • cierpienia wynikającego z fenotypu choroby;
  • różnic biorczyń;
  • uogólnienia na ludzi;
  • kosztu dawczyń oocytów i nieudanych ciąż.

Przed takim projektem trzeba wykazać, że pytania nie da się odpowiedzialnie rozwiązać na komórkach, organoidach, gryzoniach, świniach, w danych pacjentów ani metodą nieinwazyjną.

Fenotyp modelu nie może być tylko nazwą genu

Knock-out genu związanego z chorobą nie jest jeszcze modelem choroby. Potrzebny jest łańcuch:

allel → RNA → białko → szlak → komórka → narząd → objaw → biomarker → odpowiedź na interwencję

Trafność konstruktu

Czy manipulacja odpowiada mechanizmowi u pacjenta? Całkowity knock-out może nie modelować heterozygotycznej mutacji typu gain-of-function.

Trafność fenotypowa

Czy zwierzę odtwarza istotne cechy, a nie tylko jeden marker?

Trafność predykcyjna

Czy interwencje skuteczne klinicznie dają przewidywalny sygnał? Czy model odróżnia działanie od braku działania?

Naturalna historia

Trzeba opisać:

  • początek;
  • progresję;
  • różnice płci;
  • wariancję;
  • przeżycie;
  • punkty humanitarne.

Klonowanie może ujednolicić tło, lecz nie waliduje modelu automatycznie.

Kontrole potrzebne w badaniu

Kontrola genetyczna
  • wild type na tym samym tle;
  • sham-edited;
  • niezależny klon komórkowy;
  • heterozygota, jeśli ma znaczenie;
  • rescue.
Kontrola procesu SCNT

Zwierzę po SCNT bez badanej edycji pozwala oddzielić część skutków klonowania od skutków allelu.

Kontrola rozrodu

Potomstwo płciowe edytowanego klona może sprawdzić, czy fenotyp utrzymuje się po przejściu przez gametogenezę i zapłodnienie. Jeżeli fenotyp znika, trzeba rozważyć wpływ SCNT lub epigenomu.

Kontrola środowiska
  • standaryzowane żywienie;
  • monitoring infekcji;
  • randomizacja kojców;
  • wzbogacenie;
  • porównywalna opieka;
  • pomiar stresu.

Potomstwo klona jako eksperyment rozdzielający

Skrzyżowanie zdrowego klona tworzy potomstwo z jego allelem na nowym tle i po zwykłym rozwoju zarodkowym.

To pozwala zapytać:

  • czy allel jest dziedziczony;
  • czy fenotyp segreguje z allelem;
  • czy problemy były związane z SCNT;
  • czy efekt zależy od tła;
  • czy zmiana wpływa na płodność.

Potomstwo nie jest już izogeniczne z klonem. Właśnie dlatego ma wartość jako niezależny etap walidacji.

Kontrola jakości od komórki do biobanku próbek

Linia komórkowa
  • identyfikator;
  • pochodzenie;
  • płeć;
  • pasaż;
  • mykoplazmy;
  • kariotyp;
  • WGS lub zaplanowany panel;
  • oczekiwany allel;
  • off-target;
  • materiał referencyjny.
Oocyt i zarodek
  • dawczyni;
  • haplotyp mtDNA;
  • stadium;
  • protokół;
  • operator;
  • rozwój;
  • transfer.
Biorczyni
  • identyfikator;
  • cykl;
  • leczenie;
  • liczba zarodków;
  • przebieg ciąży;
  • łożysko;
  • poród.
Klon
  • STR/SNP;
  • mtDNA;
  • genotyp w kilku tkankach;
  • zdrowie;
  • wzrost;
  • fenotyp modelu;
  • płodność.
Próbki

Trzeba bankować surowicę, osocze, komórki, tkanki, DNA, RNA i materiał mikrobiologiczny w zdefiniowanych punktach. Umożliwia to późniejszą analizę biomarkera, którego nie przewidziano przy rozpoczęciu projektu.

Dane podłużne

Duży model jest drogi, dlatego każdy osobnik dostarcza wielu pomiarów w czasie. Analiza musi uwzględniać korelację pomiarów.

Harmonogram
  • przed wystąpieniem choroby;
  • początek;
  • progresja;
  • przed leczeniem;
  • w trakcie;
  • po leczeniu;
  • endpoint;
  • obserwacja odległa.
Nie wybieraj najlepszego czasu po obejrzeniu danych

Główny endpoint i okno powinny być określone wcześniej. Badanie wielu momentów bez korekty zwiększa ryzyko przypadkowego wyniku.

Brakujące dane

Śmierć albo wykluczenie ciężko chorego zwierzęcia nie jest zwykłym brakiem losowym. Może być najważniejszym wynikiem. Analiza przeżycia, zasady imputacji i cenzorowanie wymagają planu.

3R: Replacement, Reduction, Refinement

Replacement — zastąpienie

Przed tworzeniem zwierzęcia należy sprawdzić:

  • komórki pierwotne;
  • iPSC;
  • organoid;
  • organ-on-chip;
  • model komputerowy;
  • materiał pacjentów;
  • naturalną chorobę weterynaryjną;
  • mniejszy gatunek.

ISSCR wskazuje organoidy i układy mikrofizjologiczne jako rozwijające się modele funkcji tkanek, choć również one mają ograniczenia.6

Reduction — ograniczenie liczby

Redukcja nie oznacza automatycznie jak najmniejszej grupy. Zbyt małe, nierozstrzygające badanie marnuje zwierzęta. Pomagają:

  • obliczenie mocy;
  • projekt parowany;
  • dane podłużne;
  • wspólne grupy kontrolne, jeśli naukowo uzasadnione;
  • bankowanie próbek;
  • analiza etapowa;
  • pilotaż techniczny bez pełnego fenotypu choroby.
Refinement — udoskonalenie
  • łagodniejsze pobranie;
  • analgezja;
  • trening współpracy;
  • telemetryczne pomiary;
  • wzbogacenie;
  • stabilne grupy społeczne;
  • wczesne kryteria przerwania;
  • leczenie wspomagające;
  • ograniczenie ciężkiego fenotypu;
  • nieinwazyjne obrazowanie.

SCNT dodaje do bilansu dawczynie oocytów, biorczynie, płody i noworodki. 3R musi obejmować wszystkie, nie tylko zwierzęta w końcowym eksperymencie.

Bramki decyzyjne

Bramka A: konieczność modelu
  • jasno zdefiniowane pytanie;
  • brak adekwatnego zastępstwa;
  • uzasadniony gatunek;
  • klinicznie istotny endpoint.
Bramka B: gotowość genetyczna
  • pełny allel;
  • niezależne linie;
  • integralność genomu;
  • kontrola;
  • rescue albo plan walidacji.
Bramka C: kompetencja SCNT
  • rozwój do blastocysty;
  • jawne mianowniki;
  • limit biorczyń;
  • protokół dobrostanu;
  • kryterium przerwania.
Bramka D: walidacja modelu
  • genotyp;
  • RNA/białko;
  • naturalna historia;
  • trafność konstruktu;
  • porównanie z chorobą człowieka;
  • reprodukowalny endpoint.
Bramka E: badanie interwencji
  • prerejestracja;
  • analiza mocy;
  • randomizacja;
  • zaślepienie;
  • plan braków;
  • kryteria sukcesu.

Jeżeli model nie przechodzi bramki D, nie powinno się automatycznie produkować większej kohorty do testu leku.

Jak raportować lejek tworzenia modelu

Etap Mianownik
edycja komórki/kolonie poddane screeningowi
poprawny allel wszystkie ocenione kolonie
integralność linie z pełnym QC
SCNT oocyty MII i rekonstrukcje
blastocysta aktywowane zarodki
transfer zarodki oraz biorczynie
ciąża biorczynie w kolejnych terminach
poród transfery i ciąże
przeżycie żywe urodzenia
model zdrowe klony z pełnym genotypem
fenotyp zakwalifikowane zwierzęta
eksperyment wszystkie losowane jednostki
analiza jednostki uwzględnione i przyczyny wykluczeń

Publikacja wyłącznie liczby końcowych zwierząt ukrywa koszt produkcji modelu.

Jak raportować eksperyment

Minimalny zestaw zgodny z logiką ARRIVE obejmuje:

  • hipotezę;
  • główny endpoint;
  • jednostkę eksperymentalną;
  • liczbę linii i zwierząt;
  • biorczynie, mioty i partie;
  • kryteria włączenia;
  • wykluczenia;
  • obliczenie liczebności;
  • randomizację;
  • ukrycie przydziału;
  • zaślepienie;
  • model statystyczny;
  • wszystkie działania niepożądane;
  • surowe mianowniki;
  • dostępność danych i kodu.

Sformułowanie „użyto pięciu identycznych klonów” powinno zostać zastąpione opisem tego, co rzeczywiście było wspólne i co sprawdzono.

Najczęstsze błędy

„Klony eliminują wariancję”

Eliminują część wariancji genomu jądrowego. Nie eliminują rozwoju, mitochondriów, mikrobiomu, pomiaru i SCNT.

„Pięć klonów to pięć genotypów”

Nie. To pięć organizmów jednego tła jądrowego.

„Mniejsza wariancja zawsze oznacza mniej zwierząt”

Nie bez oszacowania klastra, strat i wymaganej uogólnialności.

„Brak mozaicyzmu dowodzi poprawnej edycji”

Nie. Nadal możliwe są duże rearanżacje, integracje i off-target.

„Fenotyp genu jest fenotypem choroby”

Nazwa genu nie zastępuje walidacji mechanizmu i naturalnej historii.

„Zdrowe klony końcowe opisują dobrostan”

Nie obejmują nieudanych rekonstrukcji, ciąż, płodów i noworodków.

„Naczelny zawsze jest najlepszym modelem człowieka”

Bliskość nie gwarantuje trafności dla danego mechanizmu ani proporcjonalności kosztu etycznego.

„Jedna linia o głębokim fenotypie jest wynikiem populacyjnym”

Jest wynikiem dla jednej linii, dopóki nie zostanie powtórzona.

Checklista projektu

  • [ ] Pytanie wymaga organizmu.
  • [ ] Wybór gatunku wynika z fizjologii.
  • [ ] Wyjaśniono, po co potrzebne są klony.
  • [ ] Określono poziom uogólnienia.
  • [ ] Jednostka eksperymentalna jest jawna.
  • [ ] Liczba linii i zwierząt jest uzasadniona.
  • [ ] Istnieje kontrola procesu SCNT.
  • [ ] Istnieją niezależne linie edytowane.
  • [ ] Allel jest w pełni scharakteryzowany.
  • [ ] Integralność genomu jest oceniona.
  • [ ] mtDNA i biorczynie są rejestrowane.
  • [ ] Partie nie pokrywają się z grupami.
  • [ ] Randomizacja i zaślepienie są zaplanowane.
  • [ ] Model statystyczny uwzględnia klastry.
  • [ ] Główny endpoint jest ustalony wcześniej.
  • [ ] 3R obejmuje także produkcję klonów.
  • [ ] Istnieją punkty humanitarne.
  • [ ] Naturalna historia modelu jest opisana.
  • [ ] Materiał jest bankowany.
  • [ ] Potomstwo płciowe lub rescue weryfikuje mechanizm.

Wniosek

Klony są użytecznymi modelami wtedy, gdy ich wspólny genom rozwiązuje konkretny problem projektu. Nie są uniwersalnym sposobem na „czystsze dane”. Najlepszy układ wykorzystuje podobieństwo wewnątrz linii, a jednocześnie zabezpiecza uogólnienie przez kilka niezależnych linii, właściwe kontrole, losowanie, zaślepienie i analizę klastrów.

W przypadku edycji genomu SCNT ma dodatkową wartość: pozwala przejść od dokładnie zakwalifikowanej komórki do zwierzęcia bez konieczności akceptowania mozaikowego założyciela. Cena obejmuje jednak hodowlę komórek, ryzyko genomowe, przeprogramowanie, wiele oocytów i biorczyń.

Prawidłowa logika nie brzmi:

ten sam genom → identyczne zwierzęta → pewny wynik

lecz:

wspólne tło → mniej jednego rodzaju wariancji → jawne nowe źródła wariancji → projekt dopasowany do poziomu wniosku

Wtedy klonowanie może zwiększyć zdolność badania do wykrycia mechanizmu. Bez tej dyscypliny jednorodna kohorta tylko daje bardzo precyzyjną odpowiedź na zbyt wąskie albo źle postawione pytanie.