Klonowanie owiec i kóz

Streszczenie

Owca była pierwszym ssakiem, u którego dorosła komórka somatyczna doprowadziła po transferze jądra do narodzin żywego zwierzęcia. Koza szybko stała się ważnym gatunkiem dla łączenia SCNT z modyfikacją genetyczną i wytwarzaniem białek w mleku. Bliskie pokrewieństwo tych przeżuwaczy nie oznacza jednak jednego uniwersalnego protokołu.

Pełny proces obejmuje:

1. pozyskanie i dojrzewanie oocytów;
2. wybór oraz przygotowanie komórki dawcy;
3. enukleację;
4. wprowadzenie komórki lub jądra;
5. synchronizację cyklu komórkowego;
6. aktywację;
7. hodowlę do stadium transferu;
8. synchronizację biorczyni;
9. transfer;
10. rozpoznanie i utrzymanie ciąży;
11. rozwój łożyska;
12. poród oraz opiekę neonatalną;
13. długoterminową ocenę zdrowia i płodności.

Najwięcej strat nie musi powstawać podczas mikromanipulacji. Zarodek może dzielić się i dojść do blastocysty, a następnie utracić ciążę z powodu nieprawidłowego przeprogramowania trofoblastu i łożyska. Dlatego blastocysta jest etapem pośrednim, nie miarą końcowego sukcesu.

Najpierw: co dokładnie znaczy „udało się”

W literaturze można spotkać kilka „efficiency”:

• odsetek prawidłowo zrekonstruowanych oocytów;
• fusion rate;
• cleavage rate;
• morula/blastocyst rate;
• pregnancy per recipient;
• pregnancy per embryo transferred;
• delivery per recipient;
• live birth per reconstructed oocyte;
• live birth per transferred embryo;
• survival to weaning;
• zdrowy, płodny dorosły osobnik.

Wartość 20% blastocyst i 5% żywych urodzeń nie jest sprzeczna, jeśli pierwszy mianownik to zarodki hodowane, a drugi — zarodki transferowane. Różne badania mogą też:

• transferować jeden albo kilka zarodków;
• liczyć biorczynie albo gestational sacs;
• raportować poród, lecz nie przeżycie;
• łączyć różne linie komórkowe;
• usuwać serie niespełniające kryteriów.

W tym artykule wyniki są traktowane jako lejek, nie pojedynczy procent.

Dlaczego właśnie owca

Przed Dolly

Transfer jąder nie zaczął się od dorosłej komórki. Wcześniejsze eksperymenty używały:

• blastomerów;
• komórek zarodkowych;
• hodowanych komórek z wczesnego zarodka.

W 1996 roku opisano owce uzyskane po transferze jąder z ustalonej linii komórkowej pochodzenia embrionalnego. Był to dowód, że komórkę można hodować, manipulować i nadal wykorzystać do stworzenia potomstwa.¹

Co wykazała Dolly

Dolly nie była pierwszą sklonowaną owcą ani pierwszym ssakiem uzyskanym przez transfer jądra. Jej znaczenie polegało na pochodzeniu jądra z hodowanej komórki gruczołu mlekowego dorosłej owcy.

W grupie tej linii wykonano 277 rekonstrukcji/fuzji, 29 zarodków osiągających stadium przeznaczone do transferu przeniesiono do biorczyń, a urodziła się jedna Dolly. Każda z wartości odpowiada innemu mianownikowi:

• 1/277 — urodzenie względem prób rekonstrukcji;
• 1/29 — urodzenie względem transferowanych zarodków;
• liczba biorczyń — jeszcze inny wymiar obciążenia.

Oryginalna praca z 1997 roku wykazała żywe potomstwo z komórek dorosłych, płodowych i embrionalnych, lecz nie ustanowiła wysokowydajnej technologii.²

Co wynik znaczy biologicznie

Genom zróżnicowanej komórki nie utracił informacji potrzebnej do rozwoju organizmu. Jej aktywny stan musiał jednak zostać przeprogramowany przez cytoplazmę oocytu.

Nie znaczy to, że:

• każda komórka ma taką samą kompetencję;
• każdy zarodek jest prawidłowo przeprogramowany;
• blastocysta przewiduje prawidłowe łożysko;
• klon ma identyczne mitochondria;
• środowisko i historia rozwoju są kopiowane.

Owca i koza: podobieństwa oraz różnice

Oba gatunki:

• są małymi przeżuwaczami;
• mają łożysko synepitheliochorialne;
• tworzą placentomy z kotyledonów płodowych i karunkuł macicznego;
• mogą korzystać z oocytów z jajników poubojowych;
• wymagają synchronizacji cyklu biorczyń;
• wykazują późne straty związane z łożyskiem.

Różnią się jednak:

• sezonowością i odpowiedzią na stymulację;
• dostępnością materiału;
• tempem dojrzewania oocytu;
• preferowanymi mediami;
• reakcją na aktywację;
• praktyką transferu;
• rasą i masą biorczyń;
• wielkością miotu;
• dostępnością linii komórkowych.

Protokół „small ruminant” jest punktem wyjścia, nie gotową instrukcją.

Fizjologia rozrodu ustawia zegar procedury

Sezon nie jest tylko zmienną logistyczną

Owce i kozy wielu ras są sezonowo poliestralne. Długość dnia wpływa przez melatoninę na oś podwzgórze–przysadka–gonada. Poza sezonem zmieniają się:

• liczba dostępnych pęcherzyków;
• odpowiedź na gonadotropiny;
• jakość oocytów;
• łatwość synchronizacji;
• funkcja ciałka żółtego;
• dostępność naturalnie cyklicznych biorczyń.

Program hormonalny może wywołać lub zsynchronizować cykl, lecz nie usuwa pory roku jako źródła zmienności. Raport powinien podawać sezon, rasę i sposób synchronizacji.

Cykl i biorczyni

Typowy cykl rujowy owcy jest krótszy niż kozy, ale praktycznie liczy się rzeczywisty czas:

• wystąpienia rui;
• owulacji;
• powstania corpus luteum;
• rozpoczęcia progesterone support;
• stadium zarodka.

Różnica kilkunastu godzin między wiekiem zarodka a stanem endometrium może obniżyć implantation mimo dobrej blastocysty.

Biorczyni nie jest biernym inkubatorem. Jej wiek, parity, body condition, zdrowie macicy, metabolizm, stres i żywienie wpływają na wynik. Jeśli grupy zarodków trafiają do innych klas biorczyń, efekt protokołu jest confounded.

Ciąża i termin

Ciąża obu gatunków trwa w przybliżeniu pięć miesięcy, ale liczba płodów, rasa, płeć, masa i sposób powstania zarodka przesuwają termin. Zespół neonatalny powinien planować okno, nie jedną datę.

Od kilku komórek do rozpoznania ciąży

Major embryonic genome activation

Wczesne podziały korzystają z matczynych RNA i białek oocytu. U małych przeżuwaczy duża fala aktywacji genomu zarodkowego przypada około etapu 8–16 komórek.

To rozdziela:

• cleavage napędzane jeszcze zasobami oocytu;
• rozwój po ZGA wymagający uruchomienia genomu dawcy.

Metoda zwiększająca pierwszy podział, ale nie blastocystę i ciążę, mogła nie naprawić przeprogramowania.

Hatching, elongation i interferon tau

Po blastocyście conceptus opuszcza zona pellucida, zmienia kształt i gwałtownie się wydłuża. Trofoblast wydziela interferon tau, uczestniczący w maternal recognition of pregnancy i utrzymaniu środowiska progesteronowego.

Zbyt mały, spóźniony lub niezsynchronizowany conceptus może zostać utracony. Morfologia blastocysty w kropli nie testuje:

• elongation;
• sygnału do macicy;
• rozwoju allantois;
• utworzenia placentomów.

Implantacja

Choć łożysko małego przeżuwacza jest mniej inwazyjne niż ludzkie, wymaga:

• prawidłowego trophectoderm;
• adhezji;
• wyspecjalizowanych komórek binuclear;
• błon płodowych;
• naczyń;
• współpracy z karunkułami.

„Mniej inwazyjne” nie znaczy proste.

Źródło oocytów

Jajniki z rzeźni

Zalety:

• duża liczba;
• brak hormonalnego obciążenia żywych dawczyń;
• możliwość optymalizacji;
• niższy koszt.

Ograniczenia:

• nieznana historia zwierzęcia;
• zmienna faza cyklu;
• czas i temperatura transportu;
• sezon;
• heterogeniczna jakość pęcherzyków;
• brak dopasowania genetycznego do biorczyni.

Transport powinien utrzymać tkankę w zakresie ograniczającym niedokrwienie i szok termiczny, bez udawania warunków fizjologicznych przez zbyt długi czas.

Oocyte pick-up

Laparoscopic ovum pick-up albo aspiracja po stymulacji pozwala:

• znać dawczynię;
• kontrolować timing;
• uzyskać serie od wartościowego zwierzęcia;
• dopasować program.

Koszt obejmuje:

• hormony;
• sedację/anestezję;
• zabieg;
• powtórzenia;
• dobrostan;
• ograniczoną liczbę oocytów.

Oocyty dojrzewające in vivo

Mają bardziej fizjologiczną historię cytoplazmatyczną, lecz są trudniejsze do pozyskania i mniej liczne. Nie można porównywać ich wyników z IVM bez zaznaczenia źródła.

Selekcja kompleksu oocyt–cumulus

Ocena morfologiczna obejmuje:

• wielowarstwowy, zwarty cumulus;
• jednorodną ooplazmę;
• brak wyraźnej degeneracji;
• integralną zona pellucida;
• odpowiedni rozmiar pęcherzyka.

Morfologia nie mierzy bezpośrednio:

• mitochondrial function;
• zapasów RNA;
• spindle integrity;
• competence to reprogram.

Może wzbogacać pulę, ale nie zapewnia kompetencji.

Dojrzewanie in vitro

Oocyt przed enukleacją powinien osiągnąć metaphase II.

IVM obejmuje:

• medium;
• gonadotropiny;
• surowicę albo defined supplements;
• temperaturę;
• CO2;
• czas;
• gęstość;
• jakość cumulus.

Nuclear i cytoplasmic maturation

Wyrzucenie pierwszego ciałka kierunkowego wskazuje na nuclear maturation. Cytoplasmic maturation obejmuje:

• redystrybucję organelli;
• stan mitochondriów;
• czynniki przeprogramowujące;
• zapasy RNA i białek;
• kompetencję calcium response.

Oocyt może wyglądać jak MII, a nie wspierać prawidłowego rozwoju.

Timing

Za wczesna manipulacja:

• może trafić na niedojrzałe wrzeciono;
• zwiększyć aneuploidy;
• zmienić odpowiedź na aktywację.

Za późna:

• prowadzi do ageing;
• spontanicznej aktywacji;
• zaburzeń cytoszkieletu;
• gorszej jakości.

Zakres godzin musi być zwalidowany dla materiału i warunków.

Denudacja i ocena MII

Cumulus usuwa się mechanicznie i/lub enzymatycznie. Zbyt agresywna procedura może:

• uszkodzić zona;
• zmienić błonę;
• ogrzać lub wychłodzić oocyt;
• wydłużyć ekspozycję poza inkubatorem.

Pierwsze ciałko kierunkowe pomaga zlokalizować wrzeciono, ale nie zawsze dokładnie wskazuje jego położenie. Wrzeciono może się przesunąć.

Komórka dawcy

Źródła

U owiec i kóz stosowano:

• fibroblasty płodowe;
• fibroblasty skóry/ucha;
• komórki gruczołu mlekowego;
• cumulus;
• komórki transgeniczne;
• komórki od zwierząt dorosłych i padłych po wcześniejszym bankowaniu.

Dlaczego fibroblast

Fibroblasty:

• łatwo izolować;
• rosną w hodowli;
• można kriokonserwować;
• można poddać edycji;
• tworzą kolonie do genotypowania.

Nie oznacza to, że są zawsze najlepszym dawcą pod względem przeprogramowania.

Passage

Dłuższa hodowla zwiększa ryzyko:

• senescencji;
• aneuploidii;
• subklonalnej selekcji;
• zmian mitochondrialnych;
• epimutacji;
• utraty edytowanego allelu;
• kontaminacji.

Krytyczny jest nie tylko numer pasażu, ale:

• population doublings;
• confluency history;
• czas od rozmrożenia;
• medium;
• stres selekcyjny;
• karyotyp.

Tożsamość

Przed SCNT należy potwierdzić:

• gatunek;
• płeć;
• donor ID;
• genotype;
• brak mykoplazmy;
• stabilność;
• oczekiwaną modyfikację;
• brak niepożądanych zmian.

Po urodzeniu klonu potrzebne jest potwierdzenie nuclear genotype oraz odrębna analiza mtDNA.

Synchronizacja cyklu komórkowego

Oocyt MII ma wysoką aktywność MPF. Jądro w niewłaściwej fazie może przejść:

• przedwczesną kondensację chromosomów;
• nieprawidłową replikację;
• zmianę ploidii.

Najczęściej dąży się do G0/G1 przez:

• contact inhibition;
• serum starvation;
• wybór małych komórek;
• synchronizację farmakologiczną.

Serum starvation

Historycznie ważna dla Dolly, nie jest uniwersalnym wymaganiem. Może:

• zwiększać udział G0/G1;
• stresować komórki;
• zmieniać epigenom;
• indukować apoptosis.

Protokół powinien potwierdzić cell cycle distribution i viability zamiast opierać się na samym czasie głodzenia.

Enukleacja

Cel

Usunąć:

• maternal chromosomes;
• wrzeciono;
• możliwie mało cytoplazmy.

Metody

• aspiracja ciałka i przyległej cytoplazmy;
• barwienie DNA i UV;
• spindle imaging bez barwnika;
• enukleacja ślepa względem polar body.

Kompromisy

Barwienie/UV ułatwia potwierdzenie, ale może uszkadzać oocyt. Usunięcie dużej objętości zmniejsza zasób:

• mitochondriów;
• RNA;
• białek;
• organelli.

Fałszywa enukleacja prowadzi do nieprawidłowej ploidii.

QC

W osobnej próbce lub metodą nieinwazyjną ocenia się:

• skuteczność enukleacji;
• objętość usuniętą;
• czas manipulacji;
• lysis;
• warunki temperatury.

Wprowadzenie dawcy

Cell fusion

Całą komórkę umieszcza się w przestrzeni perywitelinowej i stosuje impuls elektryczny.

Impuls ma dwa cele:

• zbliżyć/fuzjować błony;
• czasem współuczestniczyć w aktywacji.

Zbyt słaby daje brak fuzji. Zbyt silny:

• lizę;
• uszkodzenie cytoplazmy;
• nieprawidłową aktywację.

Direct injection

Można wprowadzić jądro lub komórkę bezpośrednio. W małych przeżuwaczach dominowały protokoły fusion, ale wariant zależy od sprzętu i laboratorium.

Fusion rate

Raport powinien podać:

liczba fuzji / liczba par oocyt–komórka poddanych impulsowi

Nie należy usuwać z mianownika oocytów, które uległy lizie.

Reprogramming interval

Po wprowadzeniu dawcy często pozostawia się czas przed aktywacją, aby:

• nuclear envelope breakdown;
• ekspozycja chromatyny na cytoplazmę;
• kondensacja/remodeling;
• wymiana białek.

Zbyt krótki lub długi interwał zmienia:

• stan MPF;
• ageing oocytu;
• ploidalność;
• jakość aktywacji.

Aktywacja

Co zastępuje plemnik

Fizjologiczne zapłodnienie wywołuje serie calcium oscillations. SCNT musi sztucznie:

• podnieść Ca²⁺;
• wyłączyć MPF;
• uruchomić anaphase-like transition;
• pozwolić na pronucleus formation;
• rozpocząć cykl zarodkowy.

Schematy

Stosowano:

• impuls elektryczny;
• ionomycin;
• calcium ionophore;
• ethanol;
• inhibitory kinaz;
• 6-DMAP;
• cycloheximide.

Kombinacja i czas różnią się między laboratoriami.

Za mało i za dużo

Niepełna aktywacja:

• brak podziału;
• utrzymanie wysokiego MPF;
• nieprawidłowe pronuclei.

Nadmierna:

• toksyczność;
• zaburzony calcium pattern;
• nieprawidłowa ploidia;
• gorsza kompetencja.

Cleavage nie dowodzi prawidłowej aktywacji.

Hodowla zarodka

Warunki

• medium sekwencyjne albo ciągłe;
• temperatura;
• CO2/O2;
• wilgotność;
• gęstość;
• krople/olej;
• jakość gazów;
• lot medium;
• czas poza inkubatorem.

Niski tlen

Ograniczenie O2 może lepiej przypominać środowisko układu rozrodczego i zmniejszać oxidative stress, ale efekt zależy od systemu.

Cleavage

Oceniamy:

• czas pierwszego podziału;
• symetrię;
• fragmentację;
• tempo;
• arrest.

SCNT może wykazywać prawidłową morfologię mimo błędnej ekspresji.

Morula i blastocysta

Blastocyst rate:

blastocysty / zrekonstruowane i aktywowane oocyty

albo:

blastocysty / oocyty po skutecznej fuzji

Obie miary są poprawne, jeśli mianownik jest jawny. Nie są tożsame.

Quality

Można ocenić:

• total cell number;
• ICM/TE ratio;
• apoptosis;
• chromosomal integrity;
• gene expression;
• methylation;
• mitochondrial distribution.

Żaden pojedynczy marker nie gwarantuje żywego urodzenia.

Co można mierzyć przed transferem

Morphokinetics

Time-lapse może zapisać:

• czas pierwszego cleavage;
• odstępy między podziałami;
• direct i reverse cleavage;
• fragmentację;
• compaction;
• cavitation;
• expansion.

Model predykcyjny musi być zwalidowany dla gatunku, SCNT, systemu i dnia transferu. Kryteria opracowane dla IVF nie muszą działać dla rekonstrukcji.

Cell number i lineage allocation

Barwienie może oszacować total cell number, inner cell mass, trophectoderm i apoptosis. Jest zwykle destrukcyjne, więc ocenia zarodki siostrzane, nie transferowaną blastocystę.

Metabolizm

Można analizować zużycie tlenu, glucose, pyruvate, lactate, aminokwasy lub skład medium. Sygnał może oznaczać zarówno kompetencję, jak i stress. Biomarker wymaga niezależnej walidacji względem urodzenia.

Epigenom i transkryptom

Single-embryo assays pokazują heterogeniczność methylation, expression, chromatin accessibility, imprinting i X-linked expression. Największe ograniczenie to związek korelacyjny: badany zarodek jest niszczony, więc jego dalszego losu nie obserwujemy.

Trophectoderm ma znaczenie równorzędne ICM

Dla SCNT szczególnie ważne są:

• liczba i stan TE;
• geny interferon tau;
• zdolność elongation;
• program vascularization.

Selekcja skupiona tylko na ICM pomija przyszłe łożysko.

Interwencje poprawiające wynik

Proponowano inhibitory deacetylaz histonowych, modulację H3K9me3, mRNA czynników remodelujących, antioxidants, zmianę medium, wybór fazy dawcy i modyfikację aktywacji.

Hierarchia endpointów

1. zmiana markera;
2. lepsze cleavage;
3. więcej blastocyst;
4. lepsze utrzymanie ciąży;
5. więcej żywych urodzeń;
6. lepsze przeżycie;
7. brak nowych wad;
8. zdrowie i płodność.

Interwencja może przesunąć więcej zarodków do kolejnego etapu bez poprawy końca. Więcej blastocyst może dać tę samą liczbę odsadzeń, jeśli wzrosną późne straty.

Projekt porównania

Należy blokować dzień, pulę oocytów, operatora, linię dawcy i klasę biorczyń. Jeżeli eksperyment wykonano wiosną, a kontrolę jesienią, wynik łączy leczenie z sezonem.

Modyfikator epigenetyczny może wpływać nie tylko na blastocystę, lecz także na łożysko, germline i potomstwo. Brak widocznej wady przy urodzeniu nie kończy oceny.

Epigenetyczne punkty awarii

Jądro dawcy przychodzi z:

• DNA methylation;
• histone modifications;
• 3D chromatin;
• active/repressed domains;
• X-inactivation state;
• imprinting.

Oocyt musi usunąć część i ustanowić program zarodkowy.

Nieprawidłowości mogą dotyczyć:

• ZGA;
• H3K9me3;
• acetylacji;
• DNA methylation;
• imprinting;
• XIST;
• trophoblast genes.

Interwencje epigenetyczne mogą zwiększać blastocysty, lecz wymagają oceny:

• ciąży;
• łożyska;
• narodzin;
• zdrowia;
• off-target developmental effects.

Transfer zarodka

Stadium

Można transferować:

• wczesne zarodki do jajowodu;
• morule/blastocysty do macicy.

Stadium musi odpowiadać czasowi cyklu biorczyni.

Synchronizacja

Biorczyni powinna zapewniać:

• odpowiedni progesterone profile;
• endometrium we właściwym stadium;
• prawidłowe corpus luteum;
• brak choroby;
• stan żywieniowy.

Asynchrony może zniszczyć kompetentny zarodek.

Liczba zarodków

Transfer wielu zwiększa szansę, że biorczyni będzie ciężarna, ale:

• utrudnia mianowniki;
• zwiększa ciąże mnogie;
• zmienia konkurencję łożysk;
• zwiększa ryzyko dystocji;
• utrudnia przypisanie.

Rozpoznanie ciąży

Nie wystarczy jedna dodatnia ultrasonografia.

Punkty:

• wczesny sygnał;
• sac;
• heartbeat;
• utrzymanie w kolejnych terminach;
• wzrost;
• placentomy;
• płyny;
• termin.

Raport powinien odróżniać:

established pregnancy, ongoing pregnancy, delivery.

Łożysko małego przeżuwacza

Placentomy

Kotyledony płodowe łączą się z karunkułami matczynymi. Liczba, rozmiar, unaczynienie i dojrzałość placentomów wpływają na wymianę.

SCNT może prowadzić do:

• zmniejszonej liczby;
• kompensacyjnego powiększenia;
• słabego unaczynienia;
• nieprawidłowego trofoblastu;
• zaburzeń chorion–allantois;
• płynów i wzrostu.

W badaniach owczych obserwowano niedostateczny rozwój kotyledonów, zaburzenia vascularization i nieprawidłowości płodu mimo prawidłowego karyotypu dawcy.³

Dlaczego blastocysta nie przewiduje łożyska

Test in vitro obejmuje krótki etap. Trofoblast później musi:

• rozpoznać macicę;
• wydłużyć conceptus;
• sygnalizować ciążę;
• utworzyć błony;
• zbudować naczynia;
• różnicować binucleate cells;
• współpracować z karunkułami.

Mały błąd w programie może ujawnić się po tygodniach.

Monitorowanie ciąży

Program dla ciąży SCNT może obejmować:

• progesterone;
• seryjne USG;
• heart rate;
• growth;
• placentomes;
• amniotic/allantoic fluid;
• doppler;
• stan biorczyni;
• termin.

Nie każdy odchył ma znaną interwencję. Monitoring ma wspierać:

• decyzję o dalszej obserwacji;
• przygotowanie porodu;
• punkt humanitarny;
• analizę mechanizmu.

Utrata ciąży

Straty mogą wystąpić:

• przed rozpoznaniem;
• po implantation;
• w środku ciąży;
• późno;
• podczas porodu;
• neonatalnie.

Każdy okres sugeruje inne mechanizmy:

• kompetencja zarodka;
• maternal recognition;
• placenta;
• growth;
• dystocia;
• adaptation to breathing.

Łączenie ich w „pregnancy failed” usuwa informację.

Poród

Termin

SCNT może zmieniać długość ciąży. Plan obejmuje:

• spodziewane okno;
• oznaki porodu;
• threshold do interwencji;
• zespół;
• cesarskie cięcie;
• noworodkowy sprzęt.

Dystocja

Ryzyko rośnie przy:

• dużym płodzie;
• nieprawidłowym ułożeniu;
• ciąży mnogiej;
• obrzękach;
• zbyt małej biorczyni;
• słabej progresji.

Dobór biorczyni powinien uwzględniać rasę i rozmiar.

Noworodek

Ocena natychmiastowa:

• oddychanie;
• heart rate;
• temperatura;
• odruchy;
• masa;
• acid–base;
• glucose;
• saturacja;
• pępowina;
• wady;
• placenta.

Colostrum

Owce i kozy wymagają pobrania immunoglobulin z siary. Słabe ssanie albo opóźnienie zwiększa ryzyko zakażenia.

Typowe problemy

• respiratory distress;
• pulmonary hypertension;
• niedojrzałość;
• hypoglycemia;
• zaburzenia temperatury;
• anemia;
• kidney/liver dysfunction;
• infekcja;
• wady pępowiny;
• kontraktury.

Live-born nie znaczy healthy survivor.

Large offspring syndrome

U przeżuwaczy procedury in vitro, w tym SCNT, mogą wiązać się z abnormal offspring syndrome.

Obejmuje:

• zwiększoną masę;
• dłuższą ciążę;
• organomegalię;
• zaburzenia placenty;
• dystocję;
• śmiertelność.

Nie każdy klon jest duży, a nie każdy duży płód jest klonem. Przyczyny obejmują:

• culture;
• imprinting;
• donor cell;
• placenta;
• maternal environment.

Koza jako platforma biotechnologiczna

Pierwsze transgeniczne klony

W 1999 roku opisano żywe kozy uzyskane z płodowych komórek somatycznych niosących transgen. SCNT pozwolił wybrać linię komórkową przed stworzeniem zwierzęcia.⁴

Dlaczego mleko

Gruczoł mlekowy może produkować:

• przeciwciała;
• enzymy;
• białka terapeutyczne.

Strategia:

1. konstrukcja;
2. modyfikacja fibroblastów;
3. selekcja;
4. genotypowanie;
5. SCNT;
6. ciąża;
7. osiągnięcie dojrzałości;
8. laktacja;
9. oczyszczanie;
10. kontrola produktu.

SCNT jest tylko środkową częścią.

Edycja genomu

CRISPR/TALEN umożliwiły:

• knockout;
• knock-in;
• zmiany wielogenowe.

SCNT z wybranej kolonii pozwala:

• znać genotype przed transferem;
• ograniczyć founder mosaicism;
• powielić sprawdzony klon komórkowy.

Koszt to:

• hodowla i selekcja;
• utrata kompetencji;
• SCNT;
• dobrostan;
• ryzyko off-target;
• długa generacja.

W badaniach uzyskano żywe kozy z biallelicznymi zmianami po edycji fibroblastów i SCNT, pokazując zaletę kontroli genotypu przed urodzeniem.⁵

Oocyty poubojowe u kozy

Wykazano możliwość uzyskania klonowanych kóz z cumulus cells i długo hodowanych fibroblastów płodowych przy użyciu oocytów z jajników poubojowych.⁶

Znaczenie:

• rozdzielenie donor genotype od oocyte source;
• skalowanie materiału;
• wykorzystanie bankowanych linii.

Nie znaczy:

• stałej jakości;
• braku season effect;
• wysokiej efektywności każdego dawcy;
• wymienności ras.

Owca jako model biomedyczny

Owca jest użyteczna dla:

• rozmiaru narządów;
• ciąży i rozwoju płodowego;
• chorób metabolicznych;
• ortopedii;
• płuc;
• genetycznych chorób.

SCNT po edycji umożliwia stworzenie zwierzęcia o ustalonej zmianie. W badaniu biallelicznego knockout u owiec raportowano wszystkie etapy od reconstructed embryos przez blastocysty i biorczynie po żywe jagnięta, co pokazuje właściwy sposób publikacji mianowników.⁷

Klon nie jest tym samym zwierzęciem

Wspólny:

• nuclear genome w granicach mozaicyzmu;
• część wariantów komórki dawcy.

Inny:

• mtDNA oocytu;
• stan epigenetyczny;
• rozwój;
• macica;
• mikrobiom;
• doświadczenie;
• układ odporności;
• losowe rearrangements.

Klonowanie zachowuje genotyp jądrowy, nie zachowuje produktywności jako gwarancji.

Mitochondria

Większość mtDNA pochodzi z oocytu. Mała liczba mitochondriów dawcy może:

• zniknąć;
• utrzymać się jako heteroplasmy;
• zmienić udział między tkankami.

W analizach owiec SCNT potwierdzano zgodność DNA jądrowego z dawcą, a mtDNA zależne od oocytu i możliwą heteroplazmię.⁸

Dlatego pełne potwierdzenie pochodzenia obejmuje dwa genomy.

Zdrowie dorosłych klonów

Selekcja przeżywających

Największe ryzyko skupia się w:

• ciąży;
• porodzie;
• neonatologii.

Osobniki, które przeżyły, są wyselekcjonowaną grupą. Nie można oceniać ryzyka procedury tylko na zdrowiu dorosłych.

Długoterminowe badanie owiec

W badaniu 13 klonowanych owiec w wieku 7–9 lat nie stwierdzono klinicznych oznak chorób metabolicznych, nadciśnienia ani systematycznie ciężkiej choroby zwyrodnieniowej przypisywanej SCNT. Autorzy zaznaczyli ograniczenia, w tym brak idealnych równoczesnych kontroli.⁹

Wniosek:

• SCNT nie powoduje automatycznie przyspieszonego starzenia każdego survivor;
• nie usuwa to ryzyka prenatalnego;
• mała kohorta nie wykrywa rzadkich efektów;
• potrzebne są kontrolowane dane lifetime.

Dolly

Dolly rozwinęła chorobę płuc i została poddana eutanazji w wieku około 6,5 roku. Pojedynczy przypadek nie pozwala przypisać przyczyny SCNT.

Nie powinno się mówić:

• „Dolly umarła, bo była klonem”;
• „Dolly dowiodła przedwczesnego starzenia”.

Krótsze telomery w części tkanek były interesujące, lecz telomery nie są pełnym zegarem organizmu.

Płodność

Zdrowe klony owiec i kóz mogą rozmnażać się płciowo.

Potomstwo płciowe:

• otrzymuje połowę genomu klonu;
• przechodzi gametogenezę;
• ma normalnie rekombinowane allele;
• nie jest klonem dawcy somatycznego.

Ocena płodności obejmuje:

• puberty;
• semen/oocytes;
• conception;
• ciąże;
• zdrowe potomstwo.

Jedna ciąża nie opisuje lifetime reproductive performance.

Zastosowanie hodowlane

SCNT może odzyskać genotyp:

• elitarnego tryka/kozła;
• zwierzęcia po utracie płodności;
• linii po bankowaniu komórek;
• osobnika poddanego edycji.

Nie zastępuje:

• selekcji populacyjnej;
• różnorodności;
• oceny breeding value;
• kontroli chorób;
• żywienia;
• środowiska.

Powielenie jednego genotypu zmniejsza różnorodność, jeśli jest nadużywane.

Bank komórek

Próbka do przyszłego SCNT powinna mieć:

• pewny donor ID;
• zgodę/własność;
• tkankę pobraną aseptycznie;
• żywe komórki;
• kontrolę mykoplazmy;
• genotype;
• krioporcje;
• chain of custody;
• storage monitoring;
• plan awarii.

Samo DNA:

• nie daje żywego jądra;
• nie zachowuje chromatyny i organelli;
• nie wystarcza do standardowego SCNT.

System jakości banku i programu SCNT

Master i working cell bank

Przy seryjnych eksperymentach warto rozdzielić:

• master cell bank — dobrze scharakteryzowany i rzadko rozmrażany;
• working cell bank — materiał do bieżących sesji.

Zmniejsza to liczbę pasaży, drift i ryzyko utraty unikalnej linii.

Cryovial identity

Etykieta musi przetrwać ciekły azot, kondensację i transport. Minimalne pola obejmują donor, line, passage/population doublings, datę, vial, operatora i status QC.

Release komórek

Kryteria mogą obejmować:

• viability i morphology;
• mycoplasma negative;
• species/authentication;
• karyotype;
• genotype;
• sterility;
• cell-cycle strategy;
• brak cross-contamination.

Oocyte batch

Partię opisują źródło, czas i temperatura transportu, liczba i klasy COC, system IVM, MII rate oraz liczba oocytów uszkodzonych.

Session record

Zapis czasu każdego etapu pozwala wykryć:

• wydłużenie ekspozycji poza inkubatorem;
• pogorszenie w końcowej części sesji;
• efekt operatora;
• różnicę między mikromanipulatorami;
• efekt kolejności.

Dobrostan i bilans zwierząt

Pełny bilans obejmuje:

• dawczynie oocytów;
• zwierzęta dające tkankę;
• biorczynie;
• płody;
• martwe urodzenia;
• żywe noworodki;
• rearing;
• zwierzęta wycofane z protokołu.

Dawczynie

Ryzyka:

• stymulacja;
• zabieg;
• infekcja;
• zrosty;
• wielokrotne procedury.

Biorczynie

Ryzyka:

• hormony;
• zabieg transferu;
• utrata ciąży;
• hydrops;
• dystocja;
• cesarskie cięcie;
• utrata płodu;
• powikłania poporodowe.

Punkty humanitarne

Powinny określać:

• ciężki distress;
• brak wzrostu;
• nieodwracalną niewydolność;
• zaburzenia ruchu;
• brak ssania mimo wsparcia;
• krytyczne parametry biorczyni.

Jak czytać tabelę wyników SCNT

Minimalne kolumny:

Etap	Liczba	Mianownik	Uwagi
Oocyty zebrane	N	wszystkie	źródło
MII	N	zebrane	kryterium
Enukleowane	N	MII	potwierdzenie
Zrekonstruowane	N	enukleowane	metoda
Skuteczna fuzja	N	poddane fuzji	lysis
Cleavage	N	aktywowane	dzień
Blastocysty	N	aktywowane/fused	dzień/grade
Transferowane	N	blastocysty/zarodki	liczba per recipient
Biorczynie	N	—	synchrony
Ciąże	N	biorczynie	dzień diagnozy
Urodzenia	N	transferowane/biorczynie	live/still
Przeżycie	N	live-born	dzień 1/7/weaning

Przykład czterech różnych procentów

Załóżmy:

• 500 oocytów;
• 350 rekonstrukcji;
• 280 fuzji;
• 70 blastocyst;
• 50 transferowanych do 25 biorczyń;
• 8 ciąż;
• 3 żywe urodzenia;
• 2 zwierzęta przy odsadzeniu.

Można policzyć:

• blastocyst/fused: 70/280 = 25%;
• pregnancy/recipient: 8/25 = 32%;
• live birth/transferred: 3/50 = 6%;
• weaned/reconstructed: 2/350 = 0,57%.

Wszystkie są prawdziwe, ale odpowiadają na inne pytania.

Statystyka procesu wielopoziomowego

Oocyt nie zawsze jest niezależnym n

Oocyty z tej samej dawczyni, partii jajników, kropli IVM albo sesji mikromanipulacji dzielą czynniki. Traktowanie 500 oocytów jako 500 całkowicie niezależnych obserwacji może zawęzić niepewność porównania mediów.

Zarodki w jednej biorczyni

Dwa zarodki transferowane do tej samej macicy dzielą progesterone, żywienie, chorobę, odporność i środowisko. Nie są dwiema niezależnymi ciążami. Analiza powinna uwzględniać clustering na recipient.

Donor line effect

Jedna linia może dawać dużo blastocyst, a mało ciąż albo specyficzne wady. Porównanie „owca versus koza” oparte na jednej linii każdego gatunku nie rozdziela species od line.

Małe liczby

Jedno urodzenie z 10 transferów i dwa z 10 dają 10% oraz 20%, lecz przedziały są szerokie. Ranking bez niepewności łatwo przecenia różnicę.

Censoring i follow-up

Jeżeli obserwacja kończy się w 24 godzinie, endpointem nie jest survival to weaning. Zwierzę utracone z follow-up nie jest automatycznie zdrowe ani chore. Raport musi wskazać liczbę ocenionych w każdym terminie.

Macierz porównania protokołów

Element	Wariant A	Wariant B	Co trzeba kontrolować
Oocyt	poubojowy IVM	OPU/IVM	kryterium MII
Dawca	fibroblast płodowy	fibroblast dorosły	QC i faza
Wprowadzenie	fusion	injection	enukleacja
Aktywacja	pulse + inhibitor	ionophore + inhibitor	czas i endpoint
Culture	niski O2	atmosfera	medium i grading
Transfer	wczesny	blastocysta	synchrony
Wynik	blastocyst	live birth	pełny lejek

Tabela nie wybiera zwycięzcy. Ujawnia, ile cech zmieniono jednocześnie.

Punkty krytyczne procesu

Przed SCNT

• jakość oocytu;
• czas transportu;
• IVM;
• zdrowie linii dawcy;
• cell cycle;
• tożsamość.

Mikromanipulacja

• temperatura;
• enukleacja;
• strata cytoplazmy;
• fusion;
• czas.

Po rekonstrukcji

• aktywacja;
• ploidia;
• ZGA;
• culture.

Po transferze

• synchrony;
• maternal recognition;
• placenta;
• wzrost;
• poród;
• neonatal adaptation.

Minimalny rekord laboratoryjny

• donor ID i tissue;
• cell line/passage/population doublings;
• genotype/karyotype/mycoplasma;
• oocyte source;
• collection/transport;
• IVM batch;
• MII criteria;
• enucleation;
• fusion settings;
• activation;
• culture;
• embryo ID/grade;
• recipient ID;
• synchrony;
• transfer;
• pregnancy timeline;
• placenta;
• birth;
• health;
• genotype/mtDNA;
• wszystkie mianowniki.

Jak porównywać owcę i kozę

Porównanie powinno dopasować:

• oocyte source;
• donor cell type;
• fresh/frozen;
• passage;
• fusion;
• activation;
• culture;
• embryo stage;
• embryos per recipient;
• season;
• breed;
• endpoint.

Bez tego różnica „gatunkowa” może być różnicą protokołu.

Najczęstsze błędy interpretacyjne

„Dolly powstała za 277. razem”

To skrót. 277 opisuje określone rekonstrukcje w grupie komórek dorosłych, a proces zawierał selekcję i transfer 29 zarodków.

„Koza jest łatwa, bo ma mioty”

Miot nie usuwa strat, a wiele zarodków na biorczynię komplikuje denominator.

„Zdrowy dorosły klon dowodzi bezpieczeństwa”

Nie obejmuje wszystkich zarodków, biorczyń i noworodków.

„Komórka płodowa nie jest somatyczna”

Fibroblast płodowy jest somatyczny, choć jego epigenom i historia różnią się od komórki dorosłej.

„Transgen jest w każdej komórce, więc produkt jest prawidłowy”

Trzeba ocenić:

• integration;
• copy number;
• expression;
• tissue specificity;
• produkt;
• zdrowie.

„SCNT kopiuje mleczność”

Kopiuje nuclear genotype w przybliżeniu. Mleczność zależy także od:

• epigenomu;
• żywienia;
• ciąży;
• zdrowia wymienia;
• laktacji;
• zarządzania.

Checklista projektu

• [ ] Cel uzasadnia SCNT.
• [ ] Mianownik końcowy jest ustalony.
• [ ] Źródło oocytów jest jawne.
• [ ] IVM ma kryteria.
• [ ] Linia dawcy ma pełny QC.
• [ ] Cell cycle jest mierzony albo uzasadniony.
• [ ] Enukleacja ma kontrolę.
• [ ] Fusion/activation mają zakres.
• [ ] Culture ma kontrolę partii i gazów.
• [ ] Biorczynie są zsynchronizowane.
• [ ] Monitoring obejmuje łożysko.
• [ ] Neonatologia jest gotowa przed transferem.
• [ ] Wszystkie zwierzęta są w bilansie dobrostanu.
• [ ] Genotype i mtDNA są sprawdzane.
• [ ] Health follow-up ma harmonogram.

Checklista publikacji

• [ ] Liczba oocytów i źródło.
• [ ] Liczba rekonstrukcji.
• [ ] Fuzje i lysis.
• [ ] Cleavage i blastocysty.
• [ ] Transferowane zarodki.
• [ ] Liczba biorczyń.
• [ ] Stadium i liczba na biorczynię.
• [ ] Ciąże w kilku terminach.
• [ ] Straty i przyczyny.
• [ ] Live/stillbirth.
• [ ] Przeżycie co najmniej do odsadzenia.
• [ ] Wady i leczenie.
• [ ] Placenta.
• [ ] Potwierdzenie pochodzenia.
• [ ] Nieudane serie.

Wniosek

Owca pokazała, że jądro dorosłej komórki może zostać cofnięte do programu rozwojowego całego organizmu. Koza pokazała praktyczną wartość połączenia bankowanej lub zmodyfikowanej linii z produkcją żywego zwierzęcia.

Najtrudniejsze nie jest jednak samo przeniesienie jądra. Trudne jest uzyskanie ciągłości:

dobry oocyt → zgodny cykl → pełne przeprogramowanie → prawidłowy trofoblast → wydolne łożysko → bezpieczny poród → zdrowy dorosły

Każdy artykuł i każda oferta technologiczna, która pomija środkowe mianowniki, pokazuje tylko wybrany fragment procesu.