PCR, elektroforeza kapilarna i sekwencjonowanie w genetyce sądowej

Streszczenie

PCR, elektroforeza kapilarna i sekwencjonowanie nie są trzema konkurencyjnymi nazwami tego samego badania. PCR wybiera i powiela określone cele. Elektroforeza kapilarna rozdziela znakowane produkty głównie według rozmiaru i przedstawia je jako piki. Sekwencjonowanie odczytuje kolejność zasad; może rozróżnić fragmenty tej samej długości, ale wprowadza własne etapy przygotowania biblioteki, indeksowania, mapowania i wywoływania wariantów.

W standardowym profilowaniu STR sygnał zależy od liczby cząsteczek wejściowych, wydajności primerów, konkurencji w multiplexie, liczby cykli, inhibitorów, migracji w polimerze, rozdziału widm barwników oraz reguł interpretacji. Pik nie jest bezpośrednim obrazem jednej cząsteczki DNA. Jest zbiorczym sygnałem wielu produktów powstałych po reakcji wykładniczej.

Masowe sekwencjonowanie równoległe może odczytać sekwencje STR, SNP, Y-STR i mtDNA w jednym przebiegu, ale wspólny instrument nie daje wspólnego modelu statystycznego. Głębokość odczytu nie jest prostym odpowiednikiem wysokości piku i nie mówi automatycznie, ile komórek wniosło allel. Walidacja musi objąć cały pipeline: od próbki, przez bibliotekę i urządzenie, po wersję oprogramowania, referencji i bazę alleli.

Najbezpieczniejszy sposób czytania wyniku to rozdzielenie czterech warstw: cząsteczki wejściowe, produkty amplifikacji, sygnał urządzenia i decyzja analityczna. Artefakt może powstać w każdej z nich.

Jedna próbka, kilka produktów informacji

Po ekstrakcji laboratorium ma roztwór zawierający część DNA odzyskanego ze śladu. Z tej samej próbki można wykonać:

• qPCR do oszacowania ilości, degradacji i inhibicji;
• endpoint multiplex PCR autosomalnych STR;
• Y-STR;
• amplifikację regionów mtDNA do sekwencjonowania;
• bibliotekę wielu SNP;
• sekwencjonowanie STR i SNP w jednym panelu;
• badanie powtórne lub potwierdzające.

Każda operacja zużywa aliquot. Nie są to idealnie identyczne kopie próbki. Przy małej liczbie cząsteczek dwa pobrania z tej samej probówki mogą zawierać inny zestaw alleli. Przed rozdzieleniem warto znać objętość, stężenie, minimalną objętość pipetowania i priorytet pytań.

qPCR nie „widzi” dokładnie tych samych locus co późniejszy panel. Wynik ilościowy jest predyktorem, nie gwarancją profilu. Sekwencjonowanie ma również własne primery i może utracić locus, który działa w zestawie CE.

PCR jako selektywne kopiowanie

Polymerase chain reaction wymaga:

• matrycy DNA;
• dwóch starterów ograniczających cel;
• termostabilnej polimerazy;
• deoksynukleotydów;
• jonów i buforu;
• cykli temperatury.

W uproszczeniu każdy cykl zawiera:

1. denaturację dwuniciowego DNA;
2. annealing starterów;
3. wydłużenie nowych nici.

Idealne podwojenie w każdym cyklu jest modelem, nie opisem rzeczywistej reakcji. Wydajność spada przez zużycie składników, konkurencję produktów, reannealing, inhibitory i osiągnięcie plateau. Po końcowym PCR liczba produktów nie jest prostym licznikiem pierwotnych cząsteczek.

Wykładnicze wzmocnienie sprawia, że assay jest czuły. To samo wzmocnienie powiększa konsekwencje:

• pojedynczego kontaminantu;
• błędu polimerazy;
• losowego braku allelu na początku;
• niewielkiej różnicy wydajności starterów;
• produktu nieswoistego.

Starter definiuje zakres obserwacji

Starter nie jest neutralnym uchwytem. Określa:

• locus;
• granice amplikonu;
• długość produktu;
• podatność na degradację;
• warianty, które znajdą się w odczycie;
• ryzyko amplifikacji podobnego regionu;
• zgodność ze starszym profilem.

Wariant pod miejscem wiązania startera może obniżyć albo zablokować amplifikację jednego allelu. Powstaje allele dropout albo pozorna homozygotyczność. Alternatywny zestaw starterów może odzyskać sygnał.

W STR sekwencjonowanym zakres raportowalny nie musi obejmować pełnego amplikonu. Laboratorium może wiarygodnie czytać powtórzenie, ale nie wszystkie flanki. Nazwa allelu powinna odpowiadać dokładnie zakresowi, który assay i pipeline zwalidowały.

Multiplex to negocjacja między reakcjami

W multiplex PCR wiele par starterów działa w jednej probówce. Oszczędza próbkę i czas, ale cele konkurują o:

• polimerazę;
• nukleotydy;
• jony;
• przestrzeń temperaturową annealingu;
• zakres detekcji;
• kanały barwne i rozmiary.

Projekt zestawu dobiera stężenia starterów i długości produktów tak, aby zrównoważyć loci. Zmiana pojedynczego startera może zmienić inne cele. Dlatego domowa modyfikacja komercyjnego zestawu wymaga walidacji systemu, nie tylko sprawdzenia nowej pary.

Przy degradacji krótsze produkty bywają względnie silniejsze od dłuższych. „Ski slope” profilu może być zgodny z fragmentacją, ale podobny obraz mogą powodować niektóre inhibitory, nierównowaga multiplexu albo przeładowanie. Interpretacja korzysta z qPCR, kontroli i powtarzalności między loci.

qPCR i endpoint PCR mierzą co innego

W qPCR wzrost produktu monitoruje się w fazie wykładniczej przez fluorescencję. Punkt przecięcia z ustalonym poziomem porównuje się ze standardami albo kalibratorem. W endpoint PCR wynik obserwuje się po zakończeniu cykli, często już w plateau.

qPCR może dostarczyć:

• oszacowanie koncentracji ludzkiego DNA;
• stosunek celu długiego do krótkiego;
• opóźnienie kontroli wewnętrznej wskazujące inhibicję;
• ilość składnika męskiego w wybranym assay.

Nie daje bezpośrednio:

• profilu STR;
• liczby dawców;
• rozkładu alleli;
• pewności, że wszystkie loci zadziałają;
• rozróżnienia każdej matrycy ludzkiej od kontaminacji.

Standardy ilościowe, zakres krzywej, liczba powtórzeń, objętość i sposób traktowania wyników poza zakresem są częścią walidacji.

Liczba kopii i efekt stochastyczny

Stężenie masowe można przybliżyć do liczby równoważników genomu, ale przeliczenie ma założenia o masie genomu, ploidalności i integralności. W próbce zdegradowanej „jeden genom” nie musi oznaczać jednej ciągłej kopii każdego locus.

Przy małej liczbie cząsteczek:

• jeden allel heterozygoty może trafić do reakcji częściej;
• drugi może nie trafić wcale;
• allele balance staje się zmienne;
• stutter może konkurować z niskim allelem;
• kontaminant ma relatywnie większy udział;
• replikaty różnią się.

Zwiększenie liczby cykli może podnieść sygnał, ale nie odtworzy cząsteczki, której nie było w aliquocie. Zwiększa też widoczność artefaktów i kontaminacji. „Low template” jest właściwością całego wejścia i procesu, nie liczbą cykli samą w sobie.

Inhibitory

Polimeraza może być hamowana przez składniki krwi, gleby, tkanin, barwników, klejów, środków czyszczących i materiałów budowlanych. Skutek zależy od enzymu, stężenia inhibitora, objętości ekstraktu i locus.

Możliwe działania:

• rozcieńczenie;
• dodatkowe oczyszczenie;
• mniejsza objętość wejścia;
• polimeraza bardziej odporna;
• dodatek wspomagający;
• alternatywny assay;
• uznanie próbki za nieodpowiednią.

Każde działanie ma koszt. Rozcieńczenie zmniejsza inhibitor i liczbę kopii. Oczyszczanie może stracić DNA. Zmiana enzymu zmienia zwalidowany system. Decyzja opiera się na danych, nie na kolejnych próbach do uzyskania oczekiwanego wyniku.

Kontrole PCR

Kontrola dodatnia zawiera znany profil. Sprawdza, czy zestaw, termocykler, detekcja i analiza odtworzyły oczekiwany wynik w dopuszczalnych granicach.

Kontrola ujemna amplifikacji zawiera mieszaninę reakcyjną bez celowo dodanej matrycy. Monitoruje DNA w odczynnikach i na etapie przygotowania PCR.

Blank ekstrakcyjny zaczyna wcześniej i przechodzi ekstrakcję. Może ujawnić źródło niewidoczne w samej kontroli PCR.

Kontrola dodatnia nie powinna być tak skoncentrowana, aby stawała się głównym źródłem kontaminacji. Przechowuje się ją, przygotowuje i dodaje według przepływu minimalizującego kontakt z próbkami.

Fluorescencyjne znakowanie STR

W zestawach CE jeden starter z pary jest znakowany fluoroforem. Produkty o różnych loci można odróżnić przez:

• zakres długości;
• kanał barwny;
• kombinację obu.

Kilka loci może mieć produkty tego samego rozmiaru, jeśli mają inne barwniki. Kilka loci w jednym barwniku zajmuje rozłączne okna długości. Projekt multiplexu jest więc mapą dwuwymiarową.

Barwniki mają nakładające się widma emisji. Instrument mierzy sygnał w kilku zakresach i matematycznie rozdziela wkład barwników. Ta spectral deconvolution wymaga poprawnej kalibracji dla zestawu barwników i urządzenia.

Elektroforeza kapilarna

Kapilara jest wypełniona polimerem przesiewającym. DNA ma ujemny ładunek fosforanów i w polu elektrycznym migruje w kierunku elektrody dodatniej. Krótsze fragmenty przemieszczają się przez matrycę efektywniej niż dłuższe.

Proces obejmuje:

1. mieszaninę produktu z formamidem i wewnętrznym standardem wielkości;
2. denaturację;
3. elektrokinetyczne wprowadzenie do kapilary;
4. migrację w polimerze;
5. wzbudzenie fluoroforu laserem;
6. rejestrację emisji;
7. rozdział widm;
8. przeliczenie czasu migracji na rozmiar;
9. przypisanie piku do binu allelu.

NIST opisuje CE jako system wymagający kontroli przygotowania próbki, iniekcji, rozdziału, detekcji i interpretacji, a nie tylko końcowego wykresu.¹

Iniekcja nie jest pipetowaniem określonej liczby kopii

W iniekcji elektrokinetycznej ilość produktu wprowadzonego do kapilary zależy od napięcia, czasu, przewodnictwa i składu próbki. Sól oraz inne jony konkurują o prąd. Dwie próbki o podobnym stężeniu produktu mogą dać różny sygnał.

Zwiększenie czasu lub napięcia iniekcji może podnieść piki słabej próbki, ale również:

• przeładować silne allele;
• zwiększyć pull-up;
• podnieść szum;
• uwidocznić kontaminację;
• poszerzyć piki;
• zmienić porównywalność z walidacją.

„Ponowna iniekcja” nie jest tym samym co ponowna amplifikacja. Bada ten sam produkt PCR innym ustawieniem detekcji. Pomaga odróżnić problem detekcji od problemu amplifikacji, ale nie tworzy nowych alleli.

Standard wielkości i drabina alleliczna

Wewnętrzny standard zawiera fragmenty o znanych rozmiarach w osobnym kanale. Jest obecny w każdym wstrzyknięciu i pozwala przeliczyć lokalną migrację.

Drabina alleliczna zawiera reprezentatywne allele loci panelu. Biegnie jako osobna próbka i tworzy odniesienie dla binów. Allel próbki przypisuje się według relacji do drabiny, a nie wyłącznie z nominalnej liczby par zasad.

Awaria standardu może uniemożliwić sizing konkretnej kapilary. Drabina poza kryteriami może wpływać na serię. Walidacja ustala dopuszczalny odstęp czasowy, jakość dopasowania i reakcję na przesunięcie.

Materiały odniesienia NIST z certyfikowanymi genotypami pomagają zapewnić spójność oznaczeń między zestawami i laboratoriami; sekwencjonowanie ujawniło również warianty powtórzeń i flank niewidoczne w samym rozmiarze.²

Od fluorescencji do RFU

Wysokość piku w relative fluorescence units zależy od:

• liczby znakowanych produktów;
• efektywności wzbudzenia i detekcji;
• fluoroforu;
• ustawień instrumentu;
• iniekcji;
• nasycenia detektora;
• sposobu korekcji linii bazowej.

RFU nie jest liczbą cząsteczek wejściowych. W obrębie zwalidowanego zakresu można modelować zależność piku od ilości produktu, ale nie wolno traktować 1000 RFU jako uniwersalnej masy DNA.

Porównywanie wysokości między barwnikami i instrumentami wymaga ostrożności. Każdy kanał ma inną charakterystykę, a normalizacja jest częścią systemu.

Próg analityczny

Analytical threshold ma rozdzielić sygnał możliwy do wiarygodnego odróżnienia od szumu. Ustala się go z danych blanków, linii bazowej, instrumentów, barwników i sposobu analizy.

Próg:

• nie jest wartością fabryczną ważną dla każdego laboratorium;
• nie oznacza, że każdy pik powyżej jest allelem;
• nie oznacza, że poniżej nie ma DNA;
• nie rozwiązuje stutter ani pull-up;
• może być specyficzny dla kanału lub instrumentu;
• wymaga okresowej weryfikacji.

Jeśli analityk obniża próg po zobaczeniu profilu odniesienia, wprowadza bias. Kryteria muszą być zdefiniowane przed porównaniem.

Próg stochastyczny

Stochastic threshold historycznie wyznaczał wysokość, powyżej której obserwacja jednego allelu miała wspierać założenie, że drugi allel heterozygoty nie wypadł. Jest związany z badaniami czułości i allele balance.

Nie jest to magiczna granica:

• dropout może zależeć od całego profilu;
• wysokości są współzależne;
• degradacja zmienia loci;
• mieszaniny mają różnych dawców;
• probabilistyczne genotypowanie modeluje dropout ciągle.

W modelach półciągłych i ciągłych rola pojedynczego progu może być inna, ale dane walidacyjne o dropout nadal są konieczne.

Stutter

Stutter powstaje przez poślizg polimerazy w powtórzeniu. Najczęstszy jest n−1, ale występują n+1, n−2 i inne. Jego względna wysokość zależy od locus, allelu i systemu.

W CE stutter ma przewidywaną pozycję rozmiarową. W sekwencjonowaniu można ponadto rozróżnić warianty sekwencji, ale PCR stutter nadal istnieje. MPS nie usuwa go; zmienia sposób obserwacji.

Próg stutter z walidacji może klasyfikować typowe piki pojedynczego źródła. W mieszaninie pik w pozycji stutter może zawierać prawdziwy allel. Nowoczesny model uwzględnia oba wkłady zamiast kasować dane.

Pull-up i nasycenie

Gdy sygnał jednego barwnika jest silny albo kalibracja widmowa niedoskonała, część może pojawić się w innym kanale w podobnym czasie migracji. To pull-up.

Cechy:

• zgodność położenia z silnym pikiem;
• obecność w kilku kanałach;
• wysokość zależna od macierzystego sygnału;
• częstsze występowanie przy przeładowaniu;
• możliwy kształt nietypowy dla allelu.

Nasycenie detektora może spłaszczyć pik i pogorszyć korekcję widm. Rozcieńczenie produktu lub krótsza iniekcja może potwierdzić mechanizm. Nie usuwa się piku tylko dlatego, że koliduje z oczekiwaną mieszaniną.

Niepełna adenylacja

Wiele polimeraz dodaje końcową adeninę do produktu PCR. Jeśli proces jest niepełny, część produktów pozostaje o jedną zasadę krótsza. Powstaje split peak −A.

Przyczyny mogą obejmować:

• niedostateczną końcową inkubację;
• sekwencję końca;
• nadmiar produktu;
• warunki reakcji;
• określony primer.

Artefakt jest przesunięty o jedną zasadę, a nie o jednostkę powtórzenia. Stabilna adenylacja jest elementem projektu i walidacji zestawu.

Spike, dye blob, shoulder i szum

Spike jest zwykle wąskim zjawiskiem elektronicznym widocznym w wielu kanałach w tym samym punkcie.

Dye blob pochodzi z wolnego lub zdegradowanego barwnika i może tworzyć szeroki pik w charakterystycznym zakresie.

Shoulder może wynikać z rozdziału produktów, nasycenia albo heterodupleksu.

Podniesiona linia bazowa może mieć źródło optyczne, chemiczne lub elektryczne.

Klasyfikację opiera się na kształcie, kanałach, pozycji, kontroli i zachowaniu przy reiniekcji. „Dziwny pik” nie jest kategorią raportową.

Allel poza drabiną i microvariant

Off-ladder allele leży poza zdefiniowanymi binami albo między nimi. Może być:

• prawdziwym rzadkim allelem;
• microvariantem z niepełną jednostką;
• wariantem flanki zmieniającym długość;
• produktem nieswoistym;
• artefaktem;
• skutkiem nieprawidłowego sizingu.

Potwierdzenie może wymagać powtórzenia, alternatywnego zestawu, sekwencjonowania albo odniesienia do bazy wariantów. Nie zaokrągla się automatycznie do najbliższego pełnego allelu.

Dane surowe i analiza CE

Pipeline CE wykonuje:

• spectral separation;
• korekcję linii bazowej;
• detekcję pików;
• sizing;
• przypisanie panelu i binu;
• flagowanie jakości;
• eksport genotypu.

Analityk powinien móc przejść od wywołanego allelu do sygnału surowego i parametrów. Zmiana panelu, binów, progu albo wersji oprogramowania może zmienić wynik bez ponownego uruchomienia instrumentu.

Plik elektroniczny, log instrumentu i plik analizy są częścią rekordu. Zrzut ekranu nie zachowuje wszystkiego.

Sekwencjonowanie Sangera

Sanger wykorzystuje terminujące dideoksynukleotydy znakowane fluoroforami. Powstaje rodzina fragmentów zakończonych na kolejnych pozycjach, rozdzielana w kapilarze. Kolejność barw daje chromatogram sekwencji.

Mocne strony:

• wysoka jakość pojedynczego, względnie czystego amplikonu;
• długie odczyty w porównaniu z częścią platform MPS;
• rola potwierdzająca;
• historycznie rozwinięte zastosowanie mtDNA.

Ograniczenia:

• mieszaniny są trudne;
• mniejsza przepustowość;
• niski wariant może ginąć pod głównym;
• heteroplazmia wymaga progów i obu kierunków;
• każdy region wymaga osobnej reakcji lub zestawu.

Sanger nadal może potwierdzić wariant flanki albo nietypowy STR, ale nie zawsze jest niezależny, jeśli używa tych samych primerów.

Masowe sekwencjonowanie równoległe

MPS odczytuje wiele cząsteczek równolegle. W panelu sądowym zwykle nie sekwencjonuje się całego genomu. Wzbogaca się setki wybranych celów przez multiplex PCR albo hybrydyzację.

Pipeline:

1. kwalifikacja DNA;
2. amplifikacja lub fragmentacja;
3. dołączenie adapterów;
4. dołączenie indeksów próbek;
5. oczyszczenie i normalizacja bibliotek;
6. pooling;
7. tworzenie klastrów lub innego sygnału platformy;
8. sekwencjonowanie;
9. demultipleksowanie;
10. kontrola jakości;
11. mapowanie albo dopasowanie do alleli;
12. wywołanie profilu;
13. interpretacja.

Każdy krok może zmienić proporcje. Liczba reads to liczba odczytów produktów biblioteki, nie bezpośrednia liczba pierwotnych komórek.

Indeksy i pomyłka przypisania

Indeks jest sekwencyjnym kodem próbki. Po połączeniu bibliotek urządzenie czyta indeks i przypisuje reads. Problemy obejmują:

• pomyłkę indeksu podczas pipetowania;
• index hopping lub misassignment;
• odczyt niskiej jakości;
• niedozwoloną kombinację indeksów;
• carry-over z wcześniejszego run;
• kontaminację biblioteki.

Dual indexing pozwala sprawdzić dwie etykiety. Unikalne kombinacje ograniczają błędne przypisanie. Kontrole ujemne prowadzi się przez bibliotekę i run, a nie tylko przez PCR.

Głębokość i pokrycie

Depth mówi, ile odczytów obejmuje pozycję lub allel. Breadth mówi, jaka część celu ma wystarczające pokrycie. Uniformity opisuje równomierność między celami.

Wysoka średnia głębokość może ukryć:

• locus z zerowym pokryciem;
• przewagę kilku nadmiernie amplifikowanych celów;
• reads zduplikowane z jednej cząsteczki;
• bias alleliczny;
• błędne mapowanie;
• niską jakość końców.

Kryteria ustala się per locus i typ markera. mtDNA może mieć ogromną głębokość względem jądrowych SNP, lecz inny próg heteroplazmii.

Allele balance w odczytach

Dla heterozygotycznego SNP oczekuje się obu alleli, ale proporcja nie musi wynosić dokładnie 50:50. Wpływają na nią:

• sampling cząsteczek;
• bias primerów;
• wariant w miejscu wiązania;
• różna wydajność sekwencji;
• błędy mapowania;
• duplikaty;
• mieszanina;
• mozaikowość.

Próg minimalnego udziału allelu powinien wynikać z walidacji. Zbyt wysoki tworzy dropout; zbyt niski przepuszcza błędy i kontaminację.

W STR proporcje reads obejmują stutter i allele sekwencyjne. Nie wolno kopiować progu SNP.

Błędy sekwencjonowania

Platformy mają charakterystyczne profile:

• substytucje;
• insercje i delecje;
• błędy w homopolimerach;
• spadek jakości końców;
• problemy z phasing;
• błędy indeksu;
• zależność od kontekstu sekwencji.

Konsensus z wielu reads zmniejsza błąd losowy, ale nie usuwa systematycznego. Jeśli primer selektywnie pomija allel, milion odczytów pozostałego allelu nie ujawni braku.

Kontrole i materiały odniesienia muszą obejmować trudne motywy, niskie poziomy wariantów, mieszaniny i różne haplotypy.

Mapowanie i paralogi

Krótki read dopasowuje się do referencji. Jeśli podobna sekwencja występuje w kilku miejscach, mapper może:

• przypisać ją arbitralnie;
• nadać niską jakość mapowania;
• odrzucić;
• rozdzielić między loci.

Ma to znaczenie dla:

• segmental duplications;
• loci Y;
• NUMT;
• pseudogenów;
• powtórzeń;
• homologicznych flank STR.

Assay ukierunkowany może używać pary primerów dla swoistości, ale pipeline nadal powinien oceniać alternatywne miejsce. Walidacja in silico nie zastępuje testu na rzeczywistych próbkach.

PCR duplicates i UMI

W panelu amplikonowym wiele identycznych reads może pochodzić z jednej cząsteczki powielonej PCR albo z wielu cząsteczek o tej samej sekwencji. Bez dodatkowej etykiety nie da się ich odróżnić.

Unique molecular identifier dołączony przed amplifikacją może znakować oryginalną cząsteczkę. Reads z tym samym UMI tworzą rodzinę. Konsensus pomaga wykrywać błędy i liczyć unikalne wejścia.

UMI ma własne błędy:

• kolizje kodów;
• błąd w sekwencji UMI;
• nierówne znakowanie;
• utratę rodzin jednoodczytowych;
• wymagania bioinformatyczne.

W standardowych panelach sądowych UMI nie jest automatycznym elementem. Jeśli się go używa, cały model musi być zwalidowany.

STR w sekwencjonowaniu

MPS rozróżnia:

• liczbę powtórzeń;
• układ wariantów wewnątrz motywu;
• warianty flank;
• allele tej samej długości.

STRSeq powstał jako publiczny katalog sekwencji loci tożsamościowych i zawiera rekordy z opisem zakresu, powtórzenia, flank, jakości oraz zgodnego oznaczenia długościowego.³

Wywołanie STR jest trudniejsze niż SNP:

• read musi objąć informacyjny region;
• długie allele mogą przekraczać odczyt;
• stutter tworzy rodzinę sekwencji;
• indel w flance zmienia wyrównanie;
• reverse complement musi być poprawnie ujednolicony;
• powtórzenia można opisać wieloma równoważnymi zapisami.

ISFG i STRSeq rozwijają wspólną nomenklaturę, aby sekwencja oznaczała to samo w różnych narzędziach.

Zgodność wsteczna CE i MPS

Profil długościowy jest wspólnym mianownikiem historycznych baz. Sekwencja może zostać zredukowana do długościowego oznaczenia, jeśli zakres i definicja allelu są zgodne.

Kierunek odwrotny nie działa: z allelu 12 nie odtworzymy, który wariant sekwencyjny występował. Dlatego raport MPS może przechowywać:

• nazwę długościową;
• pełną sekwencję raportowalną;
• bracketing motywu;
• warianty flank;
• wersję nomenklatury.

Różne zestawy mogą obejmować różne flanki. Dwie sekwencje trzeba porównywać w części wspólnej albo znormalizować do uzgodnionego zakresu.

Sekwencjonowanie mtDNA

mtDNA można badać przez:

• Sanger regionu kontrolnego;
• krótkie nakładające się amplikony;
• długie PCR pełnego mitogenomu;
• capture;
• ukierunkowany MPS.

Dla starej kości krótkie amplikony poprawiają szansę odzysku, ale zwiększają liczbę reakcji i ryzyko zamiany. Długi PCR zmniejsza NUMT, lecz wymaga zachowanego DNA. Capture może odzyskać małe fragmenty, ale potrzebuje kontroli tła i bibliotek.

Pipeline musi określić:

• referencję i zakres;
• minimalną głębokość;
• próg heteroplazmii;
• traktowanie homopolimerów;
• NUMT;
• kryteria mieszaniny;
• wyrównanie i filogenezę;
• nomenklaturę.

SWGDAM publikuje osobne wytyczne interpretacji mtDNA, autosomalnych STR, Y-STR i SNP, co podkreśla, że wspólny odczyt sekwencyjny nie znosi odmiennych reguł biologicznych.⁴

Bioinformatyka jest częścią metody

Pipeline nie jest neutralnym kalkulatorem. Zawiera decyzje:

• trimming adapterów;
• minimalna jakość;
• połączenie paired reads;
• referencja;
• mapper i parametry;
• minimalne pokrycie;
• allele balance;
• baza znanych alleli;
• filtr stutter;
• algorytm STR;
• raportowanie no-call;
• obsługa kontaminacji.

Zmiana wersji może zmienić wynik. Laboratorium wersjonuje:

• kod;
• konfigurację;
• kontenery lub środowisko;
• referencje;
• bazy;
• raport;
• testy regresyjne.

Waliduje się przypadki znane, graniczne, mieszaniny, rzadkie allele, błędy i awarie. „Oprogramowanie producenta” również wymaga walidacji zamierzonego użycia. Zalecenia ISFG dotyczące programów biostatystycznych pokazują ogólną zasadę: wynik software’u musi być sprawdzalny, a implementacja zweryfikowana.⁵

Traceability i materiał odniesienia

Spójność pomiarowa oznacza udokumentowany związek wyniku z odniesieniem przez łańcuch kalibracji i kontroli. W DNA obejmuje to:

• materiały o certyfikowanych genotypach;
• drabiny alleliczne;
• standardy wielkości;
• standardy ilościowe;
• kontrolę sekwencji;
• kalibrację instrumentu;
• wersjonowane bazy.

NIST rozwija materiały odniesienia dla profili PCR, ilości DNA i mtDNA oraz używa CE i sekwencjonowania do charakteryzacji markerów.⁶ Materiał odniesienia nie zastępuje próbki kontrolnej w każdej partii, ale pomaga wykazać porównywalność systemu.

Mapa płytki jest częścią kontroli

W systemach wielopróbkowych ryzyko nie ogranicza się do reakcji chemicznej. Próbka może trafić do niewłaściwego dołka, indeks może zostać przepisany o jeden wiersz, a końcówka przejść nad otwartymi studzienkami.

Dobra mapa płytki:

• powstaje przed pipetowaniem;
• rozróżnia próbki dowodowe, odniesienia i kontrole;
• wskazuje ekstrakt, rozcieńczenie i reakcję;
• jest importowana albo niezależnie sprawdzana;
• zachowuje puste pozycje;
• dokumentuje poprawki;
• pozwala powiązać plik instrumentu z fizycznym dołkiem.

Układ może wspierać wykrycie carry-over. W walidacji automatu stosuje się czasem wzór szachownicy albo zebry: silne próbki przeplatają się z ujemnymi. Sygnał w sąsiednich blankach ujawnia mechanizm, którego nie widać w partii samych próbek dodatnich.

Nie należy stale umieszczać kontroli ujemnej w jednym „bezpiecznym” rogu, jeśli nie monitoruje wtedy typowej drogi robota. Pozycje kontroli wynikają z ryzyka: kierunku pipetowania, konstrukcji głowicy, otwierania folii i przewidywanego rozchlapywania.

W MPS sample sheet jest cyfrową mapą indeksów. Literówka może poprawnie zsekwencjonować bibliotekę, ale przypisać ją złej nazwie. Kontrola obejmuje zgodność indeksu zamówionego, naniesionego, odczytanego i przypisanego.

Precyzja sizingu

Fragment DNA nie ma mierzonej długości przez bezpośrednie liczenie zasad. CE szacuje ją z migracji względem standardu. Ten sam produkt może mieć nieco inną wartość w kolejnych iniekcjach wskutek:

• temperatury;
• wieku i partii polimeru;
• kapilary;
• napięcia;
• składu jonowego;
• dopasowania krzywej;
• jakości standardu.

Walidacja mierzy rozrzut i ustala biny wystarczająco szerokie dla poprawnej klasyfikacji, a zarazem oddzielające sąsiednie allele. Locus z allelami różniącymi się o cztery zasady ma inny margines niż microvariant przesunięty o jedną.

Precision nie jest accuracy. Instrument może dawać bardzo powtarzalny, ale systematycznie przesunięty wynik. Drabina, materiał odniesienia i monitorowanie trendu pomagają wykryć oba problemy.

Utrzymanie i trend instrumentu

Kontrola jakości nie kończy się wynikiem jednej partii. Laboratorium monitoruje:

• prąd i napięcie;
• temperaturę;
• jakość standardu;
• wysokości i rozdzielczość alleli kontroli;
• spectral pull-up;
• spadek sygnału między kapilarami;
• liczbę failed injections;
• terminy polimeru i buforu;
• przeglądy, naprawy i performance check.

Wykres kontroli może ujawnić stopniowe pogorszenie, zanim wynik przekroczy granicę akceptacji. Nagła zmiana po serwisie wymaga sprawdzenia działania. Dane sprzed i po naprawie nie są automatycznie porównywalne tylko dlatego, że nazwa instrumentu pozostała ta sama.

Podobnie w sequencerze monitoruje się yield, jakość cyklu, error rate, procent passing filter, phasing, kontaminację i kontrolę znanej biblioteki. Pojedyncza liczba „run passed” nie wystarcza, jeśli konkretny panel ma nierównomierne loci.

Comparability po zmianie

Zmiana zestawu, polimeru, urządzenia, liczby cykli, platformy, chemii biblioteki albo pipeline’u może wymagać badania porównywalności. Pytanie nie brzmi tylko „czy nowy system daje profil”, lecz:

• czy wywołuje te same allele długościowe;
• czy ujawnia nowe warianty i jak je nazywa;
• czy zmienia stutter i allele balance;
• czy ma inną czułość;
• czy zmienia drop-in i dropout;
• czy historyczne progi nadal obowiązują;
• czy baza częstości pasuje do nowej rozdzielczości;
• czy raporty można porównać bez utraty informacji.

Próbki mostujące obejmują typowe, graniczne, zdegradowane, mieszane i rzadkie allele. Comparability nie wymaga identycznych pików lub liczby reads. Wymaga zrozumienia, czy wniosek i jego ograniczenia pozostają równoważne.

Walidacja CE

Program wewnętrzny obejmuje:

• precyzję sizingu;
• dokładność alleli;
• reproducibility;
• analytical threshold;
• stutter;
• plus/minus A;
• pull-up;
• zakres ilości;
• czułość i dropout;
• mieszaniny;
• degradację i inhibicję;
• specyficzność;
• kontaminację;
• różne instrumenty i kapilary;
• temperaturę, napięcie i iniekcję;
• panel, biny i oprogramowanie.

Wynik walidacji tworzy procedurę oraz granice. Sama średnia skuteczność nie wystarcza; ważne są failure modes.

Walidacja MPS

Oprócz problemów wspólnych z PCR obejmuje:

• yield biblioteki;
• zakres stężeń;
• indeksy i misassignment;
• pooling;
• minimalne reads;
• depth i uniformity;
• allele balance;
• błędy per motyw;
• mapowanie;
• duplikaty;
• kontaminację między run;
• no-call;
• wersję pipeline;
• zgodność CE/MPS;
• warianty sekwencyjne;
• próbki mieszane;
• dane poza zamierzonym celem.

Addendum SWGDAM dla MPS zwraca uwagę na potrzebę reguł odpowiadających sekwencji, a nie mechanicznego kopiowania kryteriów elektroforezy.

CE czy MPS

Pytanie	CE	MPS
podstawowy profil długościowy STR	dojrzały, szybki system	możliwy, zwykle bardziej złożony
allele tej samej długości	nierozróżnialne	rozróżnialne sekwencją
wiele klas markerów	kilka osobnych testów	możliwy wspólny panel
mieszanina	dojrzałe modele pików	modele reads/sequence w rozwoju i walidacji
infrastruktura	instrument CE i pipeline	biblioteka, sequencer, bioinformatyka
zgodność z bazą historyczną	bezpośrednia	wymaga redukcji do alleli długościowych
dane dodatkowe	ograniczone zakresem markerów	większe ryzyko informacji poza celem
jednostka sygnału	RFU piku	liczba i jakość reads

Wybór zależy od throughput, materiału, pytań, bazy i kompetencji. MPS nie jest automatycznie „dokładniejsze”, a CE nie jest „przestarzałe”. Są to różne architektury pomiaru.

Studium 1: przeładowany profil

Próbka odniesienia daje bardzo wysokie piki, spłaszczone wierzchołki i sygnały w innych kanałach. Możliwy mechanizm to nasycenie i pull-up.

Prawidłowe postępowanie:

1. sprawdzić ilość wejścia i zakres walidacji;
2. obejrzeć surowe kanały i kalibrację;
3. porównać położenia macierzystych pików;
4. rozcieńczyć produkt lub użyć krótszej iniekcji zgodnie z procedurą;
5. nie interpretować pull-up jako dodatkowego dawcy.

Ponowna ekstrakcja zwykle nie jest pierwszą odpowiedzią, bo problem powstał po PCR.

Studium 2: słaby allel czy stutter

W mieszaninie przy pozycji n−1 silnego allelu znajduje się pik, który może być stutter albo allelem minor contributor. Procent jest blisko granicy walidacyjnej.

Nie należy go usuwać arbitralnie. Trzeba uwzględnić:

• locus i konkretny allel;
• inne allele kandydata;
• wysokości całego profilu;
• możliwy wkład obu mechanizmów;
• model probabilistyczny;
• niepewność.

Klasyfikacja binarna może tracić informację. Model ciągły może rozdzielać oczekiwany stutter i wkład allelu.

Studium 3: null allele

Profil CE wygląda homozygotycznie, lecz badanie pokrewieństwa tworzy nieoczekiwaną niezgodność. Alternatywny zestaw primerów ujawnia drugi allel. Sekwencjonowanie flanki wykazuje wariant pod primerem pierwszego zestawu.

To przypomina, że wynik 12,12 oznacza „wykryto allel 12 w tym assay”, a nie absolutny dowód dwóch identycznych kopii. Walidacja rzadkich wariantów i alternatywna metoda są ważne przy nietypowej niezgodności.

Studium 4: MPS i nowe allele sekwencyjne

Dwie osoby mają identyczny profil długościowy w określonym STR, ale MPS rozróżnia sekwencję motywu. To zwiększa informację tylko wtedy, gdy:

• allele są poprawnie nazwane;
• częstości sekwencyjne są dostępne;
• zakres odczytu jest zgodny;
• błąd i stutter zostały zwalidowane;
• baza może przechować ten poziom.

Nie wolno użyć częstości allelu długościowego jako częstości rzadszego allelu sekwencyjnego ani odwrotnie.

Studium 5: odczyt w ujemnej bibliotece

Kontrola bez celowo dodanego DNA ma kilka reads zgodnych z silną próbką sąsiednią. Możliwe źródła to kontaminacja podczas biblioteki, index misassignment albo carry-over.

Ocena obejmuje:

• dual-index consistency;
• rozmieszczenie próbek;
• poziom względem walidowanego tła;
• inne blanki;
• wcześniejszy run;
• allele i loci sygnału;
• wpływ na próbki o małej ilości.

Usunięcie reads kontrolnych z raportu nie rozwiązuje problemu. Kontrola definiuje wiarygodność run.

Najczęstsze błędy

„PCR podwaja idealnie”. Rzeczywista wydajność jest zmienna i osiąga plateau.

RFU jako liczba komórek. Sygnał zależy od wielu etapów.

Reads jako pierwotne cząsteczki. PCR duplicates mogą mnożyć jedno wejście.

Każdy pik powyżej progu jako allel. Pull-up, stutter i spike również mogą być wysokie.

Poniżej progu znaczy brak DNA. To zakres braku wiarygodnej klasyfikacji.

Reiniekcja jako niezależny replikat. To ponowna detekcja tego samego produktu.

Więcej cykli naprawi dropout. Nie odtworzy brakującej cząsteczki.

Sekwencjonowanie usuwa stutter. Jeśli użyto PCR STR, stutter pozostaje.

Duża głębokość naprawia bias. Systematycznie niewzmocniony allel pozostanie niewidoczny.

Wspólny instrument równa się wspólna statystyka. STR, SNP, Y i mtDNA zachowują odrębne modele.

Aktualizacja software’u bez walidacji. Zmiana mappera lub bazy może zmienić call.

Zrzut ekranu jako dane. Audyt wymaga plików surowych, parametrów i wersji.

Minimalna karta przebiegu CE

• identyfikator ekstraktu i aliquotu;
• wynik qPCR i decyzja o wejściu;
• zestaw, lot, objętość i liczba cykli;
• termocykler;
• kontrole;
• płytka i pozycja;
• analizator, kapilara, polimer;
• parametry iniekcji;
• standard wielkości i drabina;
• kalibracja widmowa;
• plik surowy;
• panel, biny i progi;
• osoba analizująca i recenzująca;
• odstępstwa.

Minimalna karta przebiegu MPS

• identyfikator DNA i zużyta objętość;
• metoda biblioteki i lot;
• indeksy;
• liczba cykli;
• wynik kwalifikacji biblioteki;
• pooling i proporcje;
• flow cell lub odpowiednik;
• wersja chemii;
• run i sample sheet;
• kontrole;
• demultipleksowanie;
• referencja i baza alleli;
• pipeline, konfiguracja i wersja;
• metryki depth, uniformity, balance i contamination;
• pliki surowe i pośrednie;
• wywołany profil;
• przegląd i odstępstwa.

Co zapamiętać

1. PCR powiela wybrane cele; nie kopiuje genomu bez biasu.
2. Multiplex oszczędza próbkę, ale tworzy konkurencję między loci.
3. qPCR przewiduje ilość i jakość, lecz nie jest profilem.
4. CE rozdziela znakowane produkty według rozmiaru i barwy; RFU nie jest liczbą komórek.
5. Standard wielkości i drabina alleliczna mają różne role.
6. Stutter, pull-up, −A, spike i off-ladder mają odmienne mechanizmy.
7. Próg analityczny wynika z walidacji i nie zmienia każdego piku w allel.
8. MPS odczytuje sekwencję, ale dodaje bibliotekę, indeksowanie, mapowanie i pipeline.
9. Depth nie zastępuje oceny równomierności, duplikatów, allele balance i błędów.
10. CE, Sanger i MPS są komplementarnymi systemami; wybór wynika z pytania i zwalidowanego zastosowania.