Streszczenie

Platforma krótkich odczytów nie „widzi liter DNA”. Mierzy fizyczny sygnał powstający podczas kontrolowanej reakcji chemicznej:

  • natężenie i barwę fluorescencji;
  • zmianę pH po przyłączeniu nukleotydu;
  • wzór wiązania znakowanych reagentów;
  • położenie sygnału na matrycy.

Oprogramowanie przekształca obrazy lub wartości z sensorów w:

  1. lokalizację obiektu;
  2. sygnał w kolejnych cyklach;
  3. basecall, czyli A, C, G, T albo N;
  4. prawdopodobieństwo błędu;
  5. zapis FASTQ;
  6. przypisanie odczytu do próbki według indeksu.

Krótki odczyt jest zatem wynikiem łańcucha:

cząsteczka biblioteki → kopie na powierzchni → cykle chemii → sygnał → korekta sygnału → basecall → Q-score.

Najczęstszy błąd pojęciowy polega na utożsamieniu basecallu z bezpośrednią obserwacją zasady. Zasada jest wnioskiem z modelu sygnału. Jego niepewność zależy od cyklu, kontekstu sekwencji, jakości klastra, kalibracji, składu biblioteki i wersji oprogramowania.

Artykuł nie jest katalogiem urządzeń. Wyjaśnia wspólną architekturę pomiaru, aby czytelnik umiał:

  • porównać sequencing by synthesis, ligation i pomiar półprzewodnikowy;
  • zrozumieć klaster, nanoball i studzienkę sensora;
  • odróżnić read, index read i paired-end;
  • czytać Q30, yield, occupancy, phasing i error rate;
  • ustalić, czy problem pochodzi z biblioteki, instrumentu czy basecallingu;
  • dobrać kryteria jakości do zastosowania.

Przygotowanie cząsteczki wejściowej opisuje Biblioteka sekwencyjna. Tutaj punktem startowym jest już pula gotowa do załadowania.

Sekwenator krótkich odczytów lokalizuje klaster lub obiekt, wykonuje cykle chemii, mierzy sygnał, koryguje jego nakładanie i przesunięcie fazy, a następnie zapisuje basecall i wartość Q w FASTQ.
Sekwenator krótkich odczytów lokalizuje klaster lub obiekt, wykonuje cykle chemii, mierzy sygnał, koryguje jego nakładanie i przesunięcie fazy, a następnie zapisuje basecall i wartość Q w FASTQ.

Krótki odczyt powstaje przez masową równoległość

Metoda Sangera rozdziela produkty o kolejnych długościach w kapilarze. Platformy wysokoprzepustowe rozmieszczają ogromną liczbę cząsteczek lub ich klonalnych kopii w wielu punktach i odczytują je cykl po cyklu.

Każdy punkt powinien reprezentować jeden insert biblioteki. Równoległość daje przepustowość, lecz stawia wymagania:

  • obiekty muszą być rozdzielone przestrzennie;
  • sygnał jednego nie może zalewać sąsiada;
  • kopie w obiekcie muszą pozostać zsynchronizowane;
  • reakcja musi być dostatecznie jednorodna na całej powierzchni;
  • obraz lub sensor musi zachować pozycję przez wiele cykli.
Krótki oznacza ograniczony kontekst

Odczyt 150 nt może bardzo dokładnie opisać 150 zasad, ale nie powie sam, z którego z kilku niemal identycznych powtórzeń pochodzi. Ograniczenie długości jest odrębne od błędu basecallu.

Można mieć:

  • odczyt dokładny, lecz niemapowalny;
  • odczyt gorszej jakości, ale jednoznaczny;
  • parę odczytów wskazującą insert;
  • wiele zgodnych odczytów z tego samego duplikatu PCR.

Obiekt pomiarowy może być klastrem, nanoballem albo studzienką

Pojedyncza cząsteczka fluorescencyjna zwykle daje za mało fotonów do klasycznych systemów obrazujących. Dlatego insert jest lokalnie powielany.

Klaster to grupa klonalnych kopii przywiązanych do małego obszaru flow cell. DNA nanoball, DNB, to skondensowany produkt powielania toczącego się koła umieszczony w określonym miejscu matrycy. W systemie półprzewodnikowym klonalne kopie mogą znajdować się na kulce w mikrostudni.

Wspólny cel jest ten sam: wzmocnić sygnał jednej cząsteczki biblioteki bez mieszania jej z sąsiadami.

Klonalność nie oznacza niezależności

Tysiąc kopii w klastrze reprezentuje jedną cząsteczkę biblioteki. Nie daje tysiąca niezależnych obserwacji genomu.

Basecaller używa wspólnego sygnału kopii do jednego ciągu zasad.

Sequencing by synthesis z odwracalnym terminatorem

W najpowszechniejszym wariancie SBS polimeraza dołącza znakowany nukleotyd z odwracalną blokadą dalszej syntezy. Jeden cykl obejmuje:

  1. dostarczenie nukleotydów;
  2. wbudowanie jednej zasady;
  3. usunięcie niewbudowanych reagentów;
  4. obrazowanie;
  5. identyfikację sygnału;
  6. odcięcie fluoroforu i blokady;
  7. przejście do następnego cyklu.

Blokada ogranicza wydłużenie do jednej zasady w cyklu. Praca Bentleya i współpracowników pokazała użycie chemii reversible terminator do sekwencjonowania całego genomu człowieka.1

Kanały barwne nie zawsze odpowiadają jeden do jednego zasadom

System może używać:

  • czterech barw;
  • dwóch kanałów i kombinacji obecności sygnału;
  • chemii, w której brak sygnału ma znaczenie.

Dlatego „ciemny cykl” może być prawidłową informacją w jednej chemii, a awarią w innej. Szczegóły basecallingu są zależne od generacji platformy.

Fluorescencja jest mieszaniną

Rejestrowany piksel może zawierać:

  • sygnał klastra;
  • tło powierzchni;
  • autofluorescencję;
  • przeciek widma;
  • sygnał sąsiedniego klastra;
  • nierównomierność oświetlenia;
  • pozostałość z poprzedniego cyklu.

Przed basecallingiem obraz wymaga lokalizacji, normalizacji i korekty kanałów.

Amplifikacja na powierzchni tworzy klaster

W bridge amplification cząsteczka z adapterami wiąże się z oligonukleotydem powierzchni, wygina do drugiego startera i jest kopiowana. Kolejne rundy tworzą lokalną rodzinę.

Na powierzchni losowej klastry powstają w miejscach przyłączenia. Na patterned flow cell mają wyznaczone nanostudzienki lub pozycje.

Za mało i za dużo załadowania

Zbyt małe stężenie:

  • daje mniej obiektów;
  • obniża yield;
  • marnuje powierzchnię.

Zbyt duże:

  • zwiększa nakładanie;
  • tworzy poliklonalne obiekty;
  • utrudnia lokalizację;
  • pogarsza rozdzielenie sygnałów;
  • może obniżyć odsetek przechodzący filtr.

Optimum zależy od długości, molarności aktywnej biblioteki i chemii.

Exclusion amplification i patterned flow cell

W systemach z wyznaczonymi pozycjami chemia może preferować zajęcie miejsca przez jedną cząsteczkę i lokalne powielenie. Nie usuwa to:

  • pustych miejsc;
  • wielu cząsteczek w jednym miejscu;
  • index hopping;
  • adapter dimers;
  • różnic w klastrowaniu między bibliotekami.

Stała geometria ułatwia obrazowanie, lecz jakość nadal zależy od puli.

DNA nanoballs rozdzielają powielenie od matrycy

W podejściu DNB kolista matryca jest powielana metodą rolling-circle, tworząc wiele tandemowych kopii. Nanoball umieszcza się na uporządkowanej matrycy.

Praca Drmanaca i współpracowników pokazała wysokogęstościowe nanoarrays i nieciągłe odczyty w sekwencjonowaniu genomu człowieka.2

Zaletą rozdzielenia powielenia od powierzchni może być kontrola obiektu przed osadzeniem. Nadal występują błędy:

  • pierwotnej biblioteki;
  • tworzenia koła;
  • powielania;
  • załadowania;
  • chemii i obrazowania;
  • basecallingu.
DNB nie jest UMI

Nanoball pochodzi z jednej cząsteczki biblioteki, lecz dwa DNB mogą reprezentować duplikaty PCR tej samej cząsteczki wejściowej. Identyfikacja fizycznego obiektu nie odtwarza genealogii sprzed biblioteki.

Sekwencjonowanie przez ligację

Zamiast polimerazy można użyć ligazy i znakowanych sond, które rozpoznają krótkie kombinacje zasad przy starterze. Kolejne rundy z przesuniętymi starterami kodują pozycje w przestrzeni barw lub wzorów ligacji.

Zaletą może być wielokrotne pytanie o tę samą pozycję. Ceną są:

  • bardziej złożone kodowanie;
  • krótszy praktyczny odczyt;
  • propagacja błędu przy niepoprawnym dekodowaniu;
  • trudniejsza intuicyjna interpretacja.

Historyczne platformy ligacyjne są ważne, bo pokazują, że sekwencja może być wnioskowana z relacji między zasadami, nie tylko z ich bezpośredniego dołączania.

Sensor półprzewodnikowy mierzy proton

Przy wbudowaniu nukleotydu przez polimerazę uwalnia się jon wodorowy. W mikrostudni zmiana pH może zostać wykryta przez sensor półprzewodnikowy.

W kolejnych cyklach podaje się jeden typ nukleotydu. Jeśli pasuje, powstaje sygnał. Jeśli matryca ma homopolimer, kilka identycznych zasad może zostać dołączonych w jednym cyklu, a amplituda ma wskazać ich liczbę.

Rothberg i współpracownicy opisali scalony układ umożliwiający nieoptyczne sekwencjonowanie genomu.3

Homopolimer zamienia kategorię w ilość

W chemii jednego wbudowania na cykl pytanie brzmi zwykle: który kanał wygrał? W systemie bez terminatora trzeba oszacować, czy sygnał odpowiada 1, 2, 3 czy większej liczbie zasad.

Im dłuższy homopolimer, tym trudniej rozróżnić sąsiednie wartości amplitudy. Profil błędów ma przez to więcej indeli w takich regionach.

Brak optyki nie oznacza braku kalibracji

Sensor ma:

  • offset;
  • szum;
  • dryf;
  • różnice między studzienkami;
  • wpływ temperatury;
  • tło chemiczne;
  • przesłuch między lokalnymi reakcjami.

Sygnał elektryczny także wymaga modelu.

Sequencing by binding i avidity rozdziela odczyt od wydłużenia

Nie każda nowa chemia musi znakować nukleotyd wbudowywany do rosnącej nici. W podejściach sequencing by binding znakowany reagent rozpoznaje zasadę matrycy lub kompleks polimeraza–matryca, a etap identyfikacji może być rozdzielony od dołączenia nukleotydu.

W chemii avidity wielowartościowy reagent wiąże wiele kopii tego samego miejsca w klastrze. Zwiększa to siłę i swoistość wspólnego sygnału bez wymagania, aby pojedyncze słabe wiązanie trwało długo.

Ogólna sekwencja cyklu nadal obejmuje:

  1. zatrzymanie wszystkich kopii na tej samej pozycji;
  2. dostarczenie reagentu rozpoznającego;
  3. obrazowanie;
  4. usunięcie reagentu;
  5. kontrolowane przesunięcie o jedną zasadę.
Nowa chemia nie usuwa wspólnych problemów

Nadal trzeba kontrolować:

  • klonalność obiektu;
  • synchronizację;
  • gęstość;
  • tło;
  • przeciek kanałów;
  • indeksy;
  • długość insertu;
  • reprezentatywność biblioteki.

Porównanie platform powinno opierać się na zwalidowanym profilu błędu i odzysku wariantów, nie na nazwie mechanizmu.

Obrazowanie zamienia powierzchnię w tensor sygnału

Dla każdego cyklu instrument rejestruje obrazy kanałów. Uproszczony zbiór danych ma wymiary:

pozycja × cykl × kanał.

Zanim powstanie basecall, trzeba rozwiązać kilka problemów.

Rejestracja obrazu

Ta sama pozycja klastra musi zostać odnaleziona po przepływie reagentów, zmianie temperatury i setkach zdjęć. Minimalne przesunięcie współrzędnych może przypisać sygnał sąsiada.

Algorytm używa punktów odniesienia i wzoru całej powierzchni. Lokalne odkształcenie nie zawsze jest naprawiane globalną transformacją.

Korekta tła

Tło nie jest jedną stałą wartością. Może zmieniać się:

  • między kanałami;
  • po powierzchni;
  • z cyklem;
  • wraz z lotem reagentu;
  • przy zanieczyszczeniu.

Zbyt agresywne odjęcie usuwa słaby prawdziwy sygnał, zbyt małe zwiększa niepewność.

Color matrix

Widma fluoroforów nakładają się. Obserwowany wektor intensywności można traktować jako mieszaninę prawdziwych kanałów:

I_obserwowane = M × I_prawdziwe + tło.

Macierz M jest estymowana i odwracana lub uwzględniana przez model. Niewłaściwa kalibracja daje systematyczne zamiany określonych zasad.

Normalizacja intensywności

Sygnał słabnie przez utratę aktywnych nici i fotochemię. Model nie może porównywać bezpośrednio jasności cyklu 5 i 145 bez uwzględnienia trendu.

Jednocześnie biologicznie nietypowy skład zasad nie powinien zostać „naprawiony” do oczekiwanego balansu.

Czystość sygnału jest relacją, nie jasnością

Klaster może być jasny, ale emitować podobnie w dwóch kanałach. Inny może być słaby, lecz mieć jeden wyraźnie dominujący kanał.

Miara purity lub chastity porównuje sygnał najlepszy z kolejnym. Poliklonalny klaster zawierający dwa inserty często daje mieszaninę już w pierwszych cyklach.

Filtr pierwszych cykli ma konsekwencje

Jeśli obiekt zostanie odrzucony wcześnie, nie generuje pełnego read. Filtr poprawia jakość zachowanego zbioru kosztem yield.

Biblioteka low-diversity może zostać niesłusznie uznana za trudną do lokalizacji lub filtrowania, choć jej cząsteczki są biologicznie poprawne.

Jasność nie mówi o liczbie genomów

Większy klaster może emitować silniej, ale nadal pochodzi z jednej cząsteczki biblioteki. Intensywności nie używa się jako bezpośredniej liczby alleli w próbce.

Jeden cykl powinien odpowiadać jednemu krokowi wszystkich kopii

W idealnym klastrze wszystkie nici dołączają właściwą zasadę w tym samym cyklu. W praktyce część:

  • nie wbuduje zasady i zostanie z tyłu;
  • nie zatrzyma się prawidłowo i wyprzedzi;
  • straci aktywność;
  • pozostanie z nieusuniętym fluoroforem;
  • odłączy się.

To phasing i prephasing w szerokim sensie: rozmycie synchronizacji populacji kopii.

Jakość spada z cyklem

Po wielu cyklach sygnał jest mieszaniną kilku przesuniętych populacji. Zwykle trudniej rozróżnić zasadę pod koniec odczytu niż na początku.

Spadek nie musi być liniowy. Może pogorszyć się po:

  • regionie niskiej różnorodności;
  • problemie z reagentem;
  • pęcherzyku;
  • zmianie ostrości;
  • wysokim GC;
  • wejściu w adapter.

Trimming końców poprawia średnią jakość zachowanych baz, ale usuwa informację.

Basecalling jest klasyfikacją sygnału

Dla każdego obiektu i cyklu algorytm:

  • pobiera intensywności lub wartości sensora;
  • odejmuje tło;
  • koryguje relacje kanałów;
  • uwzględnia historię cykli;
  • wybiera zasadę;
  • estymuje ryzyko błędu.

Nowe wersje basecallera mogą zmienić FASTQ z tych samych surowych danych.

N oznacza brak dostatecznej decyzji

N nie jest piątą zasadą. Oznacza, że algorytm nie przypisał A/C/G/T z wymaganą pewnością.

Wysoki udział N może wskazywać:

  • bardzo słaby sygnał;
  • poliklonalność;
  • niską różnorodność;
  • awarię cyklu;
  • problem z obrazowaniem;
  • niekompatybilny read structure.
Raw data i FASTQ to różne poziomy

Surowe obrazy lub sygnały mogą być ogromne i nie zawsze są przechowywane lub udostępniane. FASTQ zawiera wynik basecallingu, nie pełny sygnał fizyczny.

Re-basecalling wymaga odpowiedniego poziomu danych i zgodnego oprogramowania.

Wartość Q jest logarytmiczną prognozą błędu

Skala Phred:

Q = -10 log₁₀(P_błędu).

Zatem:

Q Przewidywane P błędu Przybliżona trafność
10 0,1 90%
20 0,01 99%
30 0,001 99,9%
40 0,0001 99,99%

Ewing i Green opracowali probabilistyczne wartości jakości dla basecallingu śladów Sangera; konwencja Phred została później szeroko zastosowana w FASTQ.4

Q30 nie oznacza, że każda baza ma 99,9%

„85% ≥ Q30” oznacza, że 85% basecalli otrzymało przewidywaną jakość co najmniej 30. Pozostałe 15% ma inne wartości. Średnia dla runu nie opisuje konkretnego locus.

Q jest prognozą modelu. Musi być skalibrowane: w zbiorze baz Q30 około jedna na tysiąc powinna być błędna w odpowiednich warunkach.

Dyskryminacja i kalibracja

Model może dobrze rankingować dobre i złe basecalle, ale zbyt optymistycznie przypisywać liczby. Można to ocenić na sekwencji kontrolnej o znanej prawdzie.

Kalibracja zależy od:

  • platformy;
  • wersji chemii;
  • cyklu;
  • kontekstu;
  • wersji basecallera;
  • definicji prawdy;
  • filtrów.
Q nie jest jakością wariantu

Base quality dotyczy litery w odczycie. Mapping quality dotyczy położenia odczytu. Variant quality dotyczy hipotezy o wariancie po agregacji wielu dowodów.

Wysokie Q jednej zasady nie rozwiązuje paralogu ani duplikatu.

FASTQ łączy sekwencję i jakość

Klasyczny rekord ma cztery wiersze:

@identyfikator
ACGTT...
+
IIHGF...

Znaki jakości kodują liczby Q przez ustalony offset ASCII. Współczesne pipeline’y zwykle używają Phred+33, lecz archiwalne dane mogą wymagać sprawdzenia.

Identyfikator może zawierać metadane techniczne

Nagłówek może kodować:

  • instrument;
  • run;
  • flow cell;
  • lane;
  • tile;
  • współrzędne;
  • numer pary;
  • stan filtra;
  • indeks.

Format zależy od platformy i konwersji. Parser nie powinien zakładać struktury na podstawie jednego pliku.

Sekwencja indeksu też ma jakość

Index read jest odczytem chemicznym. Błąd może przypisać read do innej próbki albo do undetermined.

Demultipleksowanie powinno określać:

  • oczekiwane indeksy;
  • orientację;
  • dozwolone niedopasowania;
  • unikalność po korekcie;
  • postępowanie z nieoczekiwaną parą.

Read 1, index reads i read 2 są osobnymi odcinkami runu

Typowy paired-end run może obejmować:

  1. Read 1;
  2. Index 1;
  3. Index 2;
  4. odwrócenie lub regenerację matrycy;
  5. Read 2.

Kolejność i chemia zależą od platformy.

Read structure musi pasować do biblioteki

W single-cell pierwsze zasady mogą kodować cell barcode i UMI, a dalszy odczyt insert. W ampliconie początkiem może być primer. W bibliotece standardowej adapter znajduje się poza insertem, dopóki odczyt nie przejdzie przez krótki fragment.

Błędny read structure może:

  • potraktować UMI jako insert;
  • przesunąć barcode;
  • zostawić adapter;
  • zniszczyć demultipleksowanie;
  • wygenerować pozornie niską jakość.

Adapter read-through jest przewidywalny

Jeśli insert ma 120 bp, a Read 1 ma 150 cykli, ostatnie około 30 pozycji będzie czytać adapter po drugiej stronie.

Objawy:

  • wzrost znanej sekwencji adaptera;
  • spadek jakości;
  • niestandardowy skład zasad;
  • pary mocno nakładające się.

Trimming powinien usuwać adapter na podstawie dopasowania, nie stałego odcięcia identycznej liczby zasad ze wszystkich reads.

Nakładające się pary mogą potwierdzać bazę

Jeśli R1 i R2 obejmują ten sam fragment z przeciwnych stron, można je scalić albo porównać. Niezgodność wskazuje błąd jednego odczytu.

Nie są to jednak niezależne cząsteczki — to dwa pomiary tej samej biblioteki.

Skład zasad wpływa na lokalizację i kalibrację

W pierwszych cyklach system uczy się pozycji obiektów, rozdziału kanałów i charakterystyki runu. Biblioteka o identycznym początku w każdym klastrze ma małą różnorodność.

Dotyczy to między innymi:

  • ampliconów;
  • bibliotek small RNA;
  • części bibliotek bisulfite;
  • konstrukcji z długim stałym primerem;
  • niektórych barcode.
PhiX lub inna zróżnicowana kontrola

Dodatek biblioteki o znanej i zróżnicowanej sekwencji może:

  • zwiększyć balans zasad;
  • dostarczyć referencji do error rate;
  • pomóc ocenić kalibrację;
  • ujawnić problem chemii.

Zużywa część przepustowości. Wymagany udział zależy od platformy i rodzaju biblioteki.

Balanced indexes nie naprawiają insertu

Zrównoważone index reads pomagają w cyklach indeksowych, ale nie zmienią identycznych początków Read 1. Każdy odcinek runu trzeba oceniać osobno.

Błędy mają sygnaturę

Możliwe klasy:

  • substytucje zależne od kanału;
  • indel w homopolimerze;
  • spadek jakości z cyklem;
  • błędy na końcu;
  • błędy po niskiej różnorodności;
  • błędy sąsiadujących klastrów;
  • index hopping;
  • błędne przycięcie adaptera;
  • błędy biblioteki sprzed instrumentu.

Profil platformy nie jest stałą biologiczną. Zmieniają go chemia i software.

GC wpływa głównie przed basecallingiem, ale nie tylko

Skrajne GC może utrudniać:

  • PCR biblioteki;
  • klastrowanie;
  • denaturację;
  • syntezę;
  • mapowanie.

Nierówne pokrycie GC nie może być przypisane automatycznie sekwenatorowi. Trzeba prześledzić bibliotekę.

Uszkodzenie matrycy może wyglądać jak wariant

Deaminacja, utlenienie i uszkodzenie FFPE powstają przed runem. Sekwenator może poprawnie odczytać zmienioną cząsteczkę.

Wysokie Q oznacza pewność odczytu tej matrycy, nie pewność, że matryca reprezentuje genom in vivo.

Metryki runu trzeba czytać razem

Yield

Liczba baz lub reads po określonym filtrze. Wysoki yield nie gwarantuje:

  • równomiernego przypisania próbek;
  • jakości targetu;
  • unikalności;
  • poprawnego indeksu;
  • braku kontaminacji.
Odsetek przechodzący filtr

Obiekty mogą zostać odrzucone jako poliklonalne, słabe lub niestabilne. Definicja filtra zależy od platformy.

Spadek może wynikać z przeładowania, złej biblioteki lub problemu obrazowania.

Density, occupancy i loading

Opisują wykorzystanie powierzchni lub sensorów. Zbyt wysoka occupancy może pogorszyć czystość, a zbyt niska yield.

Porównanie między różnymi generacjami wymaga odpowiednich jednostek.

% ≥ Q30

Jest użytecznym skrótem, ale ukrywa:

  • różnicę R1/R2;
  • spadek po cyklu;
  • problem konkretnego tile;
  • index reads;
  • kontekst sekwencji;
  • błędną kalibrację.
Error rate kontroli

Mapowanie znanej kontroli pozwala policzyć niezgodności, ale wynik zależy od:

  • jakości referencji;
  • mapowania;
  • odrzucenia indeli;
  • prawdziwych różnic szczepu;
  • udziału kontroli;
  • regionów trudnych.
Intensywność i phasing

Spadek intensywności lub wzrost phasing może wyjaśnić końcowy spadek jakości. Metryki te są bliżej mechanizmu niż sama liczba Q30.

Run może być przestrzennie nierówny

Flow cell ma lane, tile, swath, powierzchnie i współrzędne zależne od urządzenia. Lokalny problem może wynikać z:

  • pęcherzyka;
  • rysy;
  • zanieczyszczenia;
  • ogniska;
  • przepływu;
  • temperatury;
  • nierównomiernego załadowania.

Średnia całego runu może ukryć uszkodzony obszar.

Diagnostyka przestrzenna

Warto narysować per tile:

  • liczbę klastrów;
  • Q;
  • intensywność;
  • phasing;
  • odsetek filtrowany;
  • skład zasad;
  • N.

Wzór geometryczny wskazuje instrument lub flow cell bardziej niż biologię próbki.

Reagenty i fluidics tworzą oś czasu runu

Sekwenator jest jednocześnie układem:

  • pompowym;
  • termicznym;
  • optycznym albo sensorowym;
  • chemicznym;
  • informatycznym.

Awaria jednego cyklu może wpłynąć na wszystkie późniejsze cykle, bo nici tracą synchronizację.

Pęcherzyk przerywa lokalny kontakt

Obszar bez reagentu nie przeprowadzi poprawnie wbudowania lub deblokowania. Po przesunięciu pęcherzyka geometria defektu może się zmienić, ale uszkodzone klastry pozostają poza fazą.

W obrazie widoczny bywa pas lub plama, a nie losowo rozproszone niskie Q.

Temperatura steruje kinetyką

Polimeraza, hybrydyzacja i odcinanie blokady zależą od temperatury. Odchylenie może zmienić:

  • szybkość wbudowania;
  • swoistość;
  • tło;
  • phasing;
  • stabilność duplexu.

Czujnik temperatury mierzy wybrane miejsce urządzenia, nie każdą kroplę na powierzchni.

Reagent ma historię

Znaczenie mają:

  • transport;
  • przechowywanie;
  • rozmrożenie;
  • liczba cykli freeze–thaw;
  • data przygotowania;
  • lot;
  • czas na pokładzie;
  • kontakt ze światłem.

„Ten sam kit” z inną historią może dać inny sygnał. Log runu powinien łączyć identyfikatory odczynników z wynikiem.

Maintenance jest częścią jakości

Mycie, kontrola fluidics, kalibracja optyki, wymiana elementów i test po serwisie są danymi jakościowymi. Jeśli tylko jeden instrument daje systematyczny spadek określonego kanału, korekta bioinformatyczna nie powinna zastępować naprawy.

Budżet błędu zaczyna się przed sekwenatorem

Ostateczna niezgodność może pochodzić z:

  1. organizmu — prawdziwy wariant lub mozaika;
  2. pobrania — domieszka drugiej tkanki;
  3. degradacji — chemicznie zmieniona zasada;
  4. ekstrakcji — kontaminacja;
  5. odwrotnej transkrypcji — błędne cDNA;
  6. PCR — wczesny błąd;
  7. instrumentu — błędny sygnał;
  8. basecallingu — zła klasyfikacja;
  9. mapowania — zły locus;
  10. variant callingu — zły model.

Q-score dotyczy głównie etapów 7–8. Nie obejmuje pełnego budżetu.

Powtarzanie tego samego runu nie testuje wszystkiego

Ponowne basecalling tych samych obrazów testuje software. Ponowne sekwencjonowanie tej samej puli testuje część losowości runu. Nowa biblioteka testuje przygotowanie od wybranego etapu. Nowa ekstrakcja testuje wcześniejszy odcinek.

Rodzaj powtórzenia powinien odpowiadać hipotezie o błędzie.

Kryteria akceptacji mają dwa poziomy

Run-level QC odpowiada: czy instrument i wspólna chemia zadziałały dostatecznie dobrze?

Sample-level QC odpowiada: czy konkretna próbka dostarczyła danych do zaplanowanego celu?

Run może przejść, a próbka nie. Próbka może mieć dostateczne dane mimo wskaźnika runu nieznacznie poza nominalnym zakresem, jeśli odchylenie nie dotyczy jej celu — taka decyzja wymaga udokumentowanego wyjątku.

Przykładowa matryca decyzji
Sytuacja Run Próbka Działanie
kontrola i wszystkie próbki słabe fail nie oceniać biologicznie powtórzyć run po RCA
kontrola dobra, jedna próbka ma mało reads pass fail lub re-pool sprawdzić bibliotekę i indeks
Q końca R2 spada, target mieści się w R1 warunkowo pass zależnie od celu ograniczyć analizę, udokumentować
wysoki undetermined, dozwolone próbki poprawne investigate możliwe pass sprawdzić indeksy i kontaminację
lokalny uszkodzony tile warunkowo ocenić utratę wykluczyć tile i przeliczyć pokrycie

Kryteria powinny powstać przed obejrzeniem konkretnego wyniku.

Pojedynczy run może mieścić się w granicach, ale seria pokazuje:

  • spadek intensywności;
  • wzrost phasing;
  • rosnący undetermined;
  • różnicę między instrumentami;
  • lot odczynnika;
  • efekt sezonu lub temperatury pomieszczenia.

Karty kontrolne i stabilne materiały referencyjne pomagają wykryć trend przed formalną awarią.

Studium: pozorny wariant 2% w jednej próbce

Załóżmy, że 20 z 1000 reads pokazuje zmianę. Surowy VAF wynosi 2%. Przed wnioskiem o mozaice trzeba sprawdzić kilka poziomów.

Poziom basecallu
  • Czy alternatywne zasady mają wysokie Q?
  • Czy leżą w końcowych cyklach?
  • Czy występują na obu kierunkach?
  • Czy są związane z jednym tile?
  • Czy kontrola znana ma w tym kontekście błędy?

Jeśli wszystkie 20 występuje przy niskim Q w ostatnich pięciu cyklach R2, wsparcie jest słabe.

Poziom cząsteczki
  • Ile jest niezależnych startów i UMI?
  • Czy reads są duplikatami jednej rodziny?
  • Czy obie nici dupleksu potwierdzają zmianę?
  • Czy alternatywa pojawia się w obu bibliotekach?

20 kopii jednego wczesnego błędu PCR to jedna obserwacja molekularna.

Poziom próbki i runu
  • Czy ten sam sygnał jest w blanku?
  • Czy sąsiednia próbka ma wariant z wysokim VAF?
  • Czy indeksy mogły hopować?
  • Czy wszystkie 20 ma nietypową kombinację indeksów?

2% może być kontaminacją, nie mozaiką.

Poziom biologiczny
  • Czy wejście zawierało co najmniej setki lub tysiące genomów?
  • Czy badana tkanka jest odpowiednia?
  • Czy wynik zgadza się z drugim pobraniem?
  • Czy metoda ortogonalna ma granicę poniżej 2%?

Studium pokazuje, dlaczego 1000× i wysokie Q nie są samodzielnym dowodem.

Reprocessing musi być wersjonowany

Zmiana:

  • basecallera;
  • modelu jakości;
  • demultipleksera;
  • przycinania;
  • filtra;
  • listy indeksów

może zmienić wynik bez nowego eksperymentu.

Raport powinien przechowywać:

  • identyfikator runu;
  • wersję instrument control software;
  • wersję chemii;
  • wersję basecallera;
  • parametry;
  • sample sheet;
  • sumy kontrolne FASTQ;
  • datę reprocessingu.
Surowe dane nie zawsze są wieczne

Obrazy mogą zajmować więcej miejsca niż FASTQ i być usuwane po basecallingu. Przed runem trzeba ustalić:

  • co jest archiwizowane;
  • przez ile;
  • czy można re-basecallować;
  • kto ma dostęp;
  • jak przenosi się dane;
  • jak weryfikuje integralność.

Brak retencji może uniemożliwić późniejsze użycie ulepszonego modelu.

Porównanie platform wymaga wspólnego materiału

Deklarowane specyfikacje producentów są użyteczne do planowania, ale nie zastępują walidacji lokalnej.

Porównanie powinno używać:

  • tego samego materiału referencyjnego;
  • bibliotek przygotowanych uczciwie dla każdej platformy;
  • podobnego zakresu targetu;
  • ustalonego zbioru prawdy;
  • oddzielnych klas wariantów;
  • powtórzeń;
  • pełnego kosztu i czasu.
Jedna liczba accuracy ukrywa kontekst

Platforma może mieć:

  • mało substytucji;
  • więcej indeli;
  • problem z homopolimerami;
  • słabsze końce;
  • nierówny GC;
  • świetne średnie poza trudnymi regionami.

Benchmark powinien raportować precision i recall dla SNV, indeli, regionów trudnych i zakresów VAF.

Truth set też ma granice

Brak wariantu w zbiorze prawdy nie zawsze oznacza błąd platformy. Region może być wyłączony, genotyp niepewny albo próbka zawierać prawdziwą mozaikę.

Ocena musi rozdzielać:

  • high-confidence region;
  • callable region platformy;
  • region poza benchmarkiem;
  • discordance wymagającą arbitrażu.

Demultipleksowanie jest częścią pomiaru

Po basecallingu index reads porównuje się z sample sheet. Odczyt może być:

  • dokładnie zgodny;
  • zgodny po jednym mismatch;
  • niejednoznaczny;
  • z nieoczekiwaną parą;
  • undetermined.
Korekta indeksu ma granice

Jeśli dwa użyte indeksy różnią się jedną zasadą, dopuszczenie jednego mismatch może zamienić błąd w błędne przypisanie. Zestaw powinien mieć odpowiednią odległość kodową.

Nie należy zwiększać tolerancji tylko po to, by zmniejszyć katalog undetermined.

Macierz nieoczekiwanych par

W dual-index runie tabela i7 × i5 pomaga rozpoznać:

  • index hopping;
  • kontaminację;
  • pomyłkę puli;
  • brakujący indeks;
  • źle zapisaną orientację.

Niski sygnał w wielu niedozwolonych parach ma inne znaczenie niż dominująca jedna zamiana.

Kontrola znana i kontrola procesowa odpowiadają na inne pytania

Znana biblioteka na runie kontroluje chemiczne odczytanie i basecalling. Nie kontroluje:

  • ekstrakcji próbki;
  • fragmentacji;
  • ligacji;
  • amplifikacji badanego materiału;
  • capture;
  • błędu indeksowania przed pulą.

Kontrola procesu powinna przejść odpowiedni workflow.

Kontrola nie zastępuje próbki

Run może świetnie odczytać PhiX, a źle odczytać bibliotekę niskiej różnorodności lub skrajnego GC. Wynik kontroli mówi, że instrument potrafił odczytać kontrolę w tych warunkach.

Jak odróżnić bibliotekę od instrumentu

Objaw Biblioteka bardziej prawdopodobna Instrument/chemia bardziej prawdopodobne
problem tylko jednej próbki zły indeks, dimery, niska złożoność lokalny błąd przypisania
problem wszystkich próbek i kontroli złe wspólne poolowanie reagent, fluidics, obrazowanie
wysoka duplikacja małe wejście, PCR nie tworzy duplikatów biologicznych
niska jakość po wejściu w adapter krótki insert poprawny pomiar złej długości
geometryczny wzór tile mało prawdopodobny pęcherzyk, fokus, powierzchnia
wysoki undetermined złe indeksy/sample sheet słaby index read
GC dropout przed runem PCR/capture możliwa amplifikacja na powierzchni

Rozpoznanie wymaga metadanych i porównania próbek, nie jednego progu.

Krótki odczyt jest mocny tam, gdzie liczy się liczba

Zalety:

  • duża przepustowość;
  • niski koszt na bazę;
  • wysoka dokładność substytucji w dobrze zachowujących się regionach;
  • dojrzałe pipeline’y;
  • paired-end;
  • skalowalne multipleksowanie;
  • dobre ilościowe zliczanie przy właściwej bibliotece.

Ograniczenia:

  • powtórzenia dłuższe niż insert;
  • fazowanie odległych wariantów;
  • rearanżacje z niejednoznacznymi końcami;
  • allele w paralogach;
  • pełne izoformy;
  • ekspansje powtórzeń;
  • haplotypy.

Nie należy kompensować braku kontekstu wyłącznie głębokością.

Wymiar platformy trzeba dobrać do projektu

Porównuje się:

  • chemiczny typ pomiaru;
  • maksymalną i użyteczną długość;
  • paired-end;
  • liczba reads;
  • czas runu;
  • tryby flow cell;
  • zgodność indeksów;
  • wejście i typ biblioteki;
  • profil błędu;
  • możliwość ponownego basecallingu;
  • format surowych danych;
  • koszt całego projektu.

Cena za gigabazę nie obejmuje:

  • nieudanej biblioteki;
  • zbyt małej liczby indeksów;
  • nadmiarowych reads;
  • przechowywania;
  • czasu instrumentu;
  • potwierdzenia;
  • powtórzenia partii.
Większy instrument nie zawsze jest tańszy

Duży flow cell jest efektywny, jeśli można go wypełnić zgodnymi bibliotekami i zaakceptować czas oczekiwania na pulę. Mały run może szybciej odpowiedzieć na pytanie, ograniczyć batch i pozwolić zoptymalizować projekt.

Jak zaplanować run

  1. Zdefiniuj liczbę niezależnych próbek.
  2. Określ wymagane unikalne lub molekularne pokrycie.
  3. Oszacuj odsetek on-target i duplikację.
  4. Wybierz read length z insertu oraz celu.
  5. Ustal single-end czy paired-end.
  6. Zbuduj read structure.
  7. Sprawdź indeksy, orientację i balans.
  8. Oszacuj potrzebną różnorodną kontrolę.
  9. Wybierz pojemność z zapasem na filtrację.
  10. Zdefiniuj kryteria run-level i sample-level.
  11. Zaplanuj re-run lub re-pooling.
  12. Zapisz wersje chemii i basecallera.
Pokrycie planowane nie jest pokryciem uzyskanym

Jeśli potrzeba 30× unikalnego WGS, dzielenie rozmiaru genomu przez nominalny yield pomija:

  • filtrowanie;
  • duplikaty;
  • reads niemapowalne;
  • nierównomierność;
  • kontaminację;
  • różnice płci chromosomowej;
  • wykluczone regiony.

Plan musi uwzględnić sprawność całego łańcucha.

Jak czytać raport po runie

Najpierw poziom całego runu:

  • czy kontrola jest zgodna;
  • czy jakość spada normalnie;
  • czy występuje wzór przestrzenny;
  • czy loading jest w zakresie;
  • czy indeksy są czytelne.

Następnie próbka:

  • liczba reads;
  • przypisanie;
  • adaptery;
  • duplikaty;
  • złożoność;
  • kontaminacja;
  • mapowalność;
  • pokrycie celu.

Na końcu locus:

  • base qualities;
  • mapping qualities;
  • strand;
  • pozycja w read;
  • zgodność par;
  • lokalny kontekst;
  • niezależne cząsteczki.

Przeskok od Q30 runu do wniosku o wariancie pomija dwa poziomy.

Najczęstsze błędy

  1. „Sekwenator rozpoznaje litery DNA.” Mierzy sygnał i klasyfikuje go.
  2. „Klaster to wiele niezależnych cząsteczek.” To kopie jednej biblioteki.
  3. „Q30 to 99,9% pewności wariantu.” Dotyczy basecallu i wymaga kalibracji.
  4. „FASTQ to surowy sygnał.” Jest wynikiem basecallingu.
  5. „Niska jakość końca oznacza złą próbkę.” Może być phasing lub adapter read-through.
  6. „Większy loading zawsze zwiększa yield.” Przeładowanie obniża czystość.
  7. „Kontrola znana waliduje ekstrakcję.” Trafia do procesu za późno.
  8. „Balanced indices naprawiają low-diversity insert.” Dotyczą innych cykli.
  9. „Wysoki yield oznacza kompletne pokrycie.” Rozkład może być nierówny.
  10. „Paired-end to dwa niezależne dowody.” Są końcami jednego insertu.
  11. „Błąd o wysokim Q nie istnieje.” Model może być źle skalibrowany, a matryca uszkodzona.
  12. „Więcej krótkich reads rozwiąże każde powtórzenie.” Braku kontekstu nie zawsze da się nadrobić liczbą.

Co warto umieć po przeczytaniu

Czytelnik powinien potrafić:

  • nazwać fizyczny sygnał kilku klas platform;
  • wyjaśnić rolę klastra, DNB i studzienki;
  • opisać cykl reversible terminator SBS;
  • wyjaśnić phasing i spadek jakości;
  • przeliczyć Q na prawdopodobieństwo błędu;
  • odróżnić base, mapping i variant quality;
  • przeczytać rekord FASTQ;
  • zbudować read structure z R1, I1, I2 i R2;
  • rozpoznać adapter read-through;
  • wyjaśnić problem low diversity;
  • interpretować yield, Q30, occupancy i error rate razem;
  • rozdzielić problem biblioteki od przestrzennego błędu flow cell;
  • zaplanować demultipleksowanie i kontrolę;
  • dobrać pojemność runu do efektywnego pokrycia.

Literatura i źródła