GEO, SRA i Expression Atlas: gdzie trafiają dane omiczne

Jedno badanie może istnieć w kilku repozytoriach

W publikacji RNA-seq można znaleźć równocześnie identyfikator GEO zaczynający się od GSE, projekt PRJNA, BioSamples SAMN, eksperymenty SRX, runy SRR oraz rekord Expression Atlas E-GEOD albo E-MTAB. Nie oznacza to sześciu kopii tych samych danych.

Każdy zasób przechowuje inny poziom:

• GEO opisuje badanie genomiki funkcjonalnej, jego próbki, projekt porównań i wyniki przetworzone;
• SRA archiwizuje odczyty wysokoprzepustowego sekwencjonowania i techniczny model bibliotek oraz runów;
• Expression Atlas wybiera część publicznych badań, porządkuje metadane i ponownie analizuje je standardowym pipeline’em.

Typowy łańcuch dla RNA-seq wygląda tak:

publikacja → GSE → GSM → BioSample/SRX/SRR → FASTQ

oraz równolegle:

GSE lub ArrayExpress/BioStudies → kuracja Expression Atlas → znormalizowany wynik baseline albo differential

GEO odpowiada więc na pytanie „jak zaprojektowano i opisano eksperyment?”, SRA „jakie surowe odczyty powstały?”, a Expression Atlas „jaki porównywalny wynik ekspresji uzyskano po kuracji i ustandaryzowanej analizie?”.

Surowe, pośrednie i przetworzone

Słowo „dane” jest zbyt szerokie. Dla RNA-seq można wyróżnić:

1. surowy sygnał instrumentu;
2. basecalls i odczyty FASTQ;
3. oczyszczone lub przycięte odczyty;
4. uliniowienia BAM/CRAM;
5. zliczenia genów lub transkryptów;
6. wartości znormalizowane;
7. statystyki różnicowej ekspresji;
8. listę wybranych genów;
9. rycinę i interpretację.

SRA przechowuje przede wszystkim poziom odczytów i wybrane informacje o uliniowieniu. GEO dla badania sekwencyjnego wymaga danych surowych kierowanych do SRA oraz ilościowych wyników przetworzonych, np. macierzy zliczeń. Oficjalna instrukcja GEO odradza traktowanie BAM, SAM i zwykłego BED jako końcowych danych przetworzonych, ponieważ same nie dostarczają ilościowego podsumowania wspierającego wnioski.¹

Lista „top 100 differential genes” nie zastępuje pełnej macierzy. Nie pozwala sprawdzić genów odrzuconych, zastosować innego modelu ani skontrolować rozkładu sygnału.

„Raw counts” nie są surowymi odczytami

W analizie ekspresji zwrot raw counts oznacza zwykle nieznormalizowane liczby odczytów przypisanych do cech. Są one jednak wynikiem wielu decyzji:

• wersji genomu;
• anotacji genów;
• alignera lub pseudoalignera;
• parametrów;
• obsługi odczytów wielokrotnie mapujących;
• zliczania na poziomie genu lub transkryptu;
• reguł dla paired-end;
• filtrów jakości;
• strandedness.

Macierz counts jest „surowa” tylko względem późniejszej normalizacji statystycznej. Nie jest pierwotnym pomiarem instrumentu.

To rozróżnienie zapobiega dwóm błędom:

• pobraniu macierzy zamiast FASTQ do pełnej reanalizy;
• ponownemu przeliczeniu TPM, FPKM albo intensywności znormalizowanej jak zwykłych zliczeń w modelu wymagającym liczb całkowitych.

GSE, GSM, GPL i GDS

Podstawowe obiekty GEO:

• GPL — Platform: opis platformy, a dla mikromacierzy także tabeli sond;
• GSM — Sample: opis jednej jednostki zdeponowanej jako próbka oraz protokołów i wyniku;
• GSE — Series: badanie grupujące powiązane GSM;
• GDS — DataSet: wybrany i złożony przez kuratorów GEO zbiór porównywalnych próbek.

GEO definiuje GSE jako główny opis całego badania, GSM jako opis warunków i operacji dla próbki, a GPL jako platformę. Nie każda seria ma GDS; GDS jest dodatkowym, kuratorskim poziomem używanym przez część narzędzi GEO.²

GDS nie jest nowszą wersją GSE. To inny obiekt. Do pobierania aktualnych danych autora zwykle zaczyna się od GSE oraz plików supplementary.

GSM nie zawsze jest repliką biologiczną

Jeden GSM może odpowiadać:

• jednej biopsji;
• hodowli od jednego dawcy;
• puli materiału od kilku osobników;
• jednej bibliotece;
• kilku połączonym bibliotekom;
• jednemu capture w single-cell;
• grupie tysięcy komórek;
• jednemu czasowi dla tej samej hodowli.

GSM jest jednostką rekordu GEO, a nie uniwersalną definicją niezależności biologicznej.

Aby ustalić liczbę replik, trzeba odtworzyć:

• osobnika albo linię;
• jednostkę pobrania;
• pulowanie;
• bibliotekę;
• run;
• powtarzane pomiary;
• czas;
• batch;
• treatment.

Trzy SRR przypisane do jednego GSM mogą być technicznymi runami tej samej biblioteki. Trzy GSM mogą pochodzić od tego samego dawcy. Model statystyczny nie powinien liczyć rekordów bez poznania projektu.

SRA ma własną hierarchię

W SRA odczyty są osadzone w grafie:

BioProject → BioSample → experiment → run → pliki

Typowe accessiony NCBI:

• PRJNA… — BioProject;
• SAMN… — BioSample;
• SRP… — study SRA;
• SRS… — sample w modelu SRA;
• SRX… — experiment, zwykle biblioteka i platforma;
• SRR… — run, wykonanie sekwencjonowania.

SRA jest częścią INSDC i wymienia publiczne dane z ENA oraz DDBJ. Jego misją jest archiwizacja danych sekwencjonowania wysokoprzepustowego dla ponownego użycia i odtwarzalności.³

Nie każdy poziom odpowiada jeden do jednego obiektom GEO. Jedno GSM może łączyć się z kilkoma SRX i SRR. Jeden BioSample może mieć RNA-seq, ATAC-seq i WGS w osobnych eksperymentach. Trzeba przechowywać pełne mapowanie.

Macierz powinna mieć ścieżkę do runu

Dobra tabela projektowa ma wiersz dla biologicznej jednostki analizy i osobne kolumny:

GSE
GSM
BioProject
BioSample
SRX
SRR
subject
sample_source
condition
time
sex
batch
library
layout
platform
include
exclusion_reason

Jeśli jeden wiersz analityczny obejmuje kilka SRR, lista runów może być w osobnej tabeli relacyjnej. Nie należy wciskać wielu identyfikatorów do przypadkowego napisu bez parsera.

Ta tabela jest ważniejsza od nazw FASTQ. Plik control_1.fastq.gz nie mówi, czy to kontrola biologiczna, techniczna, untreated czy vehicle.

Pliki supplementary nie mają jednego standardu

Na dole rekordu GSE lub GSM można znaleźć:

• series matrix;
• macierz counts;
• TPM/FPKM;
• pliki znormalizowanych intensywności;
• listę pików;
• bigWig/bedGraph;
• obiekt R;
• tabelę wyników;
• pliki pojedynczych próbek;
• archiwum tar;
• notebook;
• plik zupełnie nieopisany.

Nazwy normalized.txt, final_matrix.csv i all_data.xlsx nie definiują semantyki. Trzeba ustalić:

• wiersze i kolumny;
• identyfikatory cech;
• jednostkę;
• transformację;
• normalizację;
• assembly;
• anotację;
• wartości brakujące;
• duplikaty;
• sposób połączenia plików.

Arkusz kalkulacyjny może zmienić symbole genów, daty albo długie identyfikatory. Pliki źródłowe zachowuje się w niezmienionej postaci, a konwersję wykonuje skryptem.

Series Matrix nie jest uniwersalną macierzą RNA-seq

Format Series Matrix powstał dla uporządkowanego eksportu metadanych i wartości związanych z serią. Może być wygodny dla mikromacierzy, ale w badaniach sekwencyjnych pełna macierz counts często znajduje się jako oddzielny plik supplementary.

Przed analizą trzeba sprawdzić:

• czy wartości są logarytmowane;
• czy zostały znormalizowane;
• czy reprezentują sondy, geny czy transkrypty;
• czy macierz obejmuje wszystkie GSM;
• czy kolumny zgadzają się z opisem próbek;
• czy plik został wygenerowany przez autora czy NCBI.

NCBI generuje własne macierze zliczeń dla części badań RNA-seq. Nie należy ich mieszać z plikami autora bez zapisania pochodzenia. FAQ GEO rozróżnia submitter-supplied processed files, surowe rekordy SRA i NCBI-generated RNA-seq counts.⁴

Mikromacierz wymaga platformy

W mikromacierzy identyfikator sondy nie jest genem. GPL opisuje:

• sekwencję lub nazwę sondy;
• pierwotne mapowanie;
• platformę;
• kolumny anotacji;
• organizm.

Stara sonda może:

• mapować do kilku genów;
• trafiać w nieaktualny model;
• rozpoznawać kilka transkryptów;
• nie pasować do aktualnego assembly;
• zawierać wariant wpływający na hybrydyzację.

Ponowna analiza wymaga decyzji, czy użyć historycznej anotacji GPL dla odtwarzania publikacji, czy współczesnego remappingu dla nowego pytania. Wyniki obu analiz mogą się różnić i obie wymagają opisania.

FASTQ jest początkiem, nie gotowym eksperymentem

Pobranie runów nie odtwarza automatycznie badania. Przed alignerem trzeba znać:

• organizm;
• layout single-end lub paired-end;
• długość odczytów;
• strandedness;
• strategię biblioteki;
• selekcję RNA, np. poly(A) lub depletion;
• UMI;
• barcode;
• sposób multipleksowania;
• adaptery;
• genom i anotację;
• techniczne runy należące do jednej biblioteki.

SRA metadata bywają niepełne albo niespójne z publikacją. Konflikt trzeba zapisać i rozstrzygnąć na podstawie kilku źródeł, a czasem samych odczytów.

Przykład: pipeline może zgłosić niską zgodność, ponieważ biblioteka jest stranded, ale parametr ustawiono odwrotnie. To nie problem „słabych danych”, tylko brakującej lub źle odczytanej metadanej.

Pobieranie wymaga manifestu

Dla każdego runu zachowuje się:

• accession;
• źródłowy URL albo metodę pobrania;
• format;
• rozmiar;
• checksumę;
• datę pobrania;
• wersję SRA Toolkit lub innego klienta;
• parametry konwersji;
• wynik weryfikacji.

prefetch i fasterq-dump mogą tworzyć inne pliki niż bezpośredni FASTQ z ENA. Nie musi to oznaczać różnicy biologicznej, ale pliki nie są automatycznie identyczne bajtowo. Pipeline powinien wskazywać, którą reprezentację wykorzystano.

Przy paired-end sprawdza się:

• kompletność R1 i R2;
• zgodność liczby rekordów;
• kolejność identyfikatorów;
• obecność orphan reads;
• sposób zapisu odczytów technicznych;
• czy FASTQ nie został już przycięty.

Jakość techniczna i jakość projektu

FastQC może wykryć:

• jakość zasad;
• adaptery;
• skład nukleotydów;
• duplikację;
• nadreprezentowane sekwencje;
• długość odczytów.

Nie wykryje sam:

• pomylonych etykiet treatment/control;
• braku niezależnych replik;
• confounding batch–condition;
• błędnej tkanki;
• kontaminacji między podobnymi próbkami bez analizy;
• niezgodnej zgody uczestników;
• złego pytania biologicznego.

Do reanalizy potrzebne są co najmniej trzy osie jakości:

1. plik i odczyty;
2. próbka i biblioteka;
3. projekt eksperymentalny.

Metadane są częścią danych

Minimalny opis próbki obejmuje zwykle:

• organizm i TaxID;
• tkankę lub typ komórki;
• osobnika, linię, szczep lub odmianę;
• płeć, wiek i stan, jeśli relewantne;
• warunek i dawkę;
• czas;
• sposób pobrania;
• ekstrakcję;
• przygotowanie biblioteki;
• platformę;
• batch;
• relacje między próbkami.

Standardy MIAME i MINSEQE powstały po to, aby dane można było interpretować i odtworzyć. Aktualna instrukcja GEO dla sekwencjonowania wymaga dokładnych opisów próbek i protokołów, końcowych danych przetworzonych oraz oryginalnych odczytów kierowanych do SRA.⁸

Formalne wypełnienie pola nie gwarantuje jakości. source_name = sample, treatment = treated i growth protocol = standard są prawie bezużyteczne.

Metadane mogą być rozsiane

Pełna informacja może znajdować się w:

• tytule GSM;
• characteristics;
• protokole extraction;
• protokole treatment;
• tabeli supplementary;
• publikacji głównej;
• supplementach czasopisma;
• BioSample;
• RunInfo;
• nazwie pliku;
• repozytorium kodu.

Nie należy przepisywać metadanych bez zachowania źródła. Dobra tabela ma kolumny:

field
value
source
access_date
confidence
note

Jeżeli publikacja mówi „three donors”, a GEO ma sześć GSM bez identyfikatora dawcy, nie wolno zgadywać parowania. Brak relacji dawca–próbka jest ograniczeniem.

Batch effect nie zawsze da się naprawić

Jeśli wszystkie kontrole wykonano w pierwszej partii, a wszystkie treated w drugiej, batch i condition są całkowicie splątane. Żaden algorytm nie rozdzieli ich bez dodatkowych informacji.

Przed pobraniem dużych plików warto zbudować tabelę:

Próbka	Condition	Donor	Batch	Lane	Sex	Time

Następnie sprawdzić:

• czy każda grupa występuje w kilku batchach;
• czy dawcy mają sparowane warunki;
• czy czas jest zrównoważony;
• czy lane pokrywa się z grupą;
• czy jedna platforma nie odpowiada jednej klasie.

Korekta batch ma sens przy częściowym nakładaniu informacji. Przy doskonałym confounding zmienia problem, ale nie odzyskuje utraconego projektu.

Expression Atlas nie jest lustrem GEO

Expression Atlas wybiera badania z publicznych repozytoriów, ręcznie kuratuje metadane, mapuje terminy do ontologii i ponownie analizuje dane standardowymi metodami. Jest zasobem wtórnym, a nie magazynem wszystkich zgłoszeń.

Według dokumentacji wybierane zbiory powinny mieć m.in. dobry genom referencyjny, jasne zmienne eksperymentalne oraz co najmniej trzy repliki biologiczne; mikromacierze muszą nadawać się do ponownej anotacji względem Ensembl.⁵

Brak GSE w Expression Atlas nie oznacza, że badanie jest nieważne. Może nie spełniać kryteriów, jeszcze nie zostać wybrane albo należeć do typu danych poza zakresem.

Baseline i differential

Expression Atlas rozdziela dwa sposoby pytania.

Baseline expression

Odpowiada na pytania:

• gdzie gen jest eksprymowany;
• w jakich tkankach lub typach komórek;
• na jakim względnym poziomie w obrębie badania.

Baseline dotyczy zwykle warunków normalnych lub untreated i jest prezentowany jako poziom ekspresji.

Differential expression

Odpowiada na pytania:

• co zmienia się między warunkami;
• jaki jest kierunek i wielkość zmiany;
• jaka jest statystyczna siła wyniku;
• które porównanie zostało zdefiniowane.

Fold change bez nazwy kontrastu jest niepełny. +2 może oznaczać treatment względem control albo odwrotnie, zależnie od definicji.

Ustandaryzowana reanaliza ma zalety i koszty

Expression Atlas analizuje wybrane dane RNA-seq pipeline’em iRAP, a mikromacierze odpowiednimi narzędziami Bioconductor.⁶

Zalety:

• porównywalna procedura;
• jawne mapowanie genów;
• kuracja zmiennych;
• łatwe wyszukiwanie między badaniami;
• dostęp do macierzy i statystyk;
• kontrolowana wizualizacja.

Koszty:

• wynik może różnić się od publikacji autora;
• pipeline ma własną wersję genomu i anotacji;
• parametry nie muszą odpowiadać pierwotnemu pytaniu;
• niestandardowe etapy autora mogą zostać pominięte;
• aktualizacja zasobu może zmienić wynik;
• ujednolicenie nie usuwa batch effects między badaniami.

Atlas jest dobry do eksploracji i powtarzalnych porównań, ale dla krytycznego wniosku trzeba wrócić do rekordu źródłowego i dokumentacji przetwarzania.

TPM nie służy do wszystkiego

TPM normalizuje długość cechy i głębokość biblioteki, co ułatwia opis względnej obfitości. Nie jest jednak automatycznie odpowiednią macierzą wejściową do wszystkich testów różnicowej ekspresji.

Problemy:

• zależność kompozycyjna;
• różne anotacje i długości transkryptów;
• sumowanie transkryptów do genów;
• wpływ bardzo silnie eksprymowanych genów;
• brak modelu wariancji counts;
• nieporównywalność między pipeline’ami.

Do DESeq2 i edgeR zwykle potrzebne są nieznormalizowane counts wraz z projektem próbek. Znormalizowane wartości mogą służyć do wizualizacji, ale trzeba znać metodę.

FPKM, RPKM, TPM, CPM, log2 intensity i z-score nie są wymiennymi jednostkami. Heatmapa może przedstawiać wartości przeskalowane wierszami, przez co kolorów nie wolno czytać jako absolutnej różnicy ekspresji między genami.

Macierz counts potrzebuje anotacji

Identyfikator wiersza może być:

• Ensembl gene;
• Ensembl transcript;
• Entrez Gene;
• symbol;
• RefSeq;
• identyfikator sondy;
• feature ID autora.

Przed połączeniem macierzy sprawdza się:

• wersję anotacji;
• suffix wersji Ensembl;
• duplikaty symboli;
• geny wycofane;
• pseudogeny;
• poziom gene/transcript;
• organizm;
• mapping many-to-many.

Zamiana identyfikatorów na symbole może scalić kilka wierszy. Taki krok wymaga reguły agregacji i raportu strat. Symbol jest etykietą, nie stabilnym kluczem.

Single-cell dodaje kolejne poziomy

W single-cell RNA-seq jeden GSM często opisuje bibliotekę lub capture, a nie pojedynczą komórkę. Pliki przetworzone mogą obejmować:

• matrix.mtx;
• barcodes.tsv;
• features.tsv;
• obiekt h5;
• h5ad;
• Seurat RDS;
• tabelę metadanych komórek;
• embedding UMAP;
• cluster annotations.

Do odtworzenia potrzebne są:

• raw i filtered matrices;
• wersja reference/transcriptome;
• whitelist barcode;
• kryteria filtrowania komórek;
• próg mitochondrialny;
• doublet detection;
• sposób normalizacji;
• batch integration;
• markery i reguły anotacji;
• mapa komórka–dawca–warunek.

UMAP nie jest danymi surowymi. To zależna od parametrów projekcja. Etykieta typu komórki jest interpretacją, nie pomiarem instrumentu.

GEO wymaga dla badań single-cell zarówno danych surowych, jak i przetworzonych, a FASTQ jest preferowane m.in. dla danych 10x, aby mogły zostać poprawnie zarchiwizowane w SRA.⁹

ChIP-seq i ATAC-seq nie kończą się na BAM

Dla danych epigenomicznych wynik przetworzony powinien umożliwiać odtworzenie wniosków:

• peak calls z miarą ilościową;
• bigWig/bedGraph sygnału;
• consensus peaks;
• informację o replikach;
• assembly;
• blacklist;
• narzędzie i parametry;
• control/input;
• normalizację.

Lista pików bez informacji o assembly jest prawie bezużyteczna. BigWig pozwala oglądać sygnał, ale nie zawiera automatycznie projektu statystycznego. BAM jest etapem pośrednim, z którego można policzyć inny wynik.

Kontrolowany dostęp nie jest brakiem danych

Dane ludzkie mogą nie nadawać się do publicznego SRA. Sekwencja jest potencjalnie identyfikująca, a metadane kliniczne zwiększają ryzyko reidentyfikacji.

W zależności od zgody i projektu dane trafiają do:

• dbGaP i controlled-access SRA;
• European Genome-phenome Archive;
• innych autoryzowanych repozytoriów.

Rekord publiczny może pokazywać opis badania, ale pliki wymagają:

• wniosku;
• zatwierdzenia celu;
• umowy użycia danych;
• odpowiedniej infrastruktury;
• ograniczeń dalszego udostępniania;
• raportowania.

Nie należy obchodzić kontrolowanego dostępu przez szukanie kopii w przypadkowych serwisach. Brak uprawnienia jest ograniczeniem prawnym i etycznym, nie problemem technicznym.

SRA podkreśla odpowiedzialność zgłaszających za zgodę na publiczne udostępnienie ludzkich sekwencji oraz możliwość użycia dbGaP dla danych kontrolowanych.¹⁰

Jak wybierać zbiór do reanalizy

Ocena wstępna:

1. Czy pytanie biologiczne pasuje do projektu?
2. Czy są niezależne repliki?
3. Czy condition nie jest całkowicie splątane z batch?
4. Czy istnieją surowe dane?
5. Czy istnieje pełna macierz?
6. Czy próbki mają wystarczające metadane?
7. Czy publikacja opisuje pipeline?
8. Czy wariant platformy i organizm są obsługiwane?
9. Czy dostęp jest zgodny z licencją i zgodą?
10. Czy rozmiar danych mieści się w zasobach?

Dobry mały zbiór z jawnym projektem jest lepszy do portfolio niż ogromny atlas bez możliwości rozdzielenia próbek.

Reprodukcja a reanaliza

Reprodukcja obliczeniowa próbuje odtworzyć wynik autora:

• historyczne assembly;
• ta sama anotacja;
• podobne wersje narzędzi;
• te same wykluczenia;
• te same kontrasty.

Reanaliza odpowiada na nowe pytanie:

• nowszy genom;
• jednolity pipeline;
• poprawione metadane;
• nowa metoda;
• połączenie badań.

Nie należy mieszać celów. Jeśli zmieniono anotację i filtry, różnica od publikacji nie jest automatycznie błędem autora. Raport powinien rozdzielić wierną rekonstrukcję od świadomej aktualizacji.

Łączenie badań nie polega na sklejeniu macierzy

Dwa GSE mogą różnić się:

• tkanką;
• przygotowaniem RNA;
• platformą;
• długością i układem odczytów;
• genomem;
• anotacją;
• batch;
• demografią;
• definicją choroby;
• czasem pobrania.

Sklejenie TPM i wykonanie t-testu może mierzyć różnicę technologiczną.

Bezpieczniejsze podejścia:

• reanaliza FASTQ jednym pipeline’em;
• metaanaliza efektów w obrębie badań;
• modele z badaniem jako czynnikiem;
• walidacja w niezależnym zbiorze;
• analiza czułości;
• jawne ograniczenie do porównywalnych próbek.

Expression Atlas ułatwia znalezienie powtarzających się sygnałów, ale ustandaryzowany pipeline nie usuwa różnic projektu i materiału.

Najczęstsze braki i ich konsekwencje

Brak	Czego nie można pewnie zrobić
brak mapy GSM–SRR	przypisać odczytów do warunków
brak dawcy	ustalić niezależnych replik i parowania
brak strandedness	poprawnie zliczyć nakładające się geny
brak assembly	interpretować pików i wariantów
brak anotacji	odtworzyć macierzy cech
tylko TPM	uruchomić części modeli counts-based
tylko lista DE genes	ponownie zdefiniować kontrastu
brak batch	oddzielić biologii od technologii
brak raw data	zmienić pipeline i przeprowadzić pełne QC
brak processed data	szybko odtworzyć wynik autora
brak fazy/pulowania	ustalić jednostkę statystyczną
kontrolowany dostęp	pobrać danych bez autoryzacji

Brakujące pole powinno być jawnie oznaczone jako unknown, nie wypełnione domysłem.

Diagnostyka pobranego badania

Objaw	Możliwa przyczyna	Test
liczba GSM różni się od kolumn macierzy	wykluczenia lub osobne typy danych	porównaj nagłówki z sample table
jeden GSM ma kilka SRR	lanes albo powtórne sekwencjonowanie	sprawdź wspólny SRX i bibliotekę
FASTQ jest single-end mimo paired	pobrano tylko R1 albo zły split	sprawdź RunInfo i layout
symbole genów zamieniły się w daty	arkusz kalkulacyjny	wróć do niezmienionego pliku
PCA dzieli próbki według platformy	batch silniejszy niż warunek	zbuduj tabelę projektu
counts są ułamkowe	plik jest znormalizowany lub estymowany	przeczytaj metodę i jednostkę
suma TPM nie jest równa milion	agregacja lub inna definicja	sprawdź poziom cech i pipeline
publikacja ma więcej próbek	część danych w innym GSE lub controlled access	prześledź wszystkie accessiony
atlas i autor mają różne DE genes	inny pipeline, anotacja lub kontrast	porównaj wersje i macierz projektu
brak wariantu w surowych danych	zły run albo jakość	zweryfikuj mapowanie próbka–run
nie można pobrać publicznego SRR	status, mirror lub narzędzie	sprawdź ENA, status i log klienta
brakuje metadanych klinicznych	ograniczenia prywatności	nie imputuj bez podstawy

Workflow reanalizy krok po kroku

1. Zamroź identyfikatory

Zapisz DOI/PMID, GSE, wszystkie GSM, BioProject, BioSamples, SRX i SRR oraz datę dostępu.

2. Pobierz metadane przed FASTQ

Zbuduj tabelę próbek. Odrzuć zbiór albo ogranicz pytanie, jeśli projektu nie da się odtworzyć.

3. Zachowaj źródła

Archiwizuj SOFT, Series Matrix, supplementary, RunInfo, strony BioSample i tekst metod. Dodaj checksumy.

4. Zdefiniuj jednostkę

Ustal, czy modelem jest dawca, biopsja, hodowla, biblioteka czy komórka. Techniczne runy połącz zgodnie z projektem.

5. Wykonaj pilotaż

Pobierz po jednym runie z każdej klasy. Sprawdź format, rozmiar, organizm, layout, jakość i spodziewany sygnał.

6. Pobierz całość

Użyj manifestu i automatycznych retry. Weryfikuj checksumy i komplet par.

7. Przetwórz od surowych danych

Zapisz środowisko, genom, anotację, parametry i logi. Nie nadpisuj danych źródłowych.

8. Porównaj z processed data

Sprawdź korelację, liczbę cech, wykluczenia, skalę i kierunek kontrastów. Różnicę wyjaśnij, nie ukrywaj.

9. Analizuj zgodnie z projektem

Uwzględnij parowanie, batch, czas i powtarzane pomiary. Oddziel eksplorację od testu hipotezy.

10. Opublikuj manifest

Udostępnij identyfikatory, tabelę próbek, kod, wersje, raport QC, wykluczenia i wynik.

Co pobierać z Expression Atlas

Z zakładki downloads można uzyskać, zależnie od typu eksperymentu:

• wyniki ekspresji baseline;
• RNA-seq raw counts;
• znormalizowane intensywności mikromacierzy;
• wszystkie wyniki testów differential;
• obiekty R;
• informacje o projekcie.

Oficjalny tutorial wymienia raw counts dla differential RNA-seq oraz komplet statystyk porównań, a dla baseline tabelaryczne wyniki ekspresji.⁷

Po pobraniu sprawdź:

• accession źródłowego eksperymentu;
• release Atlas;
• datę analizy;
• wersję genomu i anotacji;
• faktory eksperymentalne;
• definicje kontrastów;
• filtry;
• wartości brakujące;
• znaczenie jednostki.

Widok heatmapy jest streszczeniem. Plik wynikowy jest wejściem do dalszej analizy.

Jak cytować i raportować

Minimalny zapis metody:

Dane RNA-seq pobrano dla GSE…, BioProject PRJNA…, runy SRR… w dniu …. Metadane GSM–BioSample–SRR zapisano w tabeli …. FASTQ uzyskano narzędziem … wersja …; checksumy znajdują się w manifeście. Odczyty przetworzono względem assembly … i anotacji …. Próbkę … wykluczono przed analizą z powodu …. Wynik autora porównano z plikiem supplementary …, a wynik Expression Atlas z rekordem …, release ….

Należy cytować:

• publikację opisującą badanie;
• rekord GEO/SRA;
• Expression Atlas, jeśli użyto jego kuracji lub reanalizy;
• narzędzia;
• referencyjny genom i anotację.

Sam accession nie opisuje transformacji danych.

Checklista reusable

• [ ] GSE ma opis celu i projektu;
• [ ] każdy GSM ma materiał, warunek i protokół;
• [ ] mapa GSM–BioSample–SRX–SRR jest kompletna;
• [ ] niezależne repliki są rozpoznane;
• [ ] surowe dane są dostępne albo jawnie kontrolowane;
• [ ] processed data zawierają pełny ilościowy wynik;
• [ ] jednostka macierzy jest podana;
• [ ] assembly i anotacja mają wersje;
• [ ] batch i parowanie są opisane;
• [ ] pliki mają checksumy;
• [ ] kod i środowisko są wersjonowane;
• [ ] wykluczenia mają uzasadnienia;
• [ ] prywatność i warunki dostępu są zachowane;
• [ ] można przejść od wyniku do próbki i runu.

Najkrótsza mapa

GEO przechowuje:

projekt, próbki, protokoły i wyniki przetworzone

SRA przechowuje:

biblioteki, runy i odczyty

Expression Atlas dostarcza:

wybrane, kuratowane i ponownie przeanalizowane wyniki ekspresji

Pełna reanaliza wymaga wszystkich trzech warstw: biologicznego projektu, surowego pomiaru i jawnego przetwarzania. Największym ograniczeniem często nie jest brak terabajtów, lecz brak jednej kolumny mówiącej, od którego dawcy pochodzi próbka.

Przypisy