Mieszaniny DNA, drop-in, drop-out i artefakty

Streszczenie

Mieszanina DNA zawiera mierzalny wkład co najmniej dwóch osób. Nie zawsze wygląda jak las pików: jeśli dawcy dzielą allele, profil może mieć w locus tylko jedną lub dwie wartości. Z kolei więcej niż dwa piki nie zawsze oznacza więcej niż jedną osobę, ponieważ istnieją stutter, pull-up, niepełna adenylacja, warianty liczby kopii i inne artefakty.

Liczba dawców jest wnioskiem modelowym. Minimalna liczba wynikająca z liczby alleli to dolna granica, a nie automatycznie prawdziwa wartość. Współdzielenie alleli, dropout i degradacja mogą ukrywać dawcę. Dropout oznacza niewykrycie allelu lub całego locus rzeczywistego dawcy. Drop-in opisuje dodatkowy allel niewyjaśniony przez założonych dawców, często modelowany jako rzadkie zdarzenie; nie jest synonimem każdej wieloallelicznej mieszaniny ani pełnej kontaminacji.

Interpretacja musi zachować rozróżnienie między obserwacją a wyjaśnieniem. Pik ma położenie, kanał, wysokość i kształt. Dopiero zwalidowane reguły lub model oceniają, czy wkład pochodzi od allelu, stutter, pull-up, drop-in czy kombinacji. Pik w pozycji stutter może jednocześnie zawierać prawdziwy allel minor contributor.

W prostym, pełnym profilu można czasem przeprowadzić jakościową dekonwolucję major/minor. Przy małej ilości, wielu dawcach, allele sharing, dropout i nierównowadze deterministyczne „odejmowanie” profilu osoby odniesienia jest niebezpieczne. Właściwa ocena porównuje prawdopodobieństwo całych danych przy dwóch propozycjach, obejmując niepewność genotypów, wysokości pików, stutter, dropout i drop-in.

Mieszanina jest własnością próbki i assay

Próbka fizyczna może zawierać materiał wielu osób, ale assay wykryje tylko część. Jeśli wkład jednego dawcy jest poniżej czułości, wynik może wyglądać jak profil pojedynczy. Odwrotnie, biologiczny profil jednej osoby może wyglądać nietypowo wskutek trisomii, chimeryzmu, przeszczepu lub artefaktu.

Najbezpieczniejsze zdanie:

Dane z badanego ekstraktu są zgodne z obecnością mierzalnych wkładów co najmniej określonej liczby dawców w granicach użytego systemu.

Nie należy bezwarunkowo mówić „na przedmiocie były trzy osoby”. Wymaz obejmuje określoną strefę, wynik ma próg, a allele mogą pochodzić z tła lub kontaminacji.

NIST definiuje interpretację mieszanin jako problem łączący pomiar, liczbę dawców, genotypy, stutter, dropout, drop-in, propozycje i ocenę statystyczną. Finalny przegląd NISTIR 8351 z 2024 roku analizuje zarówno niezawodność metod, jak i ich związek z istotnością dowodu.¹

Co widać w pojedynczym locus

Dla autosomalnego diploidalnego STR jedna osoba ma zwykle najwyżej dwa allele. Dwie osoby mogą dać od jednego do czterech różnych alleli:

A: 10,12
B: 12,14
mieszanina: 10,12,14

Trzy piki nie oznaczają, że wspólny allel 12 ma jednego właściciela. Obaj dawcy wnoszą produkty w tej samej pozycji. Wysokość 12 może być sumą.

Inny przykład:

A: 10,12
B: 10,12
mieszanina: 10,12

Dwie osoby tworzą obraz zgodny z jednym heterozygotą. Liczby dawców nie da się wyznaczyć z jednego locus bez innych danych.

Allele sharing i stacking

Współdzielenie alleli zwiększa wysokość wspólnego piku. Nazywa się to allele stacking. Prosty podział „wysoki pik = major, niski = minor” może źle przypisać wspólny allel.

Jeśli major 10,12 i minor 12,14, pik 12 ma wkład obu. Mixture proportion estymuje się z wielu loci i modelu, nie przez jedną parę.

Pokrewieństwo zwiększa oczekiwane allele sharing. Mieszanina rodzeństwa może mieć mniej różnych alleli niż mieszanina niespokrewnionych osób. Założenie niespokrewnionych dawców może wpływać na oszacowanie liczby i LR.

Minimalna liczba dawców

Klasyczna dolna granica wynika z maksymalnej liczby alleli:

minimum contributors ≥ ceil(max allele count / 2)

Sześć alleli w prawidłowym autosomalnym locus wymaga zwykle co najmniej trzech diploidalnych dawców. Ale trzy allele wymagają co najmniej dwóch, nie dokładnie dwóch.

Reguła ma wyjątki i ograniczenia:

• stutter lub pull-up nie może być policzony jak allel;
• trisomia może dać trzy allele jednej osoby;
• locus wielokopijne ma inną biologię;
• dropout ukrywa allele;
• dawcy dzielą allele;
• mikrovariant i off-ladder wymagają potwierdzenia.

Minimalna liczba jest punktem startowym.

Number of contributors jako model

NOC ocenia się z całego profilu:

• liczby alleli per locus;
• wysokości i proporcji;
• allele sharing;
• stutter;
• degradacji;
• dropout;
• liczby loci;
• założonego pokrewieństwa;
• ilości DNA;
• typu próbki.

Można porównywać modele 2, 3, 4 dawców. Najlepiej dopasowany nie musi być pewny, jeśli kilka ma podobne wsparcie. Raport może wskazać zakres albo przeprowadzić sensitivity analysis.

Zbyt mały NOC wymusza wyjaśnianie prawdziwych alleli jako drop-in i pogarsza dopasowanie. Zbyt duży daje modelowi nadmierną elastyczność oraz genotypy niewspierane wyraźnym sygnałem.

NIST prowadzi badania nad NOC, progami, wynikami software’u i walidacją mieszanin, udostępniając także materiały o znanych składach.²

Major i minor

Mieszanina ma wyraźnego major contributor, jeśli w wielu loci zestaw wysokich pików tworzy spójny genotyp, a pozostałe są znacznie niższe. Minor może być pojedynczy lub złożony.

Warunki dekonwolucji:

• wystarczająca różnica proporcji;
• mały dropout major;
• spójność między loci;
• brak przeładowania;
• właściwe traktowanie wspólnych alleli;
• zwalidowane granice.

Przy zbliżonych proporcjach nie ma stabilnego major/minor. Przy degradacji proporcja może zmieniać się wraz z długością. W mieszaninie trzech osób „minor” może obejmować dwóch dawców.

Słowo major nie oznacza głównego sprawcy, pierwszego kontaktu ani największej osoby. Dotyczy względnego sygnału DNA.

Mixture proportion

Proporcja opisuje udział sygnału lub template przypisany dawcy. Nie jest dokładnym procentem komórek ani masy pierwotnego śladu.

Wpływają na nią:

• sampling aliquotu;
• wydajność locus;
• allele sharing;
• degradacja;
• stutter;
• iniekcja;
• saturation;
• bias primerów;
• różne typy komórek.

Model ciągły estymuje proporcje jako parametry ze zmiennością. Wynik ma rozkład lub przedział, nie jedną bezbłędną wartość.

Dropout alleliczny

Allele dropout występuje, gdy prawdziwy allel dawcy nie daje raportowalnego sygnału. Przyczyny:

• mała liczba kopii;
• nierówne próbkowanie;
• degradacja;
• inhibicja;
• wariant pod primerem;
• konkurencja w multiplexie;
• próg;
• awaria locus.

Heterozygota 10,12 może wyglądać jak 10. Jeśli oba allele locus wypadają, mamy locus dropout.

Dropout nie jest etykietą piku. Jest zdarzeniem niewidocznym w danych i wnioskowanym w modelu. Można go badać tylko na próbkach o znanym ground truth.

Prawdopodobieństwo dropout

Pr(D) zależy od:

• wysokości innych pików dawcy;
• ilości wejścia;
• długości amplikonu;
• degradacji;
• locus;
• mixture proportion;
• parametrów assay;
• progu.

Nie powinno być ustawiane ręcznie tak, aby dopasować profil osoby. Modele półciągłe używają Pr(D) z walidacji, często zależnego od szczytu lub ilości. Modele ciągłe integrują dropout z rozkładem wysokości.

Jeśli silne piki dawcy są obecne w całym profilu, potrzeba dropout jednego krótkiego, dobrze działającego allelu może być mało prawdopodobna. Jeśli minor jest blisko progu, jest bardziej oczekiwana.

Dropout a wykluczenie

Niezgodność między kandydatem a śladem może:

• wykluczyć;
• być wyjaśniona przez dropout;
• wynikać z mutacji;
• wskazywać błąd próbki;
• pozostać nierozstrzygająca.

Nie wolno uznawać każdej niezgodności za dropout. Model musi ponieść karę probabilistyczną. Jeśli do utrzymania kandydata potrzeba wielu dropoutów mimo silnego minor profile, LR może spaść poniżej 1.

ISFG zaleca probabilistyczne uwzględnienie drop-out i drop-in w LR zamiast arbitralnego odrzucania profili niskopoziomowych.³

Drop-in

Drop-in to dodatkowy allel niewyjaśniony przez genotypy rozważanych dawców i modelowane artefakty. Może pochodzić z:

• tła;
• kontaminacji;
• drobnego niezałożonego dawcy;
• przeniesienia między próbkami;
• błędu instrumentu błędnie sklasyfikowanego;
• sporadycznego sygnału.

Historyczne modele ograniczały drop-in do jednego lub dwóch alleli w profilu. Jeśli dodatkowe allele występują systematycznie w wielu loci, bardziej naturalny jest dodatkowy dawca.

Pr(DI) estymuje się z negatywnych kontroli i danych procesu, ale blanki mogą nie reprezentować tła dowodów. Model drop-in nie jest licencją na ignorowanie kontaminacji.

Drop-in a drop-out razem

W locus obserwujemy 10,14, a kandydat ma 10,12. Model może wyjaśnić:

• 10 od kandydata;
• 12 jako dropout;
• 14 jako drop-in.

To możliwe, ale wymaga dwóch rzadkich zdarzeń. LR uwzględnia ich prawdopodobieństwo. Narracja „jeden pasuje, drugi mógł wypaść, a trzeci wejść” bez liczb i walidacji jest asymetrycznym ratowaniem kandydata.

Alternatywa też może wymagać dropout/drop-in. LR porównuje oba modele, nie ocenia tylko oskarżenia.

Locus dropout

Brak całego locus może wynikać z:

• dużej długości produktu w zdegradowanym DNA;
• obu alleli poniżej progu;
• inhibicji;
• problemu primerów;
• awarii konkretnego kanału;
• nieprawidłowego binu;
• null alleles;
• problemu instrumentu.

Wzorzec wielu długich loci wspiera degradację. Pojedynczy krótki locus bez sygnału przy silnym profilu wymaga kontroli assay.

Nie wypełnia się brakującego locus profilem odniesienia.

Stutter w mieszaninie

Stutter jest produktem PCR związanym z allelem macierzystym. Najczęstszy n−1 ma pozycję o jedną jednostkę powtórzeniową krótszą. Występują też n+1, n−2.

W mieszaninie pik może mieć dwa źródła:

allele major 14 → stutter 13
allele minor 13 → prawdziwy allel 13

Usunięcie całego piku zabiera minor. Uznanie całości za allel zawyża minor. Model ciągły przewiduje stutter od 14 i dodatkowy wkład 13.

Stutter ratios są locus-, allele- i system-specific. Wysoki pik powyżej typowego progu nie przestaje mieć składowej stutter.

Back stutter, forward stutter i double stutter

Nomenklatura:

• n−1 — back stutter;
• n+1 — forward stutter;
• n−2 — double-back;
• inne — zależne od struktury.

W złożonych STR pozycja rozmiarowa może odpowiadać kilku ścieżkom poślizgu. Sekwencjonowanie rozróżnia sekwencje, ale PCR nadal generuje rodziny produktów.

Walidacja powinna obejmować rzadkie typy wystarczająco silne, aby wpływać na mieszaniny.

Pull-up

Pull-up to bleed-through sygnału między kanałami po niedoskonałym rozdziale widm, często przy silnym piku lub nasyceniu.

Wskazówki:

• identyczny czas migracji;
• silny parent peak;
• kilka kanałów;
• zależność wysokości;
• kształt;
• problemy spectral calibration.

Pull-up może leżeć w binie prawdziwego allelu. Pozycja sama nie rozstrzyga. Reiniekcja po rozcieńczeniu może potwierdzić, lecz powinna być procedurowa.

Minus-A i inne produkty PCR

Niepełna adenylacja daje produkt o jedną zasadę krótszy, często jako split peak. Nie jest stutter, bo przesunięcie wynosi jedną zasadę, a nie motyw.

Inne zjawiska:

• nontemplated addition;
• produkty nieswoiste;
• primer dimers;
• heterodupleksy;
• allele-specific amplification;
• saturation;
• dye blob.

Każde ma mechanizm i oczekiwany wzorzec. Kategoria „artefakt” nie powinna ukrywać niepewności.

Spike i zjawiska instrumentalne

Spike jest bardzo wąski i często pojawia się jednocześnie w wielu kanałach. Baseline może falować, a capillary failure dać brak standardu.

Jeśli pik:

• ma prawidłowy kształt;
• mieści się w binie;
• występuje w jednym kanale;
• powtarza się po ponownej amplifikacji;

jest trudniej wyjaśnić go spike. Analiza opiera się na wielu cechach.

W NISTIR 8351 tabela czynników pomiarowych obejmuje pozycję, morfologię, wysokość, stutter i artefakty widmowe oraz wskazuje potrzebne eksperymenty walidacyjne.

Analytical threshold i censored data

Piki poniżej analytical threshold nie są wiarygodnie odróżniane od szumu. To nie znaczy, że sygnału biologicznego tam nie ma.

W binarnym podejściu dane są cenzurowane:

• powyżej — obecny;
• poniżej — niewykorzystany.

Model ciągły również działa na danych po preprocessing i progu, ale uwzględnia wysokości powyżej. Próg wpływa na dropout i drop-in.

Zmiana threshold po zobaczeniu profilu odniesienia jest niedopuszczalna. W validation data muszą być identyczne reguły.

Peak height balance

Heterozygota ma dwa allele o podobnym oczekiwanym wkładzie, ale stochastic sampling tworzy nierównowagę. Peak height ratio:

PHR = lower peak / higher peak

Przy dużym template PHR jest zwykle wyższy i stabilniejszy. Przy niskim spada i może przejść w dropout.

W mieszaninie nie każdy pik paruje się oczywiście. Współdzielenie i stutter utrudniają PHR. Nie stosuje się progu pojedynczego źródła bezpośrednio do minor.

Odczyt elektroferogramu w stałej kolejności

Interpretacja nie powinna zaczynać się od szukania alleli osoby podejrzanej. Stabilna kolejność:

1. sprawdź standard wielkości i jakość iniekcji;
2. sprawdź drabinę i kontrolę dodatnią;
3. sprawdź kontrole ujemne oraz blanki;
4. oceń linię bazową, saturation i spectral artifacts;
5. zastosuj panel, biny i analytical threshold;
6. sklasyfikuj oczywiste artefakty niezależnie od kandydatów;
7. oceń degradację oraz inhibicję;
8. ustal allele i cechy mieszaniny;
9. oszacuj NOC i zakres niepewności;
10. dopiero potem ujawnij profile porównawcze.

Ta kolejność nie usuwa całego biasu, ale sprawia, że decyzje mają timestamp i podstawę. Jeśli profil odniesienia powoduje powrót do danych, zmiana powinna być jawna, uzasadniona i recenzowana.

Kontrola ujemna jest oceniana tym samym progiem lub specjalnie zwalidowanym bardziej czułym ustawieniem. Nie wolno patrzeć na nią mniej uważnie niż na dowód.

Tabela pików przed hipotezą genotypów

Przydatny zapis per locus:

Pik	Rozmiar/allel	RFU	Kanał	Klasy możliwe
P1	12	1840	niebieski	allel
P2	13	165	niebieski	stutter 14, allel minor lub oba
P3	14	1320	niebieski	allel
P4	15	92	niebieski	allel minor, drop-in, szum zależnie od progu

Tabela zachowuje alternatywy. Nie wpisuje „allel A” przy 12 przed modelem. Później software może przypisać prawdopodobne wkłady, ale surowa obserwacja pozostaje.

Warto zapisać parent peaks dla stutter i parent channel dla pull-up. Przy kilku możliwych rodzicach model może sumować wkład.

Faza genotypów między loci

W każdym locus można utworzyć wiele par genotypów zgodnych z allelami. Nie wiadomo, który genotyp w locus 1 należy do tego samego dawcy co określony genotyp w locus 2.

Przykład dwóch osób:

locus A: 10, 11, 12, 13
locus B: 8, 9, 10, 11

Możliwe są między innymi:

U1: A 10,11; B 8,9
U2: A 12,13; B 10,11

albo:

U1: A 10,12; B 8,10
U2: A 11,13; B 9,11

Peak heights i wspólna mixture proportion pomagają wiązać genotypy, ale uncertainty pozostaje. Program probabilistyczny sumuje po wielu kombinacjach zamiast wybierać jedną dekonwolucję.

Genotype sets nie są listą osób

Software może zwrócić rozkład genotypów nieznanego dawcy per locus. Najwyższy posterior genotype nie musi tworzyć pełnego profilu realnej osoby, jeśli maxima w loci pochodzą z różnych konfiguracji contributor labels.

Label switching jest problemem modeli mieszanin: nieznani dawcy są wymienni. U1 w jednym fragmencie obliczeń nie ma biologicznego imienia. Mixture proportion albo conditioning może porządkować role, ale należy sprawdzić implementację.

Eksport „najbardziej prawdopodobnego profilu nieznanego” do bazy może tworzyć chimeryczny profil. Bazy zwykle wymagają odrębnych kryteriów dedukcji.

Dedukcja profilu do przeszukania

Profil dowodowy w bazie operacyjnej powinien spełniać kryteria jakości, liczby loci, źródła i kategorii. Przy mieszaninie można czasem wydedukować major contributor.

Ryzyka:

• włączenie allelu minor do major;
• pominięcie shared allele;
• dropout;
• stutter;
• zbyt mały NOC;
• conditioning na niewłaściwą osobę;
• tworzenie composite.

Trafienie z wydedukowanego profilu jest wskazówką. Potwierdza się je na próbce odniesienia i ocenia pełnymi danymi, bez używania samego hitu jako niezależnego dowodu.

Nie powinno się najpierw wyszukać kandydata, a potem zmienić dekonwolucję, aby zwiększyć zgodność.

Sub-source a source

Sub-source proposition dotyczy DNA osoby:

• Hp: DNA A jest składnikiem mieszaniny;
• Hd: DNA A nie jest składnikiem; zamiast niego jest nieznany.

Source proposition może dotyczyć materiału biologicznego:

• krew pochodzi od A;
• krew pochodzi od nieznanej osoby.

Jeśli wymaz zawiera krew jednej osoby i kontaktowe DNA innych, profil całej próbki nie przypisuje automatycznie każdego allelu do krwi. Potrzebna jest informacja serologiczna, lokalizacja lub separacja.

LR sub-source nie odpowiada, czy A krwawiła na przedmiot.

Próbki intymne

Wymaz intymny może zawierać:

• DNA osoby badanej;
• nasienie;
• komórki partnera;
• tło wcześniejszych kontaktów;
• materiał z pobrania;
• kilku partnerów;
• produkty higieny i inhibitory.

Conditioning na profil osoby badanej jest często uzasadnione, ale frakcja różnicowa nie jest czysta z definicji. Minor może mieć dropout. Y-STR może pomóc przy wysokiej przewadze DNA bez Y, lecz ma liniowe ograniczenia genealogiczne.

Interpretacja genotypu źródłowego nie ustala zgody, czasu ani charakteru kontaktu. Te pytania należą do poziomu aktywności i innych dowodów.

Wymazy spod paznokci

Materiał spod paznokci może obejmować:

• własne DNA;
• partnerów i domowników;
• materiał zawodowy;
• bezpośredni kontakt;
• pośredni transfer;
• krew;
• włókna i zanieczyszczenia.

Profil własny jest często major. Minor może być bardzo niski i niesymetryczny między dłońmi. Łączenie obu dłoni zwiększa ilość, ale usuwa informację o stronie oraz czynności.

NOC biologiczny może być większy niż analityczny. Dane TPPR i tło są potrzebne przed przypisaniem minor do walki.

Przedmiot wspólnego użytku

Kierownica, telefon, klamka i narzędzie mogą kumulować profile. Mieszanina nie musi pochodzić z jednego momentu.

W modelu sub-source pytamy, kto jest w próbce. W modelu activity-level pytamy, jaka sekwencja użytkowania wytworzyła taki skład. Silny LR sub-source dla A może współistnieć z małą wartością dla spornego użycia, jeśli A jest regularnym użytkownikiem.

Z tego powodu nie nazywa się automatycznie wszystkich contributors „uczestnikami zdarzenia”.

Mieszanina płynów biologicznych

Jedna próbka może zawierać krew A, ślinę B i touch DNA C. Standardowe STR nie rozróżniają typu materiału. Jeśli testy wskazują płyny, trzeba zachować ich lokalizację i zakres.

Metody RNA, białkowe lub metylacyjne mogą wspierać identyfikację tissue source, ale mają własne mixture models. Wynik „wykryto marker śliny” nie przypisuje śliny do B bez rozdzielenia.

Stwierdzenie „DNA B znajdowało się w ślinie” wymaga mostu analitycznego, nie samego współwystępowania.

Mieszanie przed ekstrakcją i po ekstrakcji

Mieszanina może powstać:

• na przedmiocie;
• podczas pobrania szerokiej strefy;
• po połączeniu wymazówek;
• w ekstrakcji;
• przez cross-contamination;
• przy pipetowaniu;
• w pliku przez błędne przypisanie.

Elektroferogram nie wskazuje etapu. Chain of identity, blanki, mapy i przestrzenna dokumentacja pomagają.

Mieszanina procesowa może mieć proporcje równie stabilne jak zdarzeniowa. Nie rozpoznaje się jej po „dziwnym” wyglądzie.

Allele drop-out a allele drop-in w replikatach

Przy małej liczbie kopii:

• prawdziwy allel może pojawić się tylko w jednym PCR;
• drop-in też może pojawić się raz;
• stutter zmienia wysokość;
• allele balance fluktuuje.

„Powtarzalność” nie jest prostą dychotomią. Prawdziwy allel przy bardzo małym template ma mniej niż 100% szansy replikacji. Drop-in może przypadkowo powtórzyć się, zwłaszcza gdy źródło kontaminacji jest stałe.

Model replikatów może wspólnie oceniać dane, zachowując odrębne reakcje i wspólny genotyp. Jest lepszy niż ręczne tworzenie super-profilu, jeśli został zwalidowany.

Brak allelu w profilu odniesienia

Jeśli evidence ma allel, którego kandydat nie ma, nie jest to „dropout kandydata”. Dropout dotyczy braku prawdziwego allelu w evidence. Dodatkowy allel może pochodzić od innego dawcy, stutter, drop-in lub artefaktu.

To proste rozróżnienie zapobiega odwróceniu mechanizmu:

kandydat 10,12
evidence 10,12,14

14 nie jest dropoutem. Model musi przypisać go innemu contributor albo drop-in.

Null allele w mieszaninie

Wariant pod primerem może ukryć allel. Jeśli dawca ma heterozygotę, assay widzi homozygotę. W mieszaninie może to zmienić NOC i LR.

Wskazówki:

• niezgodność między zestawami;
• pokrewieństwo z pozorną mutacją;
• nietypowo wysoki wspólny pik;
• znany wariant flanki;
• sequence data.

Alternatywny primer lub MPS może ujawnić allel. Walidacja powinna opisać, jak aktualizuje się historyczne profile i częstości.

Saturation udaje allele stacking

Gdy pik jest off-scale, jego raportowana wysokość może być zaniżona, a pull-up podwyższony. Mixture proportion staje się niewiarygodna.

Rozcieńczenie produktu lub ponowna amplifikacja z mniejszym input są różnymi działaniami:

• rozcieńczenie zachowuje produkt PCR i jego stutter;
• nowa PCR ponownie losuje template i tworzy nowe stutter.

Oba mogą być użyte do diagnostyki, ale nie wybiera się wyniku korzystniejszego.

Allelic ladder i binning w mieszaninie

Przesunięty sizing może przenieść pik do sąsiedniego binu. W pojedynczym profilu nietypowa kombinacja może alarmować; w mieszaninie błąd łatwiej ukrywa się w wielu pikach.

Kontrola:

• local sizing quality;
• allelic ladder;
• off-ladder flags;
• sąsiednie próbki;
• powtórna iniekcja;
• sekwencjonowanie.

Nie wolno „przesunąć ręcznie” piku do allelu kandydata bez udokumentowanej podstawy.

LR nie jest prawdopodobieństwem udziału

LR = milion nie oznacza:

• milion do jednego, że A jest dawcą;
• 99,9999% prawdopodobieństwa udziału;
• miliona razy większej winy;
• jednej szansy na milion błędu laboratorium.

Oznacza, że dane są według modelu milion razy bardziej prawdopodobne przy jednej propozycji niż przy drugiej. Przejście do posterior probability wymaga prior odds, których ekspert DNA zwykle nie ustala.

Kalibracja LR

System jest kalibrowany, jeśli wyniki określonej siły odpowiadają częstościom obserwowanym w danych ground truth w sposób zgodny z interpretacją probabilistyczną.

Testy:

• true contributors powinni zwykle dawać LR > 1, ale trudne próbki mogą nie;
• non-contributors powinni zwykle dawać LR < 1 lub małe, lecz allele sharing może dać wyjątki;
• ekstremalne LR wymagają szczególnie dobrego dopasowania;
• false support distribution powinna być znana.

Calibration nie jest tym samym co discrimination. Model może dobrze rozdzielać grupy, ale być overconfident.

Błędy false inclusion i false exclusion

W regułach jakościowych błąd zależy od kryterium inclusion. W LR zależy od progu decyzyjnego, jeśli odbiorca go stosuje.

Laboratorium powinno raportować performance bez sugerowania jednej uniwersalnej error rate:

• typ mieszaniny;
• NOC;
• proporcję;
• template;
• dropout;
• relatedness;
• model;
• próg.

„DNA ma błąd jeden na miliard” myli rarity profile z proceduralną error rate.

Casework performance

Walidacja ogólna obejmuje zakres, ale konkretna sprawa może leżeć blisko granicy. Case-specific performance można ocenić przez:

• symulacje genotypów pod podobnym NOC;
• parametric bootstrap;
• non-contributor tests;
• sensitivity to parameters;
• replicate runs;
• alternate propositions;
• comparison with validation neighbors.

Nie chodzi o dopasowanie testu po wyniku. Protokół powinien określać, kiedy taka ocena jest wymagana.

Interpretacja wyniku LR bliskiego 1

LR około 1 oznacza, że dane podobnie pasują do obu propozycji. Nie oznacza, że A „w połowie” jest dawcą.

Przy bardzo słabym profilu model może nie rozróżniać. Raport powinien oprzeć się pokusie nazywania każdego zgodnego allelu „wsparciem”.

LR < 1 może wspierać alternatywę, nawet jeśli A nie jest formalnie wykluczony w jakościowym sensie.

Rounding i skale słowne

LR jest oszacowaniem, nie wartością o dziesięciu znaczących cyfrach. Raport może:

• podać liczbę zaokrągloną;
• użyć log10 LR;
• zastosować skalę słowną;
• wskazać cap raportowy.

Skala słowna powinna być zdefiniowana i nie zastępować propozycji. „Bardzo silne wsparcie” bez informacji dla czego i przeciw czemu jest niepełne.

Ograniczenie do loci użytecznych

Profil może mieć loci:

• akceptowalne;
• poniżej progu;
• z awarią;
• poza walidacją;
• dotknięte kontaminacją;
• z nierozstrzygniętym artefaktem.

Wyłączenie locus musi być regułą zastosowaną symetrycznie. Nie wolno wyłączać tylko niezgodnych z kandydatem.

Software może przyjąć missing data, ale raport i audit trail powinny wskazać powód.

Preprocessing jako źródło wariancji

Dwa laboratoria mogą użyć tego samego software’u, lecz otrzymać inny LR przez:

• inny analytical threshold;
• edycję pików;
• oznaczenie stutter;
• NOC;
• conditioning;
• population database;
• theta;
• degradation setting;
• drop-in rate.

„Ten sam program” nie oznacza tej samej metody. Waliduje się workflow od pliku do raportu.

Przegląd techniczny mieszaniny

Recenzent sprawdza:

• dane surowe i preprocessing;
• klasyfikację artefaktów;
• kontrolki;
• NOC;
• conditioning;
• propozycje;
• population assumptions;
• software/version;
• convergence;
• sensitivity;
• transcription of LR;
• język raportu.

Przegląd nie powinien znać oczekiwanej odpowiedzi przed oceną kluczowych decyzji, jeśli da się tego uniknąć.

Degradation slope

W zdegradowanej mieszaninie długie loci słabną. Jeśli dawcy mają DNA różnej jakości, każdy może mieć inny slope. Jedna globalna krzywa może nie pasować.

Przykład: świeża krew A i stare touch DNA B. A ma równy profil, B traci długie allele. Mixture proportion zmienia się per locus.

Model ciągły może mieć degradation parameter, ale wymaga walidacji mieszanin o zróżnicowanej jakości.

Inhibicja i mieszanina

Inhibitor działa na całą reakcję, lecz różne produkty reagują nierówno. Może:

• obniżyć piki;
• zwiększyć dropout;
• zmienić balance;
• wzmocnić pozorny slope;
• pogorszyć stutter model.

Powtórzenie po rozcieńczeniu zmienia inhibitor i template. Profile nie są identycznymi replikatami.

Replikaty

Replikaty PCR z tego samego ekstraktu mogą:

• potwierdzić stabilne allele;
• ujawnić stochastic variation;
• odzyskać allele dropout;
• wykazać sporadyczny drop-in;
• zużyć materiał.

Nie wolno tworzyć consensus profile regułą „włącz wszystko, co pojawiło się choć raz”. To kumuluje drop-in. Reguły mogą wymagać powtórzeń, ale muszą być zwalidowane.

Łączenie wysokości pików z różnych PCR jest zwykle nieuzasadnione bez modelu. Każda reakcja ma własną sampling variation.

Profil złożony

Composite profile powstaje przez połączenie alleli z kilku przebiegów lub próbek. Może być użyteczny w ograniczonych, zdefiniowanych warunkach, ale ryzykuje:

• łączenie różnych dawców;
• inflację alleli;
• utratę lokalizacji;
• kumulację drop-in;
• ukrycie nierównowagi;
• zmianę NOC.

Próbki z dwóch stref nie powinny być łączone tylko dlatego, że dotyczą jednego przedmiotu. Mogą mieć inną historię.

Conditioning on a known contributor

Jeśli wiadomo, że próbka zawiera materiał osoby pokrzywdzonej, model może condition on jej genotyp. Oznacza to, że jest traktowana jako znany dawca, a nie „odejmowana”.

Warunki:

• obecność jest uzasadniona niezależnie;
• genotyp jest znany;
• propozycje po obu stronach zawierają tę osobę;
• uncertainty co do jej wkładu pozostaje modelowana.

Nie można warunkować na podejrzanego tylko dlatego, że profil pasuje. To wpisuje sporną kwestię jako założenie.

Odejmowanie profilu

Ręczne „odjęcie” alleli znanej osoby może prowadzić do błędu:

• wspólne allele należą też do nieznanego;
• wysokość zawiera stacking;
• stutter znanej osoby nakłada się na minor;
• dropout znanego dawcy jest możliwy;
• rzeczywista osoba może nie być dawcą.

Po conditioning genotyp znanej osoby jest częścią obu hipotez, a model rozważa pozostałe wkłady. Dane nie są fizycznie czyszczone.

Inclusion, exclusion i inconclusive

Inclusion historycznie oznacza, że allele osoby są zgodne z mieszaniną w ramach reguł. Nie jest jeszcze wagą dowodu.

Exclusion wymaga niezgodności niewyjaśnialnych rozsądnie dropoutem lub mutacją według procedury.

Inconclusive oznacza, że danych nie można wiarygodnie sklasyfikować dla danego porównania, a nie „trochę pasuje”.

W probabilistic genotyping wynik LR może być:

• większy od 1 — wspiera Hp;
• około 1 — nie rozróżnia;
• mniejszy od 1 — wspiera Hd.

To bardziej informacyjne niż sama lista inclusion.

CPI/RMNE

Combined Probability of Inclusion, nazywane też Random Man Not Excluded, oblicza prawdopodobieństwo, że losowa osoba nie zostanie wykluczona przez zestaw alleli.

Podejście ma ograniczenia:

• wymaga jednoznacznego zestawu alleli;
• nie wykorzystuje wysokości;
• traci mixture proportion;
• nie modeluje dropout w prostym wariancie;
• może wykluczać loci poniżej stochastic threshold;
• nie porównuje pełnych propozycji tak elastycznie jak LR.

ISFG ogranicza zastosowanie podobnych metod do profili niejednoznacznych i preferuje LR dla mieszanin.⁴

Binary, semi-continuous i continuous

Binary model używa obecności lub braku alleli.

Semi-continuous dodaje prawdopodobieństwo dropout i drop-in, ale zwykle nie modeluje pełnych wysokości.

Continuous modeluje wysokości pików, mixture proportions, stutter, degradation i variability.

Więcej danych nie gwarantuje lepszego wyniku, jeśli model jest źle zwalidowany. Każda klasa ma assumptions.

Artykuł o genotypowaniu probabilistycznym rozwinie algorytmy, walidację i diagnostykę; tutaj ważne jest, że model ma wyjaśniać cały profil symetrycznie dla obu propozycji.

Propozycje sub-source

Przykład dla mieszaniny trzech osób:

• Hp: mieszanina zawiera A, osobę pokrzywdzoną V i jednego nieznanego;
• Hd: mieszanina zawiera V i dwóch nieznanych, z których żaden nie jest A.

Conditioning na V jest wspólne. NOC = 3 jest założeniem do sensitivity analysis. Jeśli NOC niepewny, oblicza się alternatywne modele.

LR:

P(dane | A, V, U1, parametry) /
P(dane | V, U1, U2, parametry)

W obu liczniku i mianowniku są stutter, dropout, drop-in i częstości genotypów.

Related alternative

Jeśli realną alternatywą jest brat A, Hd z losową niespokrewnioną osobą może zawyżyć wartość. Krewni dzielą więcej alleli.

Można porównać:

• A kontra nieznany niespokrewniony;
• A kontra brat;
• A kontra członek określonej rodziny.

Raport powinien mówić, która alternatywa dała LR. Jedna liczba nie odpowiada na wszystkie.

Porównanie przed i po profilu odniesienia

Interpretacja evidence profile powinna zacząć się przed poznaniem kandydata:

• jakość;
• NOC;
• artefakty;
• zakres loci;
• możliwość dropout;
• major/minor;
• suitability.

Potem porównuje się profil odniesienia. Sequential unmasking ogranicza dopasowywanie NOC, progów i alleli do oczekiwań.

Jeśli po porównaniu pojawia się nowa obserwacja techniczna, należy ją udokumentować i niezależnie przejrzeć.

Kontaminacja i dodatkowy dawca

Profil pracownika w kilku loci nie powinien być modelowany tylko jako niezależne drop-in alleles. Ma spójny genotyp i wskazuje źródło.

Podobnie niewielki dawca widoczny w wielu loci jest dodatkowym contributor, nawet jeśli część alleli jest niska. Drop-in jest przeznaczony do sporadycznych niewyjaśnionych zdarzeń zgodnie z walidacją.

Kontrola ujemna może ograniczyć możliwość użycia partii, ale jej wpływ ocenia się na pełnych danych.

Mieszaniny Y-STR i mtDNA

Reguły autosomalne nie przenoszą się mechanicznie.

Y-STR:

• haplotyp;
• loci wielokopijne;
• stutter;
• kilku mężczyzn;
• brak rekombinacyjnej niezależności.

mtDNA:

• haplotyp i heteroplazmia;
• wiele kopii;
• różne poziomy wariantu;
• NUMT;
• mieszanina linii matczynych.

Wspólny allele count nie daje NOC jak w diploidalnych autosomalnych STR.

MPS i mieszaniny

Sekwencjonowanie może rozdzielić allele tej samej długości, zwiększając informację. Równocześnie dodaje:

• read count;
• allelic sequence stutter;
• index misassignment;
• sequencing error;
• mapping;
• depth thresholds;
• PCR duplicates.

Model CE peak height nie może być użyty wprost do read counts. Wymagana jest walidacja MPS mixtures.

Ground-truth validation

Walidacja mieszanin potrzebuje próbek o znanych:

• genotypach;
• liczbie dawców;
• proporcjach;
• ilości;
• degradacji;
• pokrewieństwie;
• artefaktach;
• replicates.

Panel obejmuje:

• 2, 3, 4+ contributors;
• balanced i highly imbalanced;
• allele sharing;
• stutter overlap;
• dropout;
• drop-in;
• related contributors;
• inhibitory;
• niskie i wysokie wejście.

Wydajność ocenia się nie tylko na poprawnym LR dla true contributor, ale także na non-contributors, false inclusion/exclusion, calibration i sensitivity to assumptions.

Performance tests

Useful tests:

• true contributor test;
• non-contributor test;
• leave-one-out;
• false positive/negative rate w zdefiniowanym progu;
• LR distributions;
• ROC w określonym zastosowaniu;
• calibration;
• reproducibility;
• precision MCMC;
• robustness na NOC i parametry;
• interlaboratory comparison.

Jedna maksymalna liczba LR nie podsumowuje performance.

NISTIR 8351 gromadzi dane walidacyjne i proficiency, zwracając uwagę na potrzebę case-specific performance i jawnych granic.

MCMC i zmienność wyniku

Niektóre programy używają Markov chain Monte Carlo do próbkowania przestrzeni genotypów i parametrów. Dwa uruchomienia mogą dać nieidentyczny LR.

To nie musi być błąd. Trzeba ocenić:

• liczbę iteracji;
• convergence;
• effective sample size;
• variability log(LR);
• stabilność genotypów;
• seeds;
• replicate runs.

Badanie NIST/FBI/ESR pokazało potrzebę ilościowej oceny precyzji MCMC w warunkach reprodukcyjnych.⁵

Studium 1: trzy piki

W locus są piki 10, 12, 14. Kandydat A ma 10,12. Czy jest w mieszaninie?

Nie wiadomo bez:

• innych loci;
• wysokości;
• stutter;
• NOC;
• dropout;
• propozycji;
• częstości.

Trzy piki wskazują co najmniej dwóch dawców, jeśli wszystkie są allelami. Profil A jest zgodny, ale wiele osób 10,12 również.

Studium 2: pik w stutter

Silny allel 15 ma pik 14 na poziomie 9%. Walidowany stutter dla 15 ma rozkład obejmujący tę wartość. Kandydat minor ma allel 14.

Nie wolno klasyfikować piku wyłącznie jako stutter po poznaniu kandydata ani w całości jako allel. Model uwzględnia oba wkłady. Pozostałe loci określają minor.

Studium 3: wiele dropoutów

Kandydat pasuje do części alleli, ale wymaga dropout pięciu alleli w loci, gdzie inne piki minor są wysokie.

Jakościowa inclusion może brzmieć pozornie korzystnie. LR powinien ukarać mało prawdopodobny wzorzec. Może wyjść poniżej 1, wspierając alternatywę.

Studium 4: dodatkowy pracownik

W mieszaninie niskopoziomowej dodatkowe allele tworzą profil osoby z elimination database. Model trzech nieznanych dawców może matematycznie dopasować dane, ale laboratoryjne dochodzenie wskazuje kontaminację.

Statystyczne dopasowanie nie zastępuje quality incident. Raport musi wyjaśnić źródło i zakres.

Studium 5: NOC 3 czy 4

Profil ma maksymalnie sześć alleli w locus, ale wiele słabych pików i allele sharing. Modele NOC 3 i 4 dają podobne dopasowanie, a LR dla A różni się.

Raport powinien przedstawić sensitivity:

• wyniki dla obu NOC;
• podstawę wyboru;
• validation range;
• wpływ na conclusion.

Nie ukrywa się alternatywy tylko dlatego, że jedna daje większy LR.

Studium 6: krewni w mieszaninie

A i jego brat B są realnymi kandydatami. Mieszanina wspiera A wobec losowego niespokrewnionego, ale słabiej wobec B.

Wniosek musi nazwać alternatywę. „Dowód jest miliard razy bardziej prawdopodobny, jeśli A jest dawcą” jest niepełne bez mianownika.

Najczęstsze błędy

Trzy allele = dwie osoby. To minimum, nie dokładna liczba.

Wysoki pik = major allele jednej osoby. Może być stackiem kilku dawców.

Major = sprawca. Major opisuje ilość sygnału.

Każdy dodatkowy allel = drop-in. Spójne allele wskazują dodatkowego dawcę.

Każdy brak = dropout. Prawdopodobieństwo zależy od danych i może silnie obniżyć LR.

Pik stutter usunięty. Może zawierać prawdziwy allel.

Profil znanej osoby odjęty. Wspólne allele i uncertainty pozostają.

Consensus „allele raz widziany”. Kumulacja drop-in.

CPI przy dropout. Metoda może nie być odpowiednia.

NOC wybrany dla największego LR. To bias.

Niespokrewniona alternatywa, gdy kandydatem jest brat. Mianownik jest nierealny.

Software zrobił interpretację. Analityk odpowiada za dane, assumptions i validation.

Lista kontrolna mieszaniny

1. Czy wszystkie piki są właściwie sklasyfikowane?
2. Czy kontrolki są akceptowalne?
3. Jaki jest minimalny i plausybilny NOC?
4. Czy występuje major/minor?
5. Gdzie jest allele sharing?
6. Czy profil jest zdegradowany lub inhibowany?
7. Jakie typy stutter modelowano?
8. Czy dropout jest plausybilny?
9. Czy drop-in odpowiada walidacji?
10. Czy znany contributor jest uzasadniony?
11. Jakie są propozycje?
12. Czy alternatywa pokrewna jest realna?
13. Czy model mieści się w validation range?
14. Czy sensitivity to NOC zmienia wniosek?
15. Czy wynik jest reproducible i reviewed?

Co zapamiętać

1. Mieszanina laboratoryjna jest mierzalnym wkładem co najmniej dwóch osób, nie listą osób na przedmiocie.
2. Liczba alleli daje minimalny NOC, nie zawsze prawdziwy.
3. Allele sharing może ukrywać dawców i zwiększać wspólne piki.
4. Dropout to niewykryty prawdziwy allel; drop-in to sporadyczny dodatkowy sygnał w modelu.
5. Stutter może nakładać się na prawdziwy allel.
6. Major/minor opisuje sygnał, nie rolę w zdarzeniu.
7. Conditioning nie oznacza odejmowania profilu.
8. Inclusion nie jest wagą dowodu; LR porównuje pełne propozycje.
9. NOC, pokrewieństwo i parametry wymagają sensitivity analysis.
10. Model probabilistyczny jest wiarygodny tylko w zwalidowanym zakresie i przy kompetentnym przeglądzie.