Human Cell Atlas, CELLxGENE i atlasy single-cell

Atlas komórek jest modelem referencyjnym

Atlas geograficzny nie zawiera każdego kamienia. Wybiera skalę, symbole i granice odpowiednie dla celu. Human Cell Atlas, CZ CELLxGENE i inne atlasy single-cell robią podobną rzecz z tkankami: zbierają pomiary milionów komórek, porządkują je, opisują wspólnymi terminami i budują mapę stanów komórkowych.

Nie jest to jednak ostateczny spis wszystkich „prawdziwych typów komórek”. Wynik zależy od:

• doboru dawców i tkanek;
• sposobu pobrania;
• dysocjacji albo izolacji jąder;
• platformy;
• głębokości sekwencjonowania;
• filtrów jakości;
• algorytmu integracji;
• rozdzielczości klastrowania;
• wiedzy i słownika anotatora.

Atlas jest wersjonowaną hipotezą referencyjną. Pozwala pytać, które komórki są podobne, gdzie wykrywa się gen, jakie stany powtarzają się między badaniami i jak własne dane odnoszą się do referencji. Nie usuwa niepewności i nie zastępuje materiału źródłowego.

Projekt, sieć biologiczna i atlas

W Human Cell Atlas warto rozdzielić trzy poziomy.

Projekt to konkretny zbiór wytworzony przez badaczy. Ma dawców, próbki, protokoły, biblioteki, pliki i publikacje.

Biological Network koordynuje społeczność wokół narządu lub układu, np. płuca, nerki albo odporności.

Atlas jest zintegrowanym obiektem łączącym wiele projektów i publikującym wspólną reprezentację, anotacje oraz kod.

HCA Data Portal traktuje projekt jako podstawową jednostkę organizacji. Dla projektu udostępnia opis, kontakty, accessiony, surowe pliki, metadane, macierze generowane przez portal i — jeśli dostarczono — macierze autorów.¹

Projekt może istnieć, zanim dojrzeje atlas. Atlas może mieć kilka wydań. Nazwa sieci nie jest accessionem danych.

HCA Data Portal i CELLxGENE pełnią różne role

HCA Data Portal koncentruje się na:

• pochodzeniu materiału;
• grafie metadanych;
• surowych i przetworzonych plikach;
• standardowym przetwarzaniu części projektów;
• otwartym i zarządzanym dostępie;
• połączeniu projektu z atlasem.

CZ CELLxGENE Discover koncentruje się na:

• publikacji zestandaryzowanych zbiorów single-cell;
• filtrowaniu po wspólnych polach;
• interaktywnej eksploracji;
• pobieraniu H5AD;
• przeszukiwaniu korpusu przez Census.

HCA może kierować z atlasu do zintegrowanego obiektu w CELLxGENE. Nie oznacza to, że oba portale przechowują identyczny plik ani że każda kolekcja CELLxGENE należy do HCA.

Collection, dataset i Census

W CELLxGENE:

• collection grupuje zbiory związane z publikacją lub projektem;
• dataset jest konkretnym obiektem single-cell zgodnym ze schematem;
• Discover pozwala go znaleźć, obejrzeć i pobrać;
• Census tworzy wersjonowany, programowo odpytywany korpus danych Discover.

Census udostępnia dane komórka–gen, metadane komórek i genów oraz informacje o źródłowych datasetach przez TileDB-SOMA. Zapytanie można zwrócić jako AnnData, obiekt R albo tablice bez pobierania całego korpusu.²

To rozróżnienie ma znaczenie dla cytowania:

• publikację cytuje się jako źródło biologiczne;
• collection/dataset identyfikuje przetworzony obiekt;
• Census release zamraża korpus użyty w zapytaniu;
• kod zamraża filtry i transformacje.

AnnData jest kontenerem, nie jedną macierzą

Plik .h5ad przechowuje obiekt AnnData. Najważniejsze części:

• X — główna macierz obserwacje × cechy;
• obs — tabela metadanych komórek;
• var — tabela metadanych genów;
• layers — dodatkowe macierze o tych samych osiach;
• obsm — reprezentacje komórek, np. PCA i UMAP;
• varm — reprezentacje cech;
• obsp — grafy komórka–komórka;
• uns — nieustrukturyzowane ustawienia, kolory i wyniki;
• raw — opcjonalna migawka wcześniejszego stanu danych.

Nie wolno zakładać, że X zawsze zawiera raw counts. Może zawierać:

• counts;
• wartości znormalizowane;
• log1p;
• skalowane z-score;
• wynik korekty;
• inne dane wybrane przez autora.

Przed użyciem sprawdza się typ, zakres i dokumentację. Jeśli X ma liczby ułamkowe, nie dowodzi to jeszcze normalizacji: niektóre metody generują estymowane counts. Jeśli ma liczby całkowite, nadal mogły zostać zaokrąglone.

H5AD nie gwarantuje kompletnej odtwarzalności

Plik może zawierać macierz i anotacje, ale nie:

• FASTQ;
• parametry demultipleksowania;
• reference transcriptome;
• whitelist barcode;
• kryteria usuwania komórek;
• kod integracji;
• historię ręcznych zmian etykiet;
• dokładny model annotacji;
• zgodę i warunki użycia.

H5AD jest bogatym pakietem wynikowym, nie substytutem surowego archiwum. Do krytycznej reanalizy przechowuje się źródłowe accessiony i metody.

CELLxGENE Discover wymaga zgodności ze schematem i udostępnia pobieranie datasetów w formacie H5AD. Dokumentacja wskazuje wspólny schemat jako podstawę wyszukiwania i integracji.³

Macierz jest zwykle rzadka

W single-cell większość par komórka–gen ma zero. Macierze zapisuje się jako sparse, aby nie zużywać pamięci na zera.

Zero może znaczyć:

• gen nie jest eksprymowany;
• transkrypt nie został uchwycony;
• głębokość była za mała;
• cząsteczka zginęła podczas przygotowania;
• odczyt nie zmapował się;
• cecha nie należała do reference;
• filtr usunął sygnał.

To zjawisko bywa nazywane dropout, ale nie każde zero jest technicznym dropoutem. Z macierzy nie da się dla pojedynczej komórki pewnie odróżnić wszystkich przyczyn.

Imputacja może wygładzać mapę, lecz również tworzyć pozorne słabe sygnały. Oryginalne counts trzeba zachować.

Read counts i UMI counts

Technologie pełnej długości, takie jak Smart-seq2, zliczają zwykle odczyty lub estymowaną ekspresję genu. Technologie kroplowe 10x używają UMI i zliczają wykryte cząsteczki po deduplikacji.

Tych wartości nie należy nazywać identycznym pomiarem:

• read count zależy od amplifikacji;
• UMI ogranicza część biasu PCR;
• pełna długość lepiej wspiera analizę izoform;
• technologie kroplowe mierzą więcej komórek płycej;
• wykrywalność genów różni się;
• reference i pipeline zmieniają cechy.

HCA Data Portal udostępnia macierze generowane własnymi pipeline’ami. Dokumentacja wyjaśnia, że dla Optimus/10x są to UMI-aware counts, a dla Smart-seq2 TPM i estimated counts; macierze zawierają metadane globalne, genowe i komórkowe.⁴

Ujednolicenie formatu nie ujednolica fizyki pomiaru.

Macierz autora i macierz portalowa

HCA może udostępniać:

• contributor-generated matrix;
• portal-generated project matrix;
• macierze per library;
• surowe pliki;
• zunifikowane BAM.

Macierz autora może najlepiej odtwarzać publikację, ponieważ zawiera jej filtry, anotacje i czasem ręczne etykiety. Macierz portalowa daje standardowe przetwarzanie i łatwiejsze porównania.

Różnice nie muszą oznaczać błędu:

• inny reference;
• inna wersja pipeline’u;
• inny próg komórek;
• ambient RNA correction;
• inny doublet removal;
• inne gene symbols;
• aktualizacja metadanych.

Do raportu wpisuje się, której macierzy użyto.

Metadata Manifest łączy plik z materiałem

HCA Data Portal pozwala pobrać projektowy TSV z pełnymi metadanymi. Jeden wiersz reprezentuje plik, a kolumny opisują właściwości grafu: dawcę, specimen, cell suspension, library, sequencing i analysis.⁹

Manifest może być duży, ponieważ ta sama wartość powtarza się dla wielu plików. Nie należy go bezmyślnie traktować jak tabeli unikalnych dawców.

Najważniejsze identyfikatory:

• project;
• donor;
• specimen;
• cell suspension;
• library preparation;
• sequencing process;
• analysis process;
• file.

Macierz projektowa może zawierać tylko część metadanych. HCA opisuje input_id jako łącznik między komórkami lub bibliotekami w macierzy a pełnym manifestem.¹¹

Jeśli badacz analizuje chorobę, płeć lub wiek, musi wykonać to połączenie, a nie zakładać, że wszystko znajduje się w obs.

Komórka nie jest niezależnym pacjentem

Milion komórek od trzech dawców to nie milion replik biologicznych. Dla pytania o różnicę między grupami jednostką niezależności jest zwykle dawca, zwierzę, próbka albo inna jednostka pobrania.

Błąd pseudoreplikacji:

1. traktuje każdą komórkę jako niezależną;
2. daje ogromną pozorną liczebność;
3. zaniża błędy standardowe;
4. produkuje bardzo małe p-value;
5. mierzy różnice między dawcami lub batchami jako pewny efekt grupy.

Lepsze strategie:

• pseudobulk per donor i typ komórki;
• modele mieszane;
• blokowanie dawcy;
• metaanaliza per projekt;
• testy zachowujące strukturę próbki.

Liczba komórek wpływa na precyzję profilu dawcy, ale nie zastępuje liczby dawców.

QC komórki jest decyzją biologiczną

Typowe metryki:

• liczba UMI lub reads;
• liczba wykrytych genów;
• udział transkryptów mitochondrialnych;
• udział rybosomalnych;
• complexity;
• ambient RNA;
• prawdopodobieństwo doubletu;
• zgodność barcode.

Nie ma jednego progu dobrego dla każdej tkanki. Kardiomiocyty, adipocyty, neutrofile i jądra mają odmienne rozkłady. Sztywny filtr mitochondrialny może selektywnie usunąć ważny typ komórek albo stan stresu.

Progi powinny być:

• sprawdzone per próbka i technologia;
• pokazane na rozkładach;
• uzasadnione biologicznie;
• przetestowane w analizie czułości;
• zapisane przed porównaniem grup, gdy to możliwe.

Martwa komórka, stres i dysocjacja

Dysocjacja tkanki może indukować ekspresję genów natychmiastowej odpowiedzi, szoku cieplnego i stresu. Dłuższy transport, enzym, temperatura oraz ścinanie zmieniają skład i transkryptom.

Skutki:

• utrata delikatnych komórek;
• wzbogacenie odpornych typów;
• aktywacja komórek odpornościowych;
• uwolnienie RNA do tła;
• zmiana proporcji;
• pozorne nowe stany.

Single-nucleus RNA-seq ogranicza część problemów i umożliwia tkanki mrożone, ale ma własny profil:

• więcej RNA jądrowego;
• inne proporcje intronów;
• słabsze transkrypty cytoplazmatyczne;
• inne wykrywanie typów.

scRNA-seq i snRNA-seq można integrować, lecz assay pozostaje ważną zmienną.

Ambient RNA

RNA uwolnione z uszkodzonych komórek trafia do kropli i daje sygnał w barcodes innych komórek. Gen bardzo obfity w tkance może pojawić się słabo w wielu klastrach.

Przykłady ryzyka:

• albumina w komórkach wątroby;
• hemoglobina w innych komórkach krwi;
• enzymy trawienne w trzustce;
• immunoglobuliny poza plazmocytami.

Korekta ambient RNA wymaga profilu tła i modelu. Nie wolno usuwać każdego „nietypowego” markera, bo możliwa jest prawdziwa ekspresja, fagocytoza albo doublet.

Doublet nie zawsze wygląda jak średnia

Kropla może zawierać dwie komórki. Doublet homotypowy jest trudniejszy do wykrycia niż heterotypowy. Wysoka liczba UMI pomaga, ale duża prawdziwa komórka także ma wysoki sygnał.

Programy doublet detection dają score zależny od:

• loading;
• składu typów;
• liczby komórek;
• embeddingu;
• parametrów;
• oczekiwanej częstości.

Klaster z markerami dwóch linii może być doubletem, stanem przejściowym, komórką oddziałującą albo błędem anotacji. Potrzebne są dane techniczne i biologiczne.

Batch effect ma wiele źródeł

Batch może oznaczać:

• dawcę;
• ośrodek;
• dzień;
• operatora;
• protokół dysocjacji;
• chemistry 10x;
• lane;
• instrument;
• reference;
• pipeline;
• stan chorobowy splątany z ośrodkiem.

Integracja próbuje zidentyfikować wspólną strukturę i ograniczyć różnice techniczne. Nie wie automatycznie, która różnica jest niepożądana.

Jeśli wszystkie próbki chore pochodzą z jednego laboratorium, a zdrowe z drugiego, korekta może:

• usunąć prawdziwy efekt choroby;
• zachować batch jako „biologię”;
• stworzyć sztuczne sąsiedztwo;
• dać atrakcyjny UMAP bez identyfikowalnego efektu.

Projekt eksperymentalny jest ważniejszy niż algorytm integracji.

Overcorrection i undercorrection

Undercorrection pozostawia komórki rozdzielone według batch mimo podobnej biologii.

Overcorrection łączy stany, które powinny pozostać odrębne, albo usuwa rzadką populację obecną tylko w jednym warunku.

Kontrola integracji powinna obejmować:

• wykresy per donor i batch;
• zachowanie znanych markerów;
• mieszanie podobnych komórek;
• separację spodziewanych typów;
• sąsiedztwa lokalne;
• analizę bez integracji;
• stabilność w kilku parametrach;
• niezależną walidację.

Nie ocenia się integracji tylko po tym, że UMAP „wygląda czysto”.

PCA, kNN, klaster i UMAP

Typowy pipeline:

1. wybiera zmienne geny;
2. liczy PCA;
3. buduje graf najbliższych sąsiadów;
4. klastruje graf;
5. rysuje UMAP.

Każdy krok ma parametry. UMAP zachowuje głównie lokalne sąsiedztwa, ale:

• odległość między dalekimi klastrami nie jest skalą biologiczną;
• wielkość plamy nie jest liczbą komórek;
• osie nie mają bezpośredniego znaczenia;
• obrót i odbicie są dowolne;
• rozdzielenie może zależeć od seed;
• ciągłość na obrazie nie dowodzi linii rozwojowej.

Pseudotime wymaga osobnego modelu i założeń. UMAP nie daje kierunku różnicowania.

Klaster nie jest automatycznie typem komórki

Klaster jest zbiorem w grafie przy wybranej rozdzielczości. Może odzwierciedlać:

• typ komórki;
• stan aktywacji;
• fazę cyklu;
• stres;
• dawcę;
• batch;
• jakość;
• doublety;
• ciągły gradient.

Zmiana resolution może podzielić jeden klaster na pięć. Nie oznacza to odkrycia pięciu nowych typów.

Anotacja wymaga zestawu dowodów:

• markerów dodatnich;
• markerów wykluczających;
• spójności wielu genów;
• położenia i biologii tkanki;
• porównania z referencją;
• walidacji ortogonalnej;
• powtarzalności między dawcami.

Pojedynczy marker nie wystarcza, szczególnie jeśli jest indukowany stanem.

Typ, stan i kontinuum

Typ komórki sugeruje względnie stabilną tożsamość i program.

Stan może być przejściowy: aktywacja, cykl, stres, interferon, hipoksja.

Kontinuum nie ma naturalnej ostrej granicy, np. różnicowanie albo aktywacja.

W praktyce granica między typem i stanem bywa sporna. Atlas powinien umożliwiać hierarchiczną anotację:

komórka odpornościowa → limfocyt T → CD8 T → stan efektorowy

Zbyt ogólna etykieta traci informację. Zbyt szczegółowa może udawać pewność większą niż dane.

Ontologia porządkuje nazwy

Cell Ontology dostarcza identyfikatorów i relacji między terminami. CELLxGENE wymaga mapowania anotacji autora do schematu i terminów ontologicznych. Dokumentacja zaznacza, że etykiety pochodzą od autorów i są mapowane do najbliższego terminu CL.⁵

To nie jest automatyczna ponowna klasyfikacja wszystkich komórek przez jeden model. Dwa datasety mogą mieć:

• T cell;
• CD8-positive, alpha-beta T cell;
• effector CD8-positive, alpha-beta T cell.

Różna granularność nie oznacza, że ogólna grupa jest sumą szczegółowych etykiet w wyświetlonym zestawieniu. Przy agregacji trzeba świadomie przejść do wspólnego poziomu ontologii.

Ontologia jest wersjonowana. Termin może zostać dodany, zmieniony albo wycofany.

Marker nie jest definicją absolutną

Gen może być markerem względnym:

• wyższy w jednym klastrze niż w innych;
• obecny w określonej tkance;
• swoisty tylko dla etapu rozwoju;
• zależny od technologii;
• indukowany chorobą.

Marker użyty do nazwania klastra, a następnie „odkryty” jako różnicowo eksprymowany w tym klastrze, tworzy częściowo kołowe rozumowanie.

Silniejsza anotacja używa:

• panelu markerów;
• braku sprzecznych markerów;
• programów genowych;
• położenia przestrzennego;
• białek powierzchniowych;
• morfologii;
• lineage tracing;
• funkcji.

Label transfer jest predykcją

Mapowanie nowej komórki do referencji może działać przez najbliższych sąsiadów, model latentny lub klasyfikator. Wynik powinien zawierać:

• referencję i jej wersję;
• poziom etykiet;
• score lub prawdopodobieństwo;
• kryterium odrzucenia;
• kategorię unknown/unassigned;
• zgodność assay;
• zestaw genów;
• kontrolę out-of-distribution.

Model zawsze przypisujący jedną z istniejących etykiet może pewnie nazwać nowy lub artefaktowy stan. Możliwość „nie wiem” jest cechą jakości.

Referencja z dorosłej zdrowej tkanki może słabo mapować rozwój, guz albo organoid.

Cell type proportion wymaga dawców

Porównanie odsetka komórek między chorobą i kontrolą jest podatne na:

• wydajność dysocjacji;
• przeżywalność;
• enrichment/sorting;
• liczbę załadowanych komórek;
• doublety;
• compositionality;
• batch;
• różne miejsca biopsji.

Komórki w próbce sumują się do 100%, więc wzrost jednej grupy mechanicznie zmniejsza proporcje innych. Analiza powinna działać na replikach biologicznych i uwzględniać kompozycyjny charakter danych.

Dziesięć tysięcy komórek od jednego chorego nie tworzy dziesięciu tysięcy obserwacji częstości populacji.

Differential expression: komórka kontra dawca

Testowanie wszystkich komórek jako niezależnych daje zawyżoną pewność. Pseudobulk:

1. sumuje counts dla typu komórki w obrębie dawcy/próbki;
2. zachowuje biologiczne repliki;
3. używa modeli bulk RNA-seq;
4. może uwzględniać batch i covariates.

Ograniczenia pseudobulk:

• wymaga dostatecznej liczby komórek;
• traci heterogeniczność wewnątrz typu;
• zależy od poprawnej anotacji;
• rzadkie typy mogą być nieobecne u części dawców.

Modele mieszane mogą zachować poziom komórki, ale są bardziej złożone. W obu przypadkach donor ID jest niezbędny.

CELLxGENE Census jest wielkim korpusem, nie jednym eksperymentem

Census pozwala zapytać np. o wszystkie komórki określonego typu i tkanki. Wynik może jednak obejmować:

• wiele publikacji;
• różne assaye;
• zdrowie i chorobę;
• różne stadia;
• duplikaty komórek;
• nierówne liczby dawców;
• różną granularność anotacji.

Dokumentacja ostrzega, że korpus zawiera duplicate cells między datasetami. Pole is_primary_data pozwala ograniczyć je przy zliczaniu.¹⁰

Liczba komórek nie jest liczbą unikalnych dawców ani projektów.

Feature presence matrix

Nie każdy dataset mierzył albo zachował dokładnie ten sam zestaw genów. W Census feature presence matrix wskazuje, które geny były obecne w danym zbiorze.⁶

Jeśli gen ma same zera w jednym projekcie, trzeba sprawdzić:

• czy znalazł się w var;
• czy reference go zawierał;
• czy symbol się zmienił;
• czy mierzono pełny gen;
• czy nastąpiło mapowanie identyfikatorów.

Brak cechy nie jest zerową ekspresją. Przy łączeniu macierzy trzeba odróżnić missing od biological zero.

stable i latest

Census ma wersjonowane wydania:

• LTS/stable — przeznaczone do odtwarzalnych analiz i utrzymywane dłużej;
• weekly/latest — szybciej zawierają nowe dane, ale mają krótszą gwarancję dostępności.

Dokumentacja zaleca podawanie datowanego tagu builda. stable jest ruchomym aliasem: dziś i za rok może wskazywać inny release.⁷

Do notebooka publikacyjnego wpisuje się:

census_version = "YYYY-MM-DD"

a nie tylko latest.

Zmiana schematu może modyfikować:

• kolumny obs;
• wielowartościowe pola;
• unikalność symboli;
• dostępne gatunki;
• embeddingi;
• format zapytania.

Kod powinien walidować schemat.

obs, var i filtr programowy

Programowe zapytanie ma trzy części:

1. wybór organizmu;
2. filtr komórek po obs;
3. wybór cech po var.

Przykładowa specyfikacja:

organism: Homo sapiens
tissue ontology: lung
cell type ontology: endothelial cell
disease: normal
assay: jawnie wybrane
is_primary_data: True
genes: stabilne Ensembl IDs
release: datowany LTS

Wynik trzeba sprawdzić przed pobraniem ekspresji:

• liczba komórek;
• liczba datasetów;
• liczba dawców;
• rozkład assay;
• tissue;
• disease;
• sex;
• developmental stage.

Zapytanie zwracające milion komórek z jednego wielkiego projektu i tysiąc z dziesięciu mniejszych nie jest automatycznie zrównoważonym atlasem.

Normalized layer nie jest wspólną korektą batch

Census udostępnia raw i bibliotekowo znormalizowaną warstwę. Normalizacja wielkości biblioteki ułatwia porównanie skali komórek, ale nie usuwa:

• batch;
• różnic technologii;
• composition;
• donor effects;
• ambient RNA;
• annotation bias.

Nie jest też modelem differential expression. Użytkownik nadal musi dobrać przetwarzanie do pytania.

UMAP z portalu jest punktem wejścia

Interaktywny explorer pozwala:

• kolorować komórki etykietą;
• wyszukiwać gen;
• wybierać region UMAP;
• porównywać rozkłady;
• pobrać dataset.

To świetne narzędzie do odkrywania hipotez. Ręcznie zaznaczony obszar nie jest odtwarzalną definicją populacji, jeśli nie zapisano:

• dataset version;
• kryterium;
• listy cell IDs;
• parametrów embeddingu;
• kodu eksportu.

Wynik publikacyjny powinien być ponownie policzony z pliku lub API.

Reprezentacja biologiczna

Atlas może być ogromny, a nadal stronniczy względem:

• regionów świata;
• ancestry;
• wieku;
• płci;
• ciąży;
• chorób;
• terapii;
• jakości tkanki;
• narządów łatwych do pobrania;
• dawców zmarłych kontra żywych;
• protokołów dominujących w bogatych ośrodkach.

Sto milionów komórek nie zastępuje zróżnicowanych dawców.

Przy pytaniu o populację trzeba policzyć:

• unikalnych dawców;
• rozkład demograficzny;
• ośrodki;
• typ próbek;
• liczby per grupa;
• brakujące pola.

Nie należy imputować self-reported ethnicity z ancestry ani odwrotnie.

Tkanka, miejsce i stan

Etykieta lung może obejmować:

• miąższ;
• drogi oddechowe;
• oskrzela;
• naczynia;
• guz;
• tkankę sąsiadującą;
• płuca płodowe;
• organoid;
• lavage.

Ontologia pomaga hierarchizować, ale szerokie filtrowanie może połączyć nieporównywalne materiały. Podobnie normal może oznaczać:

• zdrowego dawcę;
• tkankę sąsiadującą z guzem;
• brak rozpoznanej choroby narządu;
• pole uzupełnione ogólną wartością.

Zawsze wraca się do projektu i specimen metadata.

Dane przestrzenne i multiomiczne

Atlasy rozszerzają się poza scRNA-seq:

• spatial transcriptomics;
• CITE-seq;
• scATAC-seq;
• multiome;
• repertuary receptorów;
• obrazy;
• perturbacje.

Obiekt „komórka” może być:

• pojedynczą komórką;
• jądrem;
• spotem obejmującym kilka komórek;
• segmentem obrazu;
• molekularnym profilem bez pełnej morfologii.

Nie można porównywać counts ze spotu Visium z komórką 10x jak identycznych obserwacji. Wymiar przestrzenny wymaga współrzędnych, obrazu, skali i metody segmentacji.

Prywatność nie kończy się po usunięciu nazwiska

Metadane pojedynczych dawców mogą umożliwiać reidentyfikację, zwłaszcza w rzadkiej chorobie, małej lokalizacji i połączeniu z publikacją. Sekwencja sama jest identyfikująca.

HCA ma open-access i managed-access. Dla części projektów dostęp wymaga wniosku, instytucjonalnego signing official i przeglądu przez właściwy komitet.⁸

Publiczny H5AD powinien usuwać bezpośrednie identyfikatory, ale użytkownik nadal ma obowiązki:

• nie próbować reidentyfikacji;
• przestrzegać data use agreement;
• nie łączyć danych w sposób naruszający zgodę;
• zabezpieczyć dane zarządzane;
• cytować dawców i zespoły poprzez wymagane źródła.

Jak ocenić dataset przed użyciem

1. Jaki jest cel projektu?
2. Ilu jest dawców, nie tylko komórek?
3. Jak pobrano tkankę?
4. scRNA czy snRNA?
5. Jaka technologia i chemistry?
6. Jakie są raw files i reference?
7. Kto wygenerował macierz?
8. Jak filtrowano komórki i geny?
9. Jak usunięto ambient RNA i doublety?
10. Jak wykonano integrację?
11. Kto anotował komórki i na jakim poziomie?
12. Czy etykiety są w ontologii?
13. Czy donor, disease i assay są dostępne per cell?
14. Czy dane są zduplikowane w innym dataset?
15. Jaka jest licencja, wersja i data?

Jeżeli dokumentacja nie odpowiada na kluczowe pytanie, zawęża się wniosek.

Minimalny workflow z HCA

1. Zacznij od projektu

Przeczytaj opis, publikację, protokoły i source accessions. Pobierz pełny manifest.

2. Wybierz macierz

Porównaj portal-generated i contributor-generated. Zapisz pipeline, format i wersję.

3. Połącz metadane

Użyj stabilnych identyfikatorów procesu i próbki. Sprawdź donor ID, specimen, assay i disease.

4. Zweryfikuj jednostki

Ustal, co jest komórką, biblioteką, próbką i dawcą. Usuń pseudoreplikację z modelu.

5. Odtwórz QC

Pokaż rozkłady per próbka. Porównaj własne filtry z filtrem autora.

6. Obejrzyj bez integracji

Sprawdź PCA/UMAP per batch, donor i condition przed korektą.

7. Anotuj hierarchicznie

Użyj markerów dodatnich i negatywnych, referencji oraz poziomu niepewności.

8. Testuj na poziomie dawcy

Pseudobulk lub model zachowujący strukturę próbki.

9. Analiza czułości

Zmień progi, integrację i granularność. Sprawdź stabilność wniosków.

10. Publikuj wersje

Manifest, H5AD checksum, source accessions, kod, środowisko, ontologie i atlas release.

Minimalny workflow z CELLxGENE Census

1. Wybierz datowany LTS release.
2. Pobierz obs dla planowanego filtra.
3. Policz datasety, dawców i assaye.
4. Ustaw is_primary_data = True, jeśli liczysz unikalne komórki.
5. Sprawdź ontology IDs zamiast tekstowych etykiet.
6. Zweryfikuj feature presence.
7. Ogranicz nierówne datasety albo modeluj ich wpływ.
8. Pobierz tylko potrzebne geny i komórki.
9. Zachowaj zapytanie oraz schema version.
10. Wróć do source datasets dla krytycznych wyników.

Tabela diagnostyczna

Objaw	Możliwa przyczyna	Kontrola
X ma ułamki	normalized/log/estimated counts	przeczytaj schema i layers
gen ma same zera	brak cechy w reference	feature presence i var
klaster ma markery dwóch typów	doublet, ambient RNA lub stan	score, UMI, próbki i markery
UMAP dzieli się według dawcy	batch albo prawdziwa zmienność	porównaj bez integracji i design
po integracji znika choroba	overcorrection	analiza bez korekty i per donor
milion komórek daje p < 10⁻¹⁰⁰	pseudoreplikacja	pseudobulk i liczba dawców
proporcja typu różni się 10×	dysocjacja, sorting, composition	protokół i repliki biologiczne
etykiety mają różną szczegółowość	różna granularność ontologii	zroluj do wspólnego rodzica
atlas przypisuje każdy profil	brak reject/unknown	score i out-of-distribution
komórki liczą się podwójnie	ten sam materiał w kilku datasetach	is_primary_data i source IDs
HCA i autor mają inne counts	inny pipeline/reference/filter	wybierz cel i zapisz źródło
stable zmienił wynik	alias wskazuje nowe LTS	użyj datowanego release

Co raportować

• projekt i publikacja;
• HCA UUID lub CELLxGENE collection/dataset ID;
• Census release;
• data pobrania;
• source accessions;
• assay i chemistry;
• reference genome/transcriptome;
• wersja macierzy i checksum;
• znaczenie X i layers;
• liczba komórek przed/po QC;
• liczba dawców i próbek;
• filtry;
• doublet i ambient RNA method;
• integracja;
• clustering resolution;
• ontologia i jej wersja;
• reguła anotacji;
• model statystyczny;
• analiza czułości;
• warunki dostępu i licencja.

Najkrótsza zasada

Komórka w atlasie ma sens dopiero jako:

dawca + specimen + assay + biblioteka + QC + wersja macierzy

Etykieta ma sens dopiero jako:

metoda anotacji + ontologia + poziom szczegółowości + niepewność

A porównanie ma sens dopiero jako:

biologiczne repliki + jawny batch + wersjonowana referencja + model statystyczny

Human Cell Atlas i CELLxGENE są potężne nie dlatego, że zamieniają biologię w jedną tabelę, lecz dlatego, że pozwalają przejść od szerokiej mapy do źródłowego projektu. Dobry użytkownik umie wykonać także drogę powrotną: od kolorowej kropki na UMAP do dawcy, próbki, biblioteki i pliku.

Przypisy