Streszczenie

Mikrotom przesuwa blok próbki o zadaną odległość względem ostrza i odcina cienki skrawek. Kriostat jest mikrotomem umieszczonym w komorze chłodniczej, dzięki czemu można ciąć materiał zamrożony.

Wyświetlone 5 µm oznacza nominalny posuw mechanizmu, nie gwarantowaną grubość każdego skrawka. Rzeczywisty preparat zależy od:

  • utrwalenia;
  • odwodnienia i zatopienia albo szybkości zamrożenia;
  • temperatury bloku i ostrza;
  • orientacji;
  • twardości;
  • kąta noża;
  • prędkości;
  • luzów mechanicznych;
  • compression;
  • chatter;
  • sposobu rozprostowania;
  • transferu na szkiełko.

Jakość ocenia się przez ciągłość, grubość/porównywalność, zachowanie morfologii, brak fałd i ubytków, integralność analitu oraz przydatność do barwienia, obrazowania lub mikrodysekcji.

Kriostat nie inaktywuje materiału. Świeża zamrożona tkanka może pozostać zakaźna, a ostrze i odpady łączą ryzyko skaleczenia z aerozolem oraz zanieczyszczeniem powierzchni.

Tor przygotowania skrawka: blok o kontrolowanym zatopieniu i temperaturze jest przesuwany względem ostrza, mechanika i kąt tworzą skrawek o nominalnej grubości, anti-roll i kąpiel przenoszą go na szkiełko; jakość określają grubość, compression, chatter, fałdy, ubytki i zachowanie analitu.
Tor przygotowania skrawka: blok o kontrolowanym zatopieniu i temperaturze jest przesuwany względem ostrza, mechanika i kąt tworzą skrawek o nominalnej grubości, anti-roll i kąpiel przenoszą go na szkiełko; jakość określają grubość, compression, chatter, fałdy, ubytki i zachowanie analitu.

Dwa urządzenia, dwa stany materiału

Mikrotom parafinowy

Tnie blok po:

  1. utrwaleniu;
  2. odwodnieniu;
  3. clearing;
  4. infiltracji parafiną;
  5. zatopieniu.

Materiał jest stabilny mechanicznie, lecz preparation może:

  • ekstrahować lipidy;
  • maskować epitopy;
  • modyfikować kwasy nukleinowe;
  • kurczyć;
  • deformować.
Kriostat

Tnie świeżą lub utrwaloną tkankę zamrożoną w medium, często OCT. Zalety:

  • szybkość;
  • zachowanie lipidów i niektórych enzymów;
  • mniejsze chemiczne przetwarzanie;
  • zgodność z wybranymi analizami RNA/protein.

Ograniczenia:

  • kryształy lodu;
  • trudniejsze ribbon;
  • zmienność temperatury;
  • zakaźność materiału;
  • condensation;
  • gorsza morfologia w części tkanek.

Mechanika mikrotomu

Blok porusza się pionowo lub obrotowo przy nieruchomym ostrzu albo odwrotnie, zależnie od konstrukcji. Po każdym cyklu feed mechanism przesuwa specimen o nominalny krok.

Grubość nominalna

Jeśli ustawiono 5 µm, mechanizm ma przesunąć blok o 5 µm na cykl. Skrawek może być cieńszy lub grubszy przez:

  • compression w kierunku cięcia;
  • rozszerzenie na water bath;
  • thermal expansion;
  • luz;
  • ugięcie ostrza;
  • drgania;
  • nierówną powierzchnię;
  • zmienną twardość.
Retraction

Niektóre mikrotomy odsuwają blok w ruchu powrotnym, aby nie ocierał o ostrze. Nieprawidłowa retraction może uszkadzać powierzchnię lub powodować nieregularny pierwszy skrawek.

Backlash

Luz w mechanizmie może ujawnić się po zmianie kierunku albo przerwie. Pierwsze skrawki po repositioning mogą nie odpowiadać ustawieniu i powinny podlegać zdefiniowanemu discard.

Ostrze

Disposable blade

Może być low-profile lub high-profile, o odmiennej geometrii. Wybór zależy od bloku i holder.

Knife

Noże stalowe, szklane lub diamentowe stosuje się w specjalistycznych zastosowaniach. Wymagają własnego maintenance i bezpieczeństwa.

Krawędź

Uszkodzenie daje:

  • pionowe rysy;
  • powtarzalne ubytki;
  • rozrywanie;
  • pasma;
  • brak ciągłości.

Przesunięcie na świeży fragment może pomóc, ale całe ostrze trzeba uznać za contaminated po kontakcie z materiałem.

Clearance angle

Kąt między facet ostrza a powierzchnią bloku musi umożliwiać cięcie bez nadmiernego tarcia.

Za mały:

  • skrawek nie oddziela się;
  • compresses;
  • blok ociera.

Za duży:

  • ostrze „kopie”;
  • chatter;
  • thick-thin;
  • uszkodzenie powierzchni.

Wartość na holder nie musi być dokładnym kątem efektywnym, jeśli blade profile lub holder są inne.

Przygotowanie bloku parafinowego

Utrwalenie

Niedostateczne daje miękkie obszary i autolysis. Nadmierne może pogarszać epitopy oraz kwasy nukleinowe. Grubość fragmentu i stosunek fixative volume do tissue wpływają na penetrację.

Processing

Niewystarczające odwodnienie lub infiltracja powodują:

  • mushy core;
  • dziury;
  • rozrywanie;
  • odspajanie.

Przeprocessing może czynić tkankę kruchą.

Orientacja

Decyduje, jaka struktura pojawi się w płaszczyźnie. Niewłaściwa nie jest defektem możliwym do naprawienia lepszym ostrzem.

Przykłady:

  • nabłonek ustawiony prostopadle do powierzchni;
  • przekrój poprzeczny przewodu;
  • wszystkie fragmenty biopsji w jednej płaszczyźnie;
  • region zainteresowania najbliżej cutting face.
Chłodzenie

Blok parafinowy można schłodzić, aby zwiększyć twardość. Zbyt zimny jest kruchy, a kondensacja może wpływać na ribbon.

Przygotowanie bloku zamrożonego

Szybkość zamrażania

Wolne zamrażanie tworzy większe kryształy lodu, które rozrywają strukturę. Szybkie chłodzenie ogranicza artefakt, ale:

  • zbyt gwałtowne może pękać medium;
  • bezpośredni ciekły azot może powodować film gazowy i nierówny transfer;
  • isopentane wymaga kontroli temperatury oraz bezpieczeństwa pożarowego.
OCT

Medium podtrzymuje mechanicznie, ale:

  • nie utrwala;
  • rozcieńcza powierzchnię;
  • może przeszkadzać w mass spectrometry;
  • ma własną temperaturę cięcia;
  • nadmiar zasłania orientację.
Orientacja przed zamrożeniem

Po pełnym zamrożeniu korekta wymaga remounting, które może ogrzać tkankę i zniszczyć region. Plan płaszczyzny powinien powstać wcześniej.

Equilibration

Blok z −80°C przeniesiony do komory −20°C potrzebuje czasu. Cięcie przed wyrównaniem daje pęknięcia i zmienia temperaturę w kolejnych skrawkach.

Temperatura kriostatu

Jedna temperatura nie pasuje do każdej tkanki:

  • tłuszcz wymaga zwykle niższej;
  • mózg i tkanki wodne zachowują się inaczej;
  • fibrous tissue może wymagać kompromisu;
  • OCT i block temperature mogą różnić się od air setpoint.
Za ciepło
  • skrawek się rozmazuje;
  • przykleja do ostrza;
  • compresses;
  • nie przechodzi pod anti-roll.
Za zimno
  • pęka;
  • kruszy się;
  • tworzy chatter;
  • odspaja się od OCT;
  • powierzchnia wygląda jak pokryta śniegiem.

Trzeba zapisać chamber i specimen-head setting oraz dać systemowi czas po zmianie.

Anti-roll plate i pędzelek

Anti-roll plate utrzymuje skrawek płasko przy ostrzu.

Ustawienie:

  • krawędź równoległa do blade;
  • właściwa odległość;
  • brak uszkodzeń;
  • czystość;
  • temperatura.

Za daleko pozwala skrawkowi zwijać się. Za blisko ściska lub rozrywa.

Pędzelek daje kontrolę manualną, ale włos może zanieczyszczać, uszkadzać tkankę i wprowadzać zmienność operatora.

Ribbon parafinowy

Kolejne skrawki łączą się krawędziami w ribbon dzięki parafinie. Brak ribbon może wynikać z:

  • złej temperatury;
  • zbyt dużego kąta;
  • tępego blade;
  • suchej parafiny;
  • nierównych boków bloku;
  • statyki.

Ribbon nie jest celem samym w sobie. Ładna wstęga z silnym compression nadal daje błędną geometrię.

Kąpiel wodna

Skrawek parafinowy rozprostowuje się na ciepłej wodzie.

Za niska temperatura:

  • fałdy pozostają;
  • skrawek nie rozciąga się.

Za wysoka:

  • nadmiernie rozciąga;
  • rozrywa;
  • wypłukuje składniki;
  • sprzyja odspajaniu;
  • zmienia morfometrię.

Temperaturę ustala się względem melting point parafiny i sprawdza niezależnym termometrem.

Kontaminacja

„Floaters” mogą pochodzić z poprzednich bloków lub brudnej kąpieli. Wodę, powierzchnię i narzędzia czyści się zgodnie z planem, a podejrzany obcy fragment musi uruchomić ocenę identity.

Transfer na szkiełko

Znaczenie mają:

  • rodzaj szkła;
  • powłoka adhezyjna;
  • czystość;
  • znakowanie;
  • orientacja skrawka;
  • drying;
  • czas do fixation;
  • warunki przechowania.

Naładowane szkło poprawia adhezję, ale nie naprawia przegrzania ani złej infiltracji.

Warm pickup frozen section

Ciepłe szkiełko może zebrać skrawek przez chwilowe topnienie kontaktowe. Zbyt długie ogrzanie degraduje RNA lub zmienia enzymy.

Slide identity

Etykieta powinna istnieć przed transferem. Ręczne przenoszenie wielu bloków równocześnie zwiększa ryzyko zamiany. Barcode, block ID, slide ID i level muszą być powiązane.

Grubość: jak ją ocenić

Nominal setting można sprawdzić:

  • interferometrycznie;
  • profilometrią;
  • przez optical density odpowiedniego jednorodnego materiału;
  • zliczając warstwy/całkowity feed;
  • na specjalnym wzorcu.

W rutynowej histologii używa się także wskaźników pośrednich:

  • barwa;
  • visibility nuclei;
  • overlap;
  • folds;
  • morphometric consistency.

Nie każdy skrawek można łatwo zmierzyć bez zniszczenia. OQ ocenia mechanizm/wzorzec, a PQ potwierdza preparat i wynik.

Artefakty diagnostyczne

Compression

Skrawek jest krótszy w kierunku cięcia. Przyczyny:

  • tępe blade;
  • ciepły blok;
  • za duża prędkość;
  • zły angle;
  • miękka parafina.

Morfometria bez korekcji może być obciążona kierunkowo.

Chatter

Naprzemienne grube/cienkie pasma lub „venetian blind”:

  • zbyt twardy/zimny blok;
  • duży clearance angle;
  • luźny holder;
  • szybkie cięcie;
  • wibracje;
  • twardy materiał w miękkiej tkance.
Knife lines

Stałe pionowe linie wskazują nick w ostrzu lub twardą cząstkę.

Fałdy

Skrawek nakłada się na siebie. Zwiększa lokalną grubość i intensity stain.

Holes i tearing

Mogą wynikać z niedostatecznego processing, calcification, zanieczyszczeń albo złej temperatury.

Ice crystal

Puste przestrzenie i „Swiss cheese” w frozen tissue zwykle świadczą o zbyt wolnym zamrażaniu lub rozmrożeniu/refreezing.

Curl

Nierównowaga temperatury, blade/anti-roll i statyka.

Trimming, levels i serial sections

Trimming

Usuwa nadmiar medium/parafiny i eksponuje tkankę. Gruby trim może ominąć małą zmianę.

Level

„Level 1” musi mieć lokalną definicję: pierwszy complete face, pierwsza collected section czy po określonym feed.

Serial sections

Kolejne skrawki nie są niezależnymi próbkami. Ta sama komórka może pojawić się w kilku, jeśli grubość jest mniejsza od jej wymiaru.

Interval sections

Jeśli między collected slides odrzuca się określoną grubość, record powinien obejmować liczbę cykli lub µm. Manualne „trochę dalej” jest niepowtarzalne.

Materiał do RNA, DNA i białka

RNA

Potrzebne:

  • RNase control;
  • szybki proces;
  • zimne, czyste tools;
  • właściwe slides;
  • ograniczenie thaw;
  • zapis czasu.

Protokoły laser-capture podkreślają natychmiastowe utrzymanie frozen sections w niskiej temperaturze i kontrolę RNase1.

DNA

Crosslink i processing FFPE wpływają na fragmentację. Grubość oraz powierzchnia skrawka wpływają na yield.

Białko

Epitopes zależą od fixation, heating, storage i oxidation. Frozen section nie gwarantuje natywnej aktywności, jeśli wielokrotnie thawed.

Mikrodysekcja

Liczy się:

  • membrane slide;
  • adherence;
  • thickness;
  • stain time;
  • area;
  • contamination z sąsiedniej tkanki;
  • aktualna histologia.

Bezpieczeństwo ostrza

Najwięcej urazów zdarza się podczas:

  • wkładania i wyjmowania blade;
  • orientacji bloku;
  • czyszczenia;
  • usuwania odpadów;
  • sięgania przez otwartą krawędź;
  • odblokowanego handwheel.
Zasady
  • najpierw zablokować handwheel;
  • założyć blade guard;
  • manipulować bloczkiem dopiero potem;
  • używać narzędzia do wyjmowania;
  • nie łapać spadającego ostrza;
  • odkładać zużyte bezpośrednio do sharps;
  • czyścić ruchem od krawędzi, nigdy ku niej;
  • nie pozostawiać blade w niezabezpieczonym holder.

Rękawica cut-resistant ogranicza uraz przy czyszczeniu, ale nie daje pełnej ochrony przed puncture i nie zastępuje guard.

Kriostat i zakaźność

CDC opisuje frozen sectioning świeżej tkanki jako high-risk: freezing nie zabija organizmów, a ostrze może generować zakaźny aerosol; pressurized freezing spray zwiększa rozprzestrzenianie materiału2.

Ocena obejmuje:

  • pochodzenie ludzkie/zwierzęce;
  • znane i nieznane czynniki;
  • priony;
  • fresh versus fixed;
  • containment;
  • wentylację;
  • PPE;
  • plan dekontaminacji;
  • odpady;
  • zdarzenie skaleczenia.
UV

Lampa UV nie zastępuje terminal cleaning. Cienie, lód, zabrudzenie i ograniczona penetracja uniemożliwiają pełną dekontaminację.

Pressurized spray

Nie powinno się używać freezing sprays bez zwalidowanej oceny; mogą aerosolizować bieżący materiał i pozostałości poprzednich próbek.

Odpady

Shavings, sections, OCT, blade i wipes traktuje się zgodnie z ryzykiem biologicznym. Zimny odpad nie jest inaktywowany.

Dekontaminacja

Procedura zależy od czynnika i kompatybilności:

  1. zakończyć pracę i oznaczyć urządzenie;
  2. zablokować mechanizm;
  3. bezpiecznie usunąć blade;
  4. zebrać odpady;
  5. defrost, jeśli wymagany;
  6. usunąć organic load;
  7. zastosować właściwy disinfectant w stężeniu i czasie;
  8. objąć komorę, holder, tray, anti-roll i surfaces;
  9. spłukać/ochronić elementy;
  10. wysuszyć;
  11. złożyć;
  12. wykonać release check.

Harmonogram powinien obejmować zbieranie contaminated trimmings oraz okresową decontamination kriostatu i mikrotomu.

Priony wymagają specjalnych procedur i często dedykowanego wyposażenia. Rutynowy alkohol nie jest rozwiązaniem.

Chemiczne ryzyka

W procesie mogą występować:

  • formaldehyde;
  • xylene/substitutes;
  • alcohol;
  • isopentane;
  • stains;
  • adhesives;
  • disinfectants.

Kriostat ogranicza temperaturę, ale nie neutralizuje vapor po użyciu substancji. Isopentane jest lotny i łatwopalny; dry ice/cryogens wnoszą ryzyko cold burn i displacement of oxygen.

Kwalifikacja urządzenia

IQ mikrotomu
  • model i serial;
  • holder i blade types;
  • zakres feed;
  • handwheel lock i guard;
  • stół i stabilność;
  • akcesoria;
  • dokumentacja.
IQ kriostatu

Dodatkowo:

  • refrigeration;
  • chamber/specimen control;
  • defrost;
  • drainage;
  • wentylacja;
  • UV, jeśli obecne;
  • alarm;
  • plan dekontaminacji.
OQ
  • feed accuracy/repeatability;
  • thickness settings;
  • retraction;
  • holder stability;
  • angle;
  • handwheel;
  • locks/interlocks;
  • temperature mapping;
  • recovery po otwarciu;
  • alarm;
  • defrost;
  • niezależny thermometer.
PQ
  • reprezentatywne tkanki;
  • tłusta, twarda, miękka;
  • parafina i frozen;
  • minimum/maximum thickness;
  • ribbon/anti-roll;
  • morphology;
  • stain;
  • RNA/protein endpoint;
  • operatorzy i dni.

Mapowanie temperatury kriostatu

Setpoint nie dowodzi temperatury:

  • specimen head;
  • blade holder;
  • chamber center;
  • tray;
  • region przy drzwiach.

Mapowanie obejmuje:

  • empty;
  • loaded;
  • po otwarciu;
  • po włożeniu ciepłego bloku;
  • defrost/restart;
  • stabilization time.

Sensor użytkowy powinien monitorować miejsce reprezentatywne dla procesu.

Kontrola jakości skrawka

Przed serią
  • stan blade;
  • holder;
  • angle;
  • blok i orientacja;
  • temperature;
  • water bath;
  • slides;
  • identity;
  • cleanliness.
W serii
  • compression;
  • chatter;
  • folds;
  • tissue completeness;
  • level;
  • floaters;
  • thick/thin;
  • adhesion.
Po
  • stain quality;
  • morphology;
  • downstream yield;
  • archive block;
  • slide count;
  • reconciliation.

Walidacja

Macierz:

  • co najmniej trzy thickness;
  • kilka tissue types;
  • blade lots;
  • operators;
  • days;
  • chamber temperatures;
  • paraffin lots;
  • water-bath range;
  • transfer methods;
  • downstream assays.

Endpoints:

  • thickness or proxy;
  • morphometric bias;
  • wrinkle/fold rate;
  • section loss;
  • RNA integrity/yield;
  • stain uniformity;
  • operator injury-free workflow;
  • cross-contamination.

Minimalny rekord

  • specimen/block ID;
  • tissue i preparation;
  • fixation/freezing;
  • embedding medium/lot;
  • orientation;
  • urządzenie/serial;
  • blade type/lot;
  • angle;
  • thickness setting;
  • trim/level;
  • chamber i specimen temperature;
  • water bath;
  • slides i coating;
  • liczba sections;
  • operator/czas;
  • artefakty;
  • decontamination status;
  • downstream disposition.

Najczęstsze błędy

„Ustawiono 5 µm, więc ma 5 µm”

Feed jest nominalny, a compression i processing zmieniają skrawek.

„Zamrożenie sterylizuje”

Nie. Materiał może pozostać zakaźny.

„UV wyczyści komorę”

Nie zastępuje usunięcia organic load i chemicznej procedury.

„Twardszy blok wymaga tylko większej siły”

Może wymagać innej temperatury, blade, angle albo decalcification; siła zwiększa chatter i uraz.

„Fałd można zignorować poza regionem”

Może utrudniać identity i wprowadzać obcy fragment. Ocena musi być jawna.

„Woda rozprostuje każdy skrawek”

Za gorąca zmienia geometrię i analit, a nie naprawia złego cięcia.

Checklista przed cięciem

  • Czy identity bloku i slides jest zgodne?
  • Czy orientacja odpowiada pytaniu?
  • Czy blade jest zabezpieczone do momentu pracy?
  • Czy holder i angle są właściwe?
  • Czy blok osiągnął temperaturę?
  • Czy thickness/level są zdefiniowane?
  • Czy water bath jest sprawdzona?
  • Czy urządzenie ma aktualny cleaning status?
  • Czy ryzyko biologiczne jest ocenione?
  • Czy PPE, waste i sharps są gotowe?
  • Czy downstream wymaga RNase-free lub szybkiego transferu?
  • Czy kryteria artefaktów są znane?

Checklista po cięciu

  • Czy wszystkie slides i levels są rozliczone?
  • Czy skrawki są kompletne, płaskie i porównywalne?
  • Czy nie pojawiły się floaters?
  • Czy blade został zabezpieczony/usunięty?
  • Czy shavings trafiły do właściwego odpadu?
  • Czy komora i narzędzia zostały zdekontaminowane?
  • Czy block wrócił do właściwych warunków?
  • Czy artefakty i odchylenia zapisano?
  • Czy preparat przeszedł downstream QC?

Najkrótsza zasada

Mikrotom ustawia posuw, nie gwarantuje grubości preparatu. Dobry skrawek powstaje z kontrolowanej preanalityki, temperatury, geometrii ostrza i transferu, a w kriostacie także z pełnej oceny zakaźności i dekontaminacji.