Klonowanie bydła: oocyty z rzeźni, dojrzewanie in vitro, ciąża i potomstwo

Streszczenie

Bydło stało się jednym z głównych modeli klonowania ssaków nie dlatego, że SCNT działa u niego łatwo, lecz dlatego, że wokół rozrodu krów istniały już rozwinięte technologie: pozyskiwanie oocytów, dojrzewanie i zapłodnienie in vitro, hodowla zarodków, synchronizacja biorczyń oraz transfer zarodka. Jajniki z rzeźni dają dużą liczbę niedrogich oocytów do badań, ale ich pochodzenie i jakość są zmienne. OPU pozwala pobierać oocyty od znanych żywych dawczyń, lecz wymaga powtarzanych zabiegów i także nie gwarantuje kompetencji rozwojowej.

W typowym schemacie kompleksy oocyt–komórki kumulusa dojrzewają in vitro do metafazy II, usuwa się z nich wrzeciono z chromosomami, wprowadza komórkę somatyczną dawcy genomu, wywołuje fuzję i aktywację, a zarodki hoduje do blastocysty. Blastocysta nie jest jednak końcem eksperymentu. U bydła poważne straty występują po transferze: podczas rozpoznania ciąży, tworzenia łożyska, wzrostu płodu, porodu i okresu noworodkowego.

Najbardziej charakterystyczne są zaburzenia tkanek pozazarodkowych, nieprawidłowe placentomy, hydroallantois, utraty ciąży i zespół dużego potomstwa. Zdrowy dorosły klon może funkcjonować i rozmnażać się w typowym zakresie, a potomstwo uzyskane płciowo nie przechodzi ponownie przez SCNT. Nie wolno jednak wybierać wyłącznie ocalałych dorosłych i na ich podstawie oceniać kosztu całej procedury.

Dlaczego właśnie bydło

Pierwsze sukcesy transferu jąder u bydła wyrastały z przemysłu embrionalnego rozwiniętego na długo przed SCNT. Hodowcy i embriolodzy umieli już:

• kontrolować cykl płciowy dawczyń i biorczyń;
• pobierać oraz oceniać oocyty;
• produkować zarodki in vitro;
• kriokonserwować i transportować materiał rozrodczy;
• wykonywać niesurgiczny transfer do macicy;
• rejestrować rodowody, cechy użytkowe i zdrowie potomstwa.

Bydło ma przy tym długą ciążę, małą naturalną liczbę potomstwa i kosztowne utrzymanie. Jest więc dobrym modelem biologii dużego ssaka, lecz słabym systemem do szybkiego wykonywania wielu pokoleń. Jeden wynik w postaci cielęcia wymaga miesięcy monitorowania i zaangażowania wielu zwierząt.

W 1998 roku Kato i współpracownicy opisali osiem cieląt po użyciu komórek kumulusa lub nabłonka jajowodu jednej dorosłej krowy.¹ Wyjątkowo wysoki wynik tej małej serii nie stał się uniwersalnym poziomem skuteczności. Publikacja była ważna jako dowód, że jądro zróżnicowanej komórki dorosłego bydła może pokierować pełnym rozwojem.

Bydło nie jest „dużą myszą”

Główna aktywacja genomu zarodkowego u myszy zachodzi wcześniej niż u bydła. W zarodku bydlęcym pierwsza transkrypcja pojawia się wcześnie, lecz szeroka aktywacja wielu klas genów nasila się około stadium ośmiu komórek, tradycyjnie opisywanego jako przedział 8–16 komórek.² Zarodek musi do tego czasu korzystać z RNA i białek zgromadzonych w oocycie.

Różni się też implantacja i budowa łożyska. Bydlęcy konceptus wydłuża się przed trwałym przyłączeniem, sygnalizuje obecność matce interferonem tau, a wymiana z macicą organizuje się w placentomach. Wyniku uzyskanego u myszy nie można więc przenieść na krowę przez proste przeskalowanie dawki albo czasu.

W jednym cielęciu spotykają się trzy zwierzęta

Opis „sklonowano krowę” ukrywa co najmniej trzy źródła biologiczne:

1. dawca komórki somatycznej dostarcza niemal cały genom jądrowy;
2. dawczyni oocytu dostarcza cytoplazmę, mitochondria, RNA i białka;
3. biorczyni zarodka zapewnia macicę, łożyskową stronę matczyną, metabolizm ciąży i środowisko porodu.

Te role może pełnić trzy różne krowy. Klon jest zgodny z dawcą komórki pod względem jądrowego DNA, ale nie jest biologiczną kopią całego jego rozwoju. Mitochondrialny genom pochodzi głównie od dawczyni oocytu, a środowisko prenatalne — od nosicielki.

Do tego dochodzą warunki laboratorium: pożywka, temperatura, napięcie tlenu, czas manipulacji i skład partii surowicy. Porównanie dwóch protokołów wymaga więc zanotowania nie tylko genotypu dawcy jądra, lecz także źródła oocytów, partii hodowlanej i biorczyń.

Dwa główne źródła oocytów

Jajniki z rzeźni

W badaniach bydła powszechnie wykorzystuje się jajniki pozyskane po uboju. Transportuje się je do laboratorium, a widoczne pęcherzyki aspiruje lub nacina, odzyskując kompleksy oocyt–kumulus. Ta droga daje dużo materiału bez hormonalnej stymulacji żywych dawczyń i bez utrzymywania własnego stada oocytowego.³

Cena tej dostępności to niejednorodność. Laboratorium może nie znać:

• wieku, stanu metabolicznego i historii rozrodu krowy;
• dokładnej fazy cyklu jajnikowego;
• czasu od uboju do pobrania;
• temperatury i niedokrwienia tkanki podczas transportu;
• wielkości oraz stanu pęcherzyka przed pobraniem;
• genotypu mitochondrialnego i chorób dawczyni.

„Oocyt z rzeźni” nie jest jedną kategorią jakości. Dwie partie z różnych dni mogą dać inny odsetek dojrzewania i blastocyst, chociaż protokół SCNT pozostaje identyczny. W badaniu porównawczym dzień pobrania lub pula jajników może być jednostką biologiczną ważniejszą niż pojedynczy oocyt.

Ovum pick-up od żywej dawczyni

W OPU pęcherzyki są uwidaczniane ultrasonograficznie, a ich zawartość pobiera się przez prowadnicę i igłę. Można wracać do znanej dawczyni, łączyć dane o jej wieku i genotypie z wynikami oraz pozyskiwać oocyty od zwierząt, których nie przeznacza się do uboju.

OPU ma inne ograniczenia:

• wymaga unieruchomienia, obsługi weterynaryjnej i powtarzanych wkłuć;
• odzysk kompleksów zależy od liczby oraz wielkości pęcherzyków;
• aspiracja może pobrać oocyty na różnych etapach kompetencji;
• harmonogram stymulacji zmienia kohortę pęcherzyków;
• wydajność należy liczyć na zabieg i dawczynię, nie tylko na odzyskany oocyt.

Oocyt OPU nie jest automatycznie lepszy od pośmiertnego. Jego przewagą eksperymentalną jest przede wszystkim kontrolowane pochodzenie i możliwość projektowania powtarzanych pobrań.

Oocyt dojrzały in vivo

Można również pobierać oocyty po hormonalnym dojrzewaniu w organizmie. Cytoplazma rozwijała się wtedy w środowisku pęcherzyka, lecz metoda ogranicza skalę, zwiększa koszt i obciążenie dawczyń. Wybór źródła jest kompromisem między liczbą, jakością, identyfikowalnością i dobrostanem.

Kompleks oocyt–kumulus jest jednostką, nie opakowaniem

Oocyt odzyskuje się zwykle wraz z warstwami komórek kumulusa. Ich wygląd pomaga wstępnie ocenić materiał: zwarty, wielowarstwowy kumulus i jednorodna cytoplazma są zwykle lepszym znakiem niż nagi oocyt lub kompleks wyraźnie zdegenerowany. Ocena morfologiczna nie widzi jednak mitochondriów, wrzeciona ani pełnego zapasu RNA.

Kumulus:

• pośredniczy w wymianie małych cząsteczek przez połączenia szczelinowe;
• przekazuje sygnały pęcherzykowe;
• wspiera metabolizm oocytu;
• rozszerza się podczas dojrzewania;
• może sam stać się źródłem komórek dawcy jądra.

Usunięcie kumulusa jest potrzebne do oceny ciałka kierunkowego i manipulacji, ale moment denudacji ma znaczenie. Zbyt wczesne odłączenie pozbawia oocyt części wsparcia podczas IVM; pozostawienie komórek utrudnia później precyzyjną enukleację.

IVM: dojrzewanie jądrowe i cytoplazmatyczne

Oocyty z pęcherzyków nie są zwykle gotowe do SCNT. Ich chromosomy znajdują się w stadium pęcherzyka zarodkowego, a mejoza jest zatrzymana. Po wyjęciu z pęcherzyka i umieszczeniu w pożywce blokada zanika. W typowym systemie bydła kompleksy hoduje się około 21–24 godzin, lecz dokładny czas zależy od źródła materiału i warunków.⁴

Dojrzewanie jądrowe obejmuje:

• rozpad otoczki pęcherzyka zarodkowego;
• kondensację chromosomów;
• pierwszy podział mejotyczny;
• usunięcie pierwszego ciałka kierunkowego;
• zatrzymanie chromosomów oocytu w metafazie II.

Dojrzewanie cytoplazmatyczne obejmuje równolegle:

• reorganizację mitochondriów i siateczki śródplazmatycznej;
• gromadzenie i modyfikację RNA oraz białek;
• przygotowanie układu oscylacji wapniowych;
• zmianę ziaren korowych;
• przygotowanie czynników zdolnych przebudować obce jądro.

Widoczne ciałko kierunkowe potwierdza istotny etap dojrzewania jądrowego, ale nie dowodzi pełnej kompetencji cytoplazmy. Oocyt może wyglądać jak MII i nadal nie zapewnić prawidłowej aktywacji ani przeprogramowania.

Pożywka nie jest neutralnym tłem

System IVM dostarcza substraty energetyczne, aminokwasy, sole, hormony i białka. Zmiana surowicy, gonadotropin, czynników wzrostu lub gazów wpływa na komórki kumulusa i metabolizm oocytu. Surowica ułatwia wzrost, ale jest materiałem złożonym, zmiennym między partiami i może wnosić niezdefiniowane sygnały.

Dlatego wynik „oocyty dojrzewały in vitro” jest zbyt skąpy do odtworzenia eksperymentu. Potrzebne są źródło kompleksów, kryteria selekcji, czas transportu, skład i partia medium, czas IVM, temperatura, atmosfera oraz odsetek rzeczywistych oocytów MII.

Dojrzewanie nie jest zwykłym czekaniem

Pęcherzyk in vivo przez długi czas koordynuje rozwój oocytu i komórek somatycznych. Standardowa IVM wywołuje wznowienie mejozy po izolacji, nie zawsze dając cytoplazmie czas na pełne przygotowanie. Protokoły próbujące kontrolować przejście przed IVM mają odtworzyć część tej synchronizacji, ale ich sukces trzeba mierzyć dalej niż przez obecność ciałka kierunkowego.

Komórka dawcy: genotyp plus historia hodowli

Źródłem jądra mogą być fibroblasty skóry, komórki kumulusa, komórki nabłonkowe albo inne komórki somatyczne. Ich nazwa nie opisuje całego stanu. Znaczenie mają:

• wiek i zdrowie zwierzęcia;
• miejsce biopsji;
• liczba pasaży;
• warunki kriokonserwacji;
• kontakt z surowicą i tlenem;
• stabilność chromosomowa;
• faza cyklu;
• ewentualna edycja i selekcja klonalna.

Przed użyciem sprawdza się tożsamość linii, zanieczyszczenia mikrobiologiczne, morfologię, wzrost i liczbę chromosomów. Dla linii edytowanej dochodzą sekwencja całego locus, miejsca off-target, liczba kopii inserta i brak niepożądanego DNA wektorowego.

Zgodność cyklu komórkowego

Dojrzały oocyt MII ma wysoką aktywność MPF. Jądro dawcy w G0/G1 zawiera diploidalny zestaw niezreplikowanego DNA, czyli 2n/2C. Po kontakcie z cytoplazmą jego chromosomy mogą zostać skondensowane, a po aktywacji powinny wejść w fazę S w rytmie nowego zarodka.

Jądro w trakcie S może częściowo powielić DNA drugi raz albo wejść w przebudowę z niezgodnym stanem replikacji. Jądro G2 ma 4C i wymaga innej koordynacji. Z tego powodu komórki dawcy często doprowadza się do G0/G1 przez ograniczenie surowicy, kontaktową inhibicję lub dobór populacji.

„Wygłodzenie” nie jest jednak magicznym przeprogramowaniem. Zmienia metabolizm, stres i transkrypcję, a populacja nie staje się idealnie jednorodna. Należy zmierzyć rozkład cyklu i przeżycie, zamiast wnioskować o nich z samego czasu hodowli.

Selekcja edytowanego klonu ma podwójny koszt

SCNT jest atrakcyjne po edycji genomu, ponieważ pozwala najpierw wybrać komórkę z pożądanym allelem, a następnie utworzyć z niej zwierzę bez mozaikowatości typowej dla części edycji zarodków. Ten zysk ma cenę. Pojedynczy klon komórkowy przeszedł:

1. dostarczenie edytora;
2. odpowiedź na uszkodzenie DNA;
3. selekcję;
4. wzrost z jednej komórki;
5. liczne podziały przed SCNT.

Wszystkie jego warianty, nie tylko zmiana zaplanowana, stają się genomem jądrowym cielęcia. Kontrola linii dawcy jest więc kontrolą przyszłego zwierzęcia.

Enukleacja: trzeba usunąć chromosomy, zachowując cytoplazmę

W oocycie MII wrzeciono leży przy korze, blisko pierwszego ciałka kierunkowego. Operator unieruchamia oocyt pipetą trzymającą i usuwa mały fragment zawierający wrzeciono oraz chromosomy. Położenie ciałka pomaga, ale nie gwarantuje dokładnego położenia wrzeciona.

Chromosomy można uwidaczniać barwnikiem DNA i krótką ekspozycją na światło albo obserwować wrzeciono metodą wykorzystującą dwójłomność. Każde podejście ma kompromisy:

• barwnik i UV ułatwiają potwierdzenie, lecz mogą uszkadzać materiał;
• obrazowanie wrzeciona ogranicza barwienie, ale wymaga odpowiedniej aparatury i wprawy;
• enukleacja „na ślepo” jest szybsza, ale zwiększa ryzyko pozostawienia chromosomów;
• większa biopsja zwiększa pewność usunięcia, lecz zabiera więcej cytoplazmy.

Pozostawione chromosomy oocytu mogą dać nieprawidłową ploidalność. Zbyt agresywna enukleacja usuwa czynniki przeprogramowujące, mitochondria i korę potrzebną do dalszego rozwoju.

Rekonstrukcja przez fuzję albo wstrzyknięcie

W bydlęcym SCNT często umieszcza się całą komórkę dawcy pod osłonką przejrzystą, obok błony oocytu, a następnie przykłada impuls elektryczny. Pole tworzy przejściowe pory i sprzyja połączeniu błon. Alternatywnie jądro lub komórkę można wprowadzić mikropipetą.

Fuzja ma kilka możliwych wyników:

• komórka łączy się prawidłowo z oocytem;
• błony nie łączą się;
• oocyt ulega lizzie;
• komórka pozostaje w przestrzeni okołożółtkowej;
• dochodzi do fuzji, lecz jądro nie jest prawidłowo przebudowane.

Odsetek fuzji należy więc raportować osobno od odsetka oocytów, które przeżyły enukleację, oraz od późniejszego rozwoju. Ponowienie impulsu może ratować część prób, ale zwiększa obciążenie elektryczne i nie jest niewidocznym etapem.

Aktywacja zastępuje sygnał plemnika

Po zapłodnieniu plemnik uruchamia serię oscylacji wapnia, spadek aktywności MPF, wyjście z MII i tworzenie pronukleusów. W SCNT plemnika nie ma. Aktywację wywołuje się bodźcem elektrycznym lub chemicznym, często łącząc krótkie podniesienie wapnia z czasowym hamowaniem syntezy białka albo kinaz.

Za słaby bodziec może nie uruchomić rozwoju. Zbyt silny lub źle zsynchronizowany może zaburzyć metabolizm, segregację chromosomów i dalsze podziały. Ocenia się nie tylko pierwsze bruzdkowanie, ale też:

• powstanie prawidłowych struktur jądrowych;
• liczbę chromosomów;
• czas pierwszego podziału;
• rozwój do moruli i blastocysty;
• ekspresję po aktywacji genomu;
• zdolność do ciąży.

Pierwszy podział jest niskim progiem. Uszkodzony oocyt może wykonać kilka podziałów dzięki zapasom cytoplazmy i zatrzymać się dopiero wtedy, gdy potrzebuje prawidłowej aktywności przeprogramowanego genomu.

Hodowla do blastocysty jest testem przesiewowym

Zrekonstruowane zarodki hoduje się w kontrolowanej temperaturze, pH i atmosferze. Obserwuje się bruzdkowanie, morulę, powstanie jamy blastocysty, węzła zarodkowego i trofektodermy. Współhodowla, skład medium, zawartość białka oraz napięcie tlenu mogą zmieniać wynik.

Typowa ocena morfologiczna odpowiada na pytania: czy blastocysta powstała, w jakim czasie i jak wygląda. Nie odpowiada bezpośrednio:

• czy genom został prawidłowo przeprogramowany;
• czy imprinting jest zachowany;
• czy trofektoderma utworzy funkcjonalne łożysko;
• czy wszystkie komórki mają prawidłowy kariotyp;
• czy ciąża dojdzie do terminu;
• czy cielę będzie zdrowe.

Blastocysta jest zatem kryterium kwalifikacji do kosztownego transferu, nie dowodem pełnego sukcesu. Poprawa jej odsetka może nie zmniejszyć strat ciąż.

Wąskie gardło aktywacji genomu

Przed szeroką aktywacją genomu zarodek używa zasobów oocytu. Jądro fibroblastu musi w krótkim czasie:

• wyłączyć program komórki somatycznej;
• otworzyć regulatory rozwojowe;
• zmienić modyfikacje histonów i metylację DNA;
• ustanowić właściwy rytm replikacji;
• skoordynować się z degradacją matczynych RNA.

Jeśli przeprogramowanie jest niepełne, zarodek może dojść do stadium kilku komórek, a potem zatrzymać się przy przejściu zależnym od własnej transkrypcji. Te, które przejdą do blastocysty, nadal mogą mieć subtelne błędy w trofektodermie.

Biorczyni musi być zsynchronizowana z wiekiem zarodka

Macica zmienia się po owulacji pod wpływem progesteronu. Zarodek na określonym etapie wymaga endometrium znajdującego się w odpowiadającym oknie. Biorczynie synchronizuje się, ocenia obecność i jakość ciałka żółtego, a zarodek umieszcza w rogu macicy związanym z funkcjonalnym jajnikiem.

Niezgodność czasu może obniżyć wynik niezależnie od jakości SCNT. Dlatego raport powinien podawać:

• kryteria kwalifikacji biorczyń;
• dzień cyklu i różnicę względem wieku zarodka;
• liczbę zarodków na transfer;
• świeży lub rozmrożony materiał;
• operatora i warunki transportu;
• los każdej biorczyni.

Przeniesienie wielu zarodków może zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia ciąży, ale komplikuje dobrostan, ryzyko bliźniąt i przypisanie wyniku do pojedynczego zarodka. „Ciąża na transfer” i „cielę na przeniesiony zarodek” to inne wskaźniki.

Od sygnału ciąży do placentomów

Po dotarciu do macicy bydlęcy konceptus nie implantuje się natychmiast jak zwarta kula. Trofoblast wydłuża się, zwiększając powierzchnię kontaktu z endometrium. Wydzielany interferon tau hamuje mechanizm luteolizy, dzięki czemu ciałko żółte nadal produkuje progesteron.

Później część płodowa łożyska tworzy kotyledony, które łączą się z matczynymi karunkulami. Razem tworzą placentomy — powtarzalne jednostki wymiany. Ich liczba, wielkość, unaczynienie i architektura wpływają na dostarczanie tlenu oraz substancji odżywczych.

SCNT może zaburzyć ten proces na kilku poziomach:

• konceptus wysyła zbyt słaby lub źle zsynchronizowany sygnał;
• trofoblast nie wydłuża się prawidłowo;
• placentomy są zbyt nieliczne, powiększone lub nieprawidłowo ukształtowane;
• naczynia płodowe rozwijają się słabo;
• wymiana i gospodarka płynów ulegają rozregulowaniu;
• ekspresja genów imprintowanych oraz regulatorów wzrostu odbiega od normy.⁵

Wczesne potwierdzenie ciąży mówi tylko, że zarodek przeszedł pierwszy próg. Seryjny monitoring powinien obejmować rozwój płodu, błony, płyny, łożysko i stan matki.

Hydroallantois i inne powikłania ciąży

Hydroallantois to gwałtowne nagromadzenie płynu w omoczni, często związane z dysfunkcją łożyska. Brzuch nosicielki powiększa się, rośnie ucisk na narządy, a stan może zagrażać jej zdrowiu. Nie jest to po prostu „bardzo duża ciąża”.

W ciążach SCNT u bydła obserwowano także:

• utraty zarodkowe i płodowe na różnych etapach;
• nieprawidłowe błony płodowe;
• obrzęk łożyska;
• zaburzenia przepływu i wymiany;
• wydłużoną lub nieprawidłową ciążę;
• nadmierny wzrost płodu;
• zwiększoną potrzebę interwencji położniczej.

Dobrostan biorczyni jest częścią wyniku technologii. Eutanazja płodu, przerwanie ciąży lub cesarskie cięcie nie może zniknąć z tabeli tylko dlatego, że nie powstało żywe cielę.

Large offspring syndrome: nie tylko masa urodzeniowa

Large offspring syndrome (LOS), nazywany też abnormal offspring syndrome, występuje po różnych technikach produkcji zarodków in vitro, szczególnie u przeżuwaczy. SCNT zwiększa ryzyko, ale nie jest jedyną przyczyną. Zespół wiąże się z zaburzoną regulacją wzrostu i genów imprintowanych.

Możliwe cechy obejmują:

• nadmierną masę płodu lub noworodka;
• nieproporcjonalny wzrost narządów;
• powiększony język;
• obrzęk;
• zaburzenia pępowiny i łożyska;
• nieprawidłowości mięśniowo-szkieletowe;
• niewydolność oddechową i metaboliczną;
• trudny poród.

Nie każde ciężkie cielę ma LOS i nie każde cielę z zaburzeniem SCNT przekracza próg masy. Rozpoznanie wymaga wzorca zmian, odniesienia do rasy, płci, długości ciąży i sposobu żywienia matki.

Wielkość blastocysty nie przewiduje wielkości problemu

Blastocysta zawiera dziesiątki lub setki komórek, a łożysko i płód rozwijają się przez kolejne miesiące. Mała różnica regulacyjna może narastać w czasie. Z tego powodu test in vitro nie zastąpi obserwacji ciąży, a prawidłowy kariotyp nie wyklucza błędu epigenetycznego.

Poród jest osobnym etapem ryzyka

Przy podejrzeniu nadmiernego płodu, nieprawidłowego ułożenia lub niewydolności łożyska planuje się ścisły nadzór i możliwość cesarskiego cięcia. Sama decyzja o terminie jest trudna: przedłużanie ciąży może pogłębiać wzrost, a zbyt wczesne wydobycie zwiększa niedojrzałość płuc.

Po urodzeniu ocena cielęcia obejmuje więcej niż obecność oddechu:

• drożność dróg oddechowych i utlenowanie;
• temperaturę i glikemię;
• odruch ssania;
• gazometrię i równowagę kwasowo-zasadową;
• budowę kończyn, ścięgien i stawów;
• serce, nerki, wątrobę i pępek;
• pobranie siary oraz bierne przeniesienie odporności;
• zakażenia i zdolność samodzielnego wstawania.

Zwierzę wymagające intensywnej opieki może przeżyć, ale nie powinno być raportowane w tej samej kategorii co spontanicznie urodzone zdrowe cielę. Potrzebne są oddzielne punkty końcowe: żywe urodzenie, przeżycie do 24 godzin, okresu neonatalnego, odsadzenia i dorosłości.

Zdrowy dorosły klon nie kasuje wcześniejszych strat

Część cieląt, która przeżyje okres okołoporodowy, rozwija się, rozmnaża i produkuje mleko w typowym zakresie. Badania dorosłych klonów wykazały jednak także problemy w niektórych kohortach, między innymi nieprawidłowości mięśniowo-szkieletowe i zgony po odsadzeniu. Wells i współpracownicy opisali wyniki własnego programu, podkreślając zarazem prawidłowe parametry wielu ocalałych zwierząt i potomstwa.⁶

Tych danych nie należy uśredniać w slogan:

• „klony są chore” — bo część przeżywających jest zdrowa i płodna;
• „klony są normalne” — bo ocalała grupa powstała po dużych stratach prenatalnych i neonatalnych.

To klasyczny problem selekcji przeżywających. Pytanie o stan dorosłego klonu i pytanie o bezpieczeństwo procesu SCNT wymagają innych mianowników.

Potomstwo klonu powstaje już zwykłą drogą

Gdy klon wytwarza komórki płciowe i rozmnaża się, jego potomstwo:

• przechodzi mejozę;
• otrzymuje połowę jądrowego genomu od drugiego rodzica;
• rozwija się po zapłodnieniu, nie po transferze jądra;
• ma mitochondria od matki;
• nie jest klonem rodzica.

Mejoza i rozwój linii płciowej mogą wymazać wiele nieprawidłowych stanów epigenetycznych powstałych podczas SCNT. Dane o potomstwie klonów nie są więc dowodem, że sam zabieg transferu jądra był bezpieczny; odpowiadają na pytanie, czy zwierzę może przekazać geny drogą płciową.

Co klonowanie daje hodowli, a czego nie daje

SCNT może odtworzyć genom jądrowy zwierzęcia, którego wartość poznano dopiero po latach. Komórki skóry można pobrać od wybitnej krowy lub buhaja, zamrozić i wykorzystać później. Klon może służyć jako dawca nasienia albo komórek jajowych, a jego potomstwo powstaje już konwencjonalnie.

Klonowanie:

• zachowuje istniejącą kombinację alleli;
• nie tworzy samo z siebie postępu genetycznego;
• nie kopiuje środowiska, mikrobiomu ani doświadczenia;
• nie gwarantuje identycznej wydajności mlecznej;
• nie zastępuje oceny wartości hodowlanej;
• może powielić ukryty recesywny wariant.

Jeśli ten sam genotyp jest szeroko używany, rośnie udział jego alleli w populacji i ryzyko pokrewieństwa. Klonowanie wybitnego buhaja nie zwiększa różnorodności; zwiększa liczbę nośników tego samego genomu.

Odtworzenie a ratowanie genetyki

Komórki zwierzęcia po urazie lub śmierci mogą zachować genom, gdy nie ma już nasienia albo zarodków. To nie znaczy, że każda próbka skóry nadaje się do SCNT. Liczą się czas pobrania, żywotność, zanieczyszczenie, stabilność kariotypu i możliwość utworzenia linii.

W programie zachowania rasy jeden klon odtwarza jeden genotyp, nie populację. Bankowanie nasienia, oocytów, zarodków i komórek od wielu niespokrewnionych zwierząt ma większą wartość dla różnorodności niż wielokrotne kopiowanie jednego osobnika.

SCNT jako pomost od edytowanej komórki do zwierzęcia

U bydła długo brakowało łatwego odpowiednika stabilnych zarodkowych komórek macierzystych myszy, które można modyfikować i użyć do tworzenia linii. SCNT pozwoliło edytować komórki somatyczne, wybrać linię, a potem przenieść jej jądro do oocytu.

Zastosowania obejmują:

• modele chorób i fizjologii dużego ssaka;
• zmianę składu mleka;
• odporność na określone patogeny;
• usuwanie rogów przez zmianę znanego allelu;
• produkcję białek w mleku;
• badanie funkcji genów rozwojowych.

Każdy projekt łączy dwa niezależne profile ryzyka:

1. ryzyko zmiany genomowej i hodowli pojedynczego klonu komórkowego;
2. ryzyko niepełnego przeprogramowania, ciąży i porodu po SCNT.

Prawidłowy allel nie kompensuje nieprawidłowego łożyska, a zdrowe cielę nie dowodzi braku ubocznej insercji. Walidacja musi obejmować oba tory.

Jak potwierdza się, że cielę jest klonem

Podobieństwo umaszczenia nie jest dowodem, ponieważ umaszczenie zależy także od rozwoju i rozmieszczenia komórek barwnikowych. Tożsamość genomu jądrowego sprawdza się zestawem niezależnych markerów STR lub SNP, porównując:

• cielę;
• dawcę komórki;
• dawczynię oocytu;
• biorczynię;
• inne zwierzęta w laboratorium.

Profil jądrowy cielęcia powinien odpowiadać dawcy komórki, a nie nosicielce. mtDNA powinno wskazywać przede wszystkim dawczynię oocytu. Przy linii edytowanej potwierdza się również zaplanowany allel i strukturę całego locus.

Pełny dowód obejmuje łańcuch identyfikacji próbek. Jeśli komórki, oocyty i krew cielęcia nie mają jednoznacznych identyfikatorów, nawet doskonały panel markerów może potwierdzić zgodność omyłkowo zamienionych probówek.

Jak liczyć skuteczność bez wybierania wygodnego mianownika

Proces można zapisać jako lejek:

jajniki lub zabiegi OPU
→ odzyskane kompleksy oocyt–kumulus
→ oocyty zakwalifikowane do IVM
→ dojrzałe oocyty MII
→ oocyty prawidłowo enukleowane
→ zrekonstruowane i przeżywające
→ oocyty po skutecznej fuzji
→ zarodki po aktywacji
→ bruzdkujące
→ blastocysty
→ przeniesione zarodki
→ biorczynie z ciążą
→ ciąże utrzymane
→ żywe cielęta
→ cielęta zdrowe po okresie neonatalnym
→ zdrowe zwierzęta dorosłe

Dla każdego przejścia potrzebny jest licznik i mianownik. Przykładowo:

• blastocysty / skutecznie zrekonstruowane oocyty;
• ciąże / biorczynie po transferze;
• żywe urodzenia / przeniesione zarodki;
• zdrowe cielęta po odsadzeniu / wszystkie biorczynie użyte w programie.

Nie wolno porównywać „30% blastocyst” z „10% cieląt” jak dwóch wersji tej samej miary. Pierwszy wynik opisuje etap in vitro, drugi przejście przez ciążę i poród. Równie ważna jest liczba dawczyń oocytów oraz interwencji u nosicielek.

Partia jest ukrytym poziomem eksperymentu

Sto oocytów z jednego transportu nie daje stu niezależnych powtórzeń biologicznych. Dzielą:

• czas i temperaturę transportu;
• pulę jajników;
• medium IVM;
• operatora;
• inkubator;
• partię surowicy;
• dzień przygotowania komórek dawcy.

Analiza powinna uwzględniać partie i biorczynie. W przeciwnym razie bardzo duża liczba oocytów daje pozornie wąski przedział błędu, choć procedurę wykonano tylko raz.

Co kontrolować w porównaniu protokołów

Minimalny zestaw grup zależy od pytania. Przy ocenie SCNT warto rozważyć:

• zarodki po zapłodnieniu in vitro z tej samej partii oocytów;
• oocyty aktywowane partenogenetycznie;
• SCNT ze standardową linią dawcy;
• SCNT z badaną linią lub modyfikacją;
• biorczynie o porównywalnej synchronizacji;
• nieedytowaną linię izogeniczną po podobnej hodowli.

IVF kontroluje zdolność oocytów i systemu hodowli do rozwoju po zapłodnieniu. Partenogeneza pomaga oddzielić część problemów aktywacji od transferu jądra. Nie zastępuje jednak zapłodnienia ani nie jest prawidłowym modelem całej ciąży.

Wyniki trzeba rozdzielać według operatora, dnia, źródła oocytów, linii dawcy i biorczyni. Jeśli wszystkie oocyty kontrolne obrabiano rano, a wszystkie badane po południu, efekt protokołu miesza się z czasem manipulacji.

Bezpieczeństwo żywności i dobrostan to dwa różne pytania

Analiza mięsa i mleka zdrowych dorosłych klonów nie ocenia liczby zarodków, utraconych ciąż ani ciężkich porodów. Z kolei duży koszt dobrostanowy procedury nie dowodzi, że mleko zdrowego ocalałego zwierzęcia zawiera nowy toksyczny składnik.

Badania porównawcze obejmujące ponad sto parametrów mięsa i mleka znajdowały wartości zdrowych klonów w typowym zakresie dla bydła, choć małe liczebności i selekcja zwierząt pozostają ważnym ograniczeniem.⁷ Regulatorzy rozdzielili zatem:

• ryzyko dla konsumenta;
• zdrowie klonów;
• dobrostan dawczyń i biorczyń;
• identyfikowalność oraz zasady rynku.

Stany Zjednoczone

FDA po ocenie opublikowanej w 2008 roku uznała mięso i mleko zdrowych klonów bydła, świń i kóz oraz żywność od potomstwa klonów za równie bezpieczne jak odpowiednie produkty zwierząt rozmnażanych konwencjonalnie.⁸ Jednocześnie plan zarządzania ryzykiem wskazuje na częstsze niekorzystne wyniki zdrowotne u nosicielek i bardzo młodych klonów bydła oraz owiec.⁹

Wniosek FDA dotyczy żywności od zdrowych zwierząt podlegającej zwykłym kontrolom. Nie jest stwierdzeniem, że każda ciąża SCNT albo każde urodzone cielę jest prawidłowe.

Unia Europejska

EFSA uznała w ocenach bydła i świń, że nie ma wskazania szczególnego ryzyka żywności od zdrowych klonów i ich potomstwa, ale podkreśliła małą bazę danych oraz poważne problemy zdrowia i dobrostanu w procesie klonowania.¹⁰

Aktualna strona Komisji Europejskiej rozróżnia klony i potomstwo. Żywność od klonów podlega unijnym przepisom o nowej żywności jako produkt nowej techniki i wymaga zezwolenia; produkty od potomstwa klonów nie są z tego powodu objęte rozporządzeniem Novel Food, lecz zwykłymi przepisami higienicznymi. Komisja podaje, że od wejścia obecnych przepisów w życie w styczniu 2018 roku nie wpłynął wniosek dotyczący żywności od sklonowanych zwierząt.¹¹

Prawo rynku nie wynika wyłącznie z biologicznej oceny składu. Obejmuje dobrostan, akceptację społeczną, identyfikowalność i decyzje polityczne. Status trzeba sprawdzać dla konkretnego kraju, produktu i daty.

Jak czytać publikację o klonowaniu bydła

Przed przyjęciem wyniku warto zadać dwanaście pytań:

1. Skąd pochodziły oocyty i ile było niezależnych partii?
2. Jak oceniono MII i kompetencję oocytów?
3. Z jakiej tkanki, pasażu i fazy cyklu pochodziły komórki dawcy?
4. Czy linia dawcy miała prawidłowy kariotyp i pełną kontrolę edycji?
5. Jak potwierdzono enukleację i fuzję?
6. Jaki był schemat aktywacji i czas między etapami?
7. Co było mianownikiem odsetka blastocyst?
8. Ile zarodków i biorczyń rzeczywiście użyto?
9. Jak zsynchronizowano biorczynie i monitorowano łożysko?
10. Jak raportowano utraty, przerwania ciąży i interwencje położnicze?
11. Czy tożsamość klonu potwierdzono markerami jądrowymi i mtDNA?
12. Jak długo oraz według jakich kryteriów oceniano zdrowie potomstwa?

Publikacja pokazująca jedno zdjęcie cielęcia może dowodzić żywego urodzenia. Nie wystarcza do oszacowania wydajności, dobrostanu, zdrowia dorosłego zwierzęcia ani bezpieczeństwa zastosowania komercyjnego.

Przykład rachunku bez mylącego „sukcesu”

Wyobraźmy sobie program, który rozpoczyna się od 500 zakwalifikowanych kompleksów:

400 oocytów MII
320 przeżywa enukleację i rekonstrukcję
240 ulega fuzji
180 rozpoczyna bruzdkowanie
60 osiąga blastocystę
40 blastocyst trafia pojedynczo do 40 biorczyń
12 wczesnych ciąż
5 ciąż po późniejszym punkcie kontrolnym
2 żywe cielęta
1 cielę zdrowe po odsadzeniu

To wyłącznie przykład matematyczny, nie typowa wartość biologiczna. Można z niego obliczyć:

• 60/240 = 25% blastocyst na oocyt po fuzji;
• 12/40 = 30% wczesnych ciąż na biorczynię;
• 2/40 = 5% żywych urodzeń na transfer;
• 1/500 = 0,2% zdrowych cieląt po odsadzeniu na kompleks wejściowy.

Każde zdanie jest prawdziwe, ale opisuje inny etap. Wybranie wyłącznie 30% pozwala reklamować „wysoką skuteczność”, mimo że pełny proces dał jedno zdrowe zwierzę i objął czterdzieści nosicielek.

Co trzeba zapamiętać

1. Przewaga bydła jako modelu wynika z zaplecza embriologicznego i dostępności oocytów, nie z wysokiej skuteczności SCNT.
2. Jajniki z rzeźni dają skalę, lecz zwiększają zmienność i ograniczają metadane; OPU daje znaną dawczynię kosztem zabiegów.
3. Ciałko kierunkowe potwierdza dojrzewanie jądrowe, ale nie pełną kompetencję cytoplazmy.
4. Komórka dawcy wnosi nie tylko genotyp, lecz także skutki pasaży, selekcji i uszkodzeń genomu.
5. Enukleacja musi usunąć wrzeciono, zachowując możliwie dużo funkcjonalnej cytoplazmy.
6. Aktywacja i pierwsze podziały nie dowodzą poprawnego przeprogramowania; u bydła ważnym progiem jest szeroka aktywacja genomu około stadium ośmiu komórek.
7. Blastocysta jest etapem przesiewowym, a nie końcowym dowodem sukcesu.
8. W ciążach SCNT szczególnie ważne są trofoblast, placentomy, gospodarka płynów, LOS i zdrowie biorczyni.
9. Zdrowy dorosły klon może funkcjonować prawidłowo, ale nie reprezentuje zarodków i cieląt utraconych wcześniej.
10. Potomstwo klonu uzyskane płciowo nie jest klonem i nie przechodzi przez SCNT.
11. Ocena żywności i ocena dobrostanu procedury są odrębnymi analizami, a USA i UE stosują różne ramy rynkowe.
12. Każda „wydajność” wymaga nazwania licznika, mianownika, czasu obserwacji i liczby niezależnych partii.

Ogólną logikę etapów pokazuje SCNT krok po kroku. Mechanizmy powikłań rozwija artykuł Łożysko, ciąża i large offspring syndrome, a zapis faz dawcy i oocytu wyjaśnia Cykl komórkowy, ploidalność i ilość DNA.