Imprinting, mitochondria i chromosom X

Streszczenie

Klon po SCNT nie jest prostym „przepisaniem DNA” komórki dawcy. Jego genom jądrowy pochodzi od tej komórki, lecz część genów jądrowych działa zależnie od pochodzenia rodzicielskiego allelu, mitochondria i większość mtDNA pochodzą z oocytu, a chromosom X przechodzi program dawkowania obejmujący setki genów. Te trzy układy mają inne nośniki informacji, inne osie czasu i inne metody kontroli.

Imprinting wymaga zachowania wybranych asymetrii allelicznych podczas szerokiego resetu epigenomu. Mitochondria tworzą populację tysięcy genomów, której skład może zmieniać się przez dryf i selekcję. Regulacja X wymaga natomiast usunięcia somatycznej historii dawcy i ustanowienia programu właściwego dla płci, gatunku, stadium oraz linii zarodkowej lub pozazarodkowej.

Wspólny błąd interpretacyjny polega na uznaniu zgodności sekwencji jądrowego DNA za dowód, że klon odziedziczył i uruchomił wszystko tak jak dawca. To potwierdza tylko część pochodzenia. Pełna analiza musi śledzić allele, mtDNA, RNA, chromatynę, tkanki i czas.

Trzy układy, nie trzy odmiany jednego zjawiska

Imprinting, dziedziczenie mitochondrialne i inaktywacja X bywają wymieniane razem, ponieważ nie wystarcza do nich standardowe porównanie sekwencji autosomalnego DNA. Biologicznie nie są jednak jednym systemem „dziedziczenia pozagenetycznego”.

Układ	Główny nośnik	Co wnosi SCNT	Podstawowe pytanie
imprinting	allele jądrowe i znaki zależne od pochodzenia	dwa allele jednego somatycznego dawcy	czy właściwy allel zachował właściwą dawkę?
mitochondria	organelle i wiele kopii mtDNA	dużo mitochondriów oocytu, czasem mało mitochondriów dawcy	jaki jest skład populacji mtDNA w każdej tkance?
chromosom X	chromosom jądrowy, RNA Xist i chromatyna	aktywny lub nieaktywny X z historią somatyczną	czy zarodek ustanowił dawkowanie właściwe dla płci i stadium?

Imprinting jest selektywnym wyjątkiem od resetu. Mitochondria są cytoplazmatycznym układem dziedziczenia. Inaktywacja X jest rozległym, dynamicznym programem dawkowania chromosomu. Wspólny eksperyment może mierzyć wszystkie trzy, ale nie jednym testem.

Cztery pytania porządkują każdy system

Zanim wynik zostanie nazwany „prawidłowym dziedziczeniem”, trzeba ustalić:

1. Pochodzenie — od której komórki, gamety lub oocytu pochodzi badany allel albo organellum?
2. Stan — czy nośnik jest obecny, aktywny, wyciszony, metylowany lub liczny?
3. Rozkład — czy wynik dotyczy całego zarodka, jednej linii, tkanki czy pojedynczych komórek?
4. Funkcja — czy stan zmienia ekspresję, metabolizm, łożysko, rozwój albo zdrowie?

Na przykład wykrycie mtDNA dawczyni oocytu odpowiada na pytanie o pochodzenie, lecz nie dowodzi sprawnego oddychania. Obecność RNA Xist odpowiada częściowo na pytanie o stan, ale nie pokazuje, ile genów X rzeczywiście wyciszono. Metylacja jednego regionu imprintowanego nie certyfikuje pozostałych domen.

Imprinting: dwie kopie DNA nie zawsze mają tę samą funkcję

Większość autosomalnych genów może korzystać z obu alleli. W genach imprintowanych aktywność zależy od tego, czy allel przeszedł przez oogenezę czy spermatogenezę. W komórce potomstwa oba allele mają prawie tę samą sekwencję funkcjonalnego genu, ale różnią się stanem regionu kontrolnego i wynikającym z niego dostępem regulatorów.¹

Określenia są łatwe do pomylenia:

• gen matczyno eksprymowany korzysta głównie z allelu odziedziczonego od matki;
• gen ojcowsko eksprymowany korzysta głównie z allelu odziedziczonego od ojca;
• imprint „matczyny” może oznaczać znak ustanowiony w oocycie, często prowadzący do wyciszenia tego allelu;
• pochodzenie allelu nie oznacza płci osobnika, który jest badany.

Samiec i samica mają matczyne oraz ojcowskie allele autosomalne. Różnica dotyczy historii gamety, nie aktualnej płci organizmu.

Znaki ustanawia linia płciowa, a odczytuje zarodek

Podczas powstawania pierwotnych komórek płciowych stare imprinty są szeroko usuwane. W rosnących oocytach i rozwijających się plemnikach ustanawia się nowe znaki zgodne z płcią osobnika tworzącego gamety. Po zapłodnieniu genom przechodzi rozległe przeprogramowanie, ale regiony kontrolujące imprinting muszą zostać ochronione.

Cykl można zapisać:

imprint rodziców → rozwój zarodka → wymazanie w jego linii płciowej → ustanowienie imprintu według płci tego osobnika → następne pokolenie

Dlatego błąd wykryty w komórce skóry dawcy może mieć dwa znaczenia. Może zaburzać rozwój konkretnego klonu, a jeżeli dotrze do komórek płciowych i nie zostanie poprawnie wymazany, może też wpłynąć na następne pokolenie. Jedno nie wynika automatycznie z drugiego.

Kanoniczny imprinting opiera się na regionach kontrolnych

W kanonicznym imprintingu centralną rolę pełnią gametyczne regiony różnie metylowane, gDMR, które po zapłodnieniu działają jako imprinting control regions, ICR. Metylacja nie musi leżeć w promotorze genu, którego dawkę reguluje. Może zmieniać wiązanie izolatora, aktywność długiego niekodującego RNA albo stan całej domeny.

Po replikacji DNMT1 i białka rozpoznające hemimetylowane DNA pomagają utrzymać wzór. Czynniki ochronne, między innymi ZFP57 i TRIM28/KAP1 w części loci, ograniczają utratę metylacji podczas globalnego resetu. Ochrona nie jest jednak identyczna dla każdego regionu, gatunku i stadium.

Zdanie „metylacja wróciła do normy” wymaga więc locus, allelu i czasu. Średnia całego genomu nie mówi, czy jeden krytyczny ICR stracił asymetrię.

Domena H19/IGF2: izolator zamiast prostego przełącznika

Region H19/IGF2 pokazuje, dlaczego imprinting jest regulacją domeny. W klasycznym modelu mysim matczyny ICR pozostaje niemetylowany, wiąże CTCF i oddziela Igf2 od wspólnych enhancerów. Wtedy aktywne jest H19, a Igf2 jest ograniczony. Na allelu ojcowskim ICR jest metylowany, CTCF nie wiąże się, enhancery mogą aktywować Igf2, a H19 pozostaje wyciszony.²

Nie jest to proste równanie „więcej metylacji = mniej ekspresji”. Metylacja jednego elementu usuwa izolator i pośrednio umożliwia ekspresję odległego genu. Wynik zależy od:

• allelu;
• miejsca metylacji;
• kontaktów przestrzennych;
• dostępnych enhancerów;
• tkanki i stadium.

Zaburzenie dawki IGF2 może wpływać na wzrost płodu i łożyska, lecz nadmiernego wzrostu klonowanych zwierząt nie wolno sprowadzać do jednego genu. Large offspring syndrome jest fenotypem wieloczynnikowym i gatunkowo zależnym.

Co jądro somatyczne wnosi do SCNT

Komórka dawcy ma oba allele po przejściu zapłodnienia, rozwoju i różnicowania. Kanoniczne ICR powinny nadal wskazywać ich pochodzenie rodzicielskie. SCNT nie musi tworzyć tej asymetrii od zera tak jak sztucznie złożony genom z dwóch identycznych zestawów rodzicielskich.

Musi jednak:

• zachować prawidłową metylację ICR podczas hodowli dawcy;
• ochronić ją po transferze i aktywacji;
• usunąć somatyczne znaki sąsiedniej chromatyny;
• uruchomić właściwą, tkankową ekspresję alleliczną;
• nie pomylić ochrony imprintu z zachowaniem całej pamięci fibroblastu.

To wymaganie selektywności jest trudniejsze niż globalne „wymazanie epigenomu”. Oocyt ma resetować większość programu dawcy, oszczędzając małą grupę funkcjonalnych asymetrii.

Hodowla dawcy może zmienić imprinting przed transferem

Komórki dawcy są często namnażane, selekcjonowane i modyfikowane przed SCNT. Długi czas hodowli, stres metaboliczny, gęstość, surowica, klonalna selekcja i manipulacja genetyczna mogą zmienić metylację lub ekspresję domen imprintowanych.

Porównanie po transferze powinno obejmować wyjściową linię dawcy. Jeżeli ICR był nieprawidłowy już w fibroblastach, wynik nie dowodzi, że oocyt stworzył błąd. Jeśli dawca był prawidłowy, a zarodek traci znak między aktywacją i blastocystą, mechanizm leży w utrzymaniu lub przeprogramowaniu.

Najlepszy projekt przechowuje próbki z kilku etapów pasażowania i nie traktuje nazwy „fibroblast” jako pełnej charakterystyki epigenetycznej.

Niekanoniczny imprinting nie używa początkowo metylacji DNA

Badania mysich oocytów i zarodków wykazały drugi mechanizm. Matczyny H3K27me3 może wyciszać wybrane allele bez gametycznej różnicy metylacji DNA. W moruli takie loci wykazują ojcowską ekspresję, ponieważ allel matczyny pozostaje pokryty represyjną chromatyną. Usunięcie H3K27me3 demetylazą derepresuje allel matczyny.³

Ten imprint jest szczególnie ważny dla części genów w liniach pozazarodkowych. W epiblaście wiele niekanonicznych asymetrii zanika. W trofoblaście część programu utrzymuje się lub zostaje zastąpiona wtórnym mechanizmem represji.

Jądro somatyczne nie ma już oocytowego układu H3K27me3. Dlatego SCNT może zachować kanoniczne ICR, a równocześnie utracić niekanoniczny imprint. Jedno badanie metylacji DNA nie wykryje tej drugiej klasy.

Sfmbt2: dawka mikroRNA i anatomia łożyska

W mysich łożyskach SCNT domena Sfmbt2 traci imprinting zależny od H3K27me3. W obrębie genu leży duży klaster mikroRNA. Jego nadmierna aktywność obniża ekspresję wielu genów docelowych i przyczynia się do rozszerzenia warstwy spongiotrofoblastu.

Eksperymentalna korekta dawki klastra mikroRNA zmniejszała masę łożysk i poprawiała część wyników rozwojowych, chociaż nie usuwała wszystkich nieprawidłowości histologicznych.⁴ To silniejszy dowód niż sama lista genów o zmienionej ekspresji, ponieważ łączy:

utrata znaku → bialleliczna lub nadmierna ekspresja → wiele celów RNA → tkanka → ciąża

Mechanizm nie oznacza, że Sfmbt2 jest główną przyczyną każdego zaburzenia łożyska w każdym ssaku. Niekanoniczny imprinting jest mniej konserwatywny niż ogólna zasada imprintingu.

Naczelne przypominają, że imprinting jest gatunkowo swoisty

U makaka rezusa analizy SCNT wykazały utratę imprintingu i zmiany metylacji w blastocystach, dalszych strukturach zarodkowych oraz łożyskach. Wymiana trofoblastu SCNT na trofoblast z zarodka ICSI umożliwiła uzyskanie żywego klonu, wskazując funkcjonalnie na linię pozazarodkową jako krytyczne wąskie gardło.⁵

Nie można jednak wprost nałożyć mysiej listy genów imprintowanych na naczelne. Domeny, tkankowa swoistość i sposób utrzymania znaków ewoluują. Konserwatywny jest problem dawki zależnej od pochodzenia; konkretna mapa musi zostać ustalona dla badanego gatunku.

Jak udowodnić ekspresję zależną od pochodzenia

Sekwencjonowanie RNA pokaże stosunek alleli tylko wtedy, gdy allele różnią się wariantem informacyjnym. Potrzebne są heterozygotyczne SNP oraz wiedza, który wariant pochodzi od matki, a który od ojca dawcy jądra.

W SCNT bywa to trudne, bo rodzice dawcy komórki nie są dostępni. Można użyć:

• znanego krzyżowania dwóch szczepów lub ras;
• fazowania genomu dawcy i jego rodziców;
• długich odczytów łączących SNP z haplotypem;
• alleloswoistej metylacji i chromatyny jako dowodu uzupełniającego.

Bias mapowania może sztucznie faworyzować allel bardziej podobny do genomu referencyjnego. Analiza wymaga personalizowanego genomu lub maskowania wariantów i kontroli krzyżowania wzajemnego.

Metylacja, RNA i funkcja odpowiadają na różne pytania

Prawidłowy ICR nie gwarantuje prawidłowej ekspresji, a monoalleliczne RNA nie zawsze oznacza imprinting. Przy małej liczbie cząsteczek jeden allel może nie zostać wykryty przez losowe próbkowanie. Klonalna monoalleliczność i inaktywacja X są innymi zjawiskami.

Panel dla domeny imprintowanej powinien łączyć:

1. fazowany genotyp;
2. alleloswoistą metylację ICR;
3. chromatynę właściwą dla mechanizmu;
4. alleloswoistą ekspresję w konkretnej tkance;
5. dawkę białka albo RNA funkcjonalnego;
6. fenotyp rozwojowy;
7. perturbację przyczynową, jeżeli jest możliwa.

Artykuł Jak czyta się epigenom rozwija ograniczenia metod. W imprintingu szczególnie ważna jest faza alleli, której nie zastępuje większa liczba odczytów.

Mitochondrium nie jest pojedynczą baterią

Komórka zawiera sieć zmieniających kształt organelli, które dzielą się, łączą, przemieszczają i są usuwane przez mitofagię. Mitochondria produkują ATP, buforują wapń, uczestniczą w redoks, apoptozie i dostarczają metabolitów enzymom epigenetycznym.

W mitochondriach znajdują się liczne kopie kolistego mtDNA. Genom ssaczy koduje 13 polipeptydów łańcucha oddechowego, 22 tRNA i 2 rRNA. Zdecydowana większość białek mitochondrialnych jest jednak kodowana w jądrze, syntetyzowana w cytoplazmie i importowana do organellum.

Dlatego funkcja zależy od współpracy:

genom jądrowy + mtDNA + liczba kopii + stan organelli + metabolizm tkanki

Sekwencja mtDNA jest tylko jednym elementem.

Oocyt wnosi ogromną populację mtDNA

Dojrzały oocyt zawiera znacznie więcej kopii mtDNA niż typowa komórka somatyczna. Enukleacja usuwa chromosomy oocytu, ale nie usuwa jego cytoplazmy i mitochondriów. W zależności od techniki transferu komórka dawcy może wnieść całe własne mitochondria albo niemal samo jądro.

Po SCNT powstaje więc asymetria:

• genom jądrowy pochodzi zasadniczo od komórki dawcy;
• mtDNA pochodzi głównie od dawczyni oocytu;
• niewielki carry-over mtDNA dawcy może pozostać poniżej progu wykrycia albo utworzyć heteroplazmię;
• białka, RNA, lipidy i metabolity mitochondrialne na początku także pochodzą głównie z oocytu.

To nie czyni klonu „półklonem”. Pokazuje tylko, że klonalność zawsze wymaga wskazania, którego genomu dotyczy.

Dolly i bydło dały pozornie sprzeczne wyniki

W Dolly i dziewięciu innych owcach po transferze jądra wykryto mtDNA dawczyni oocytu, bez wykrywalnego udziału mtDNA komórki somatycznej.⁶ Niedługo później u klonowanego bydła opisano heteroplazmię z udziałem mtDNA dawcy jądra.⁷

Wyniki są zgodne, jeżeli uwzględni się:

• próg czułości zastosowanej metody;
• liczbę mitochondriów przeniesionych z komórką;
• fuzję całej komórki w porównaniu z bezpośrednim wstrzyknięciem jądra;
• warianty umożliwiające rozróżnienie populacji mtDNA;
• tkankę i wiek pobrania próbki;
• losowy dryf oraz selekcję podczas rozwoju.

„Nie wykryto” nie oznacza „ani jedna cząsteczka nie weszła”. Z kolei wykrywalna heteroplazmia nie dowodzi patologii.

Heteroplazmia jest rozkładem, nie etykietą

Heteroplazmia oznacza współistnienie co najmniej dwóch wariantów mtDNA. Wynik 5% w próbce mięśnia jest średnią. Może oznaczać 5% w niemal każdej komórce, małą liczbę komórek z wysokim udziałem albo mieszaninę kilku klonów komórkowych.

Pełny opis ma co najmniej cztery osie:

wariant × udział × tkanka lub komórka × czas

Ten sam wariant może pozostać neutralny przy małym udziale, przekroczyć próg funkcjonalny w tkance o dużym zapotrzebowaniu energetycznym albo zostać wyeliminowany przez selekcję. Nie istnieje jeden próg chorobowy dla wszystkich zmian mtDNA.

Dryf i selekcja działają równocześnie

Podczas podziałów komórkowych mitochondria i ich genomy są rozdzielane niedokładnie. Mała efektywna liczba kopiowanych genomów może zwiększać losowe odchylenia. Później replikacja mtDNA, mitofagia, proliferacja komórek i metabolizm tkanki mogą faworyzować jedne warianty.

Eksperymenty na pojedynczych liniach komórkowych pokazały, że udział wariantu może zmieniać się przez selekcję na poziomie sprawności komórki, a znak tej selekcji zależy od środowiska metabolicznego.⁸ Nie jest to badanie SCNT, lecz ważna zasada interpretacji klonów: stabilny udział w jednej tkance i warunku nie gwarantuje stabilności wszędzie.

Porównanie noworodka z dorosłym zwierzęciem powinno rozróżniać dryf, selekcję wewnątrzkomórkową i selekcję całych komórek. Sama zmiana procentu nie wskazuje mechanizmu.

Liczba kopii mtDNA jest inną zmienną niż heteroplazmia

Komórka z 1% wariantu przy tysiącu kopii mtDNA i komórka z 1% przy stu kopiach mają podobny stosunek, lecz inny zasób genomów. We wczesnym rozwoju liczba kopii na komórkę zmniejsza się wskutek kolejnych podziałów, zanim biosynteza mitochondrialna zostanie szerzej wznowiona.

Pomiar powinien obejmować:

• całkowitą liczbę kopii mtDNA względem genomu jądrowego;
• udział poszczególnych wariantów;
• liczbę i morfologię organelli;
• ekspresję oraz aktywność kompleksów oddechowych;
• zużycie tlenu, potencjał błony i metabolity;
• rozkład między komórkami i tkankami.

Wysoka liczba mitochondriów nie musi oznaczać wysokiej jakości. Może być kompensacją dysfunkcji.

Jądro i mitochondria muszą współpracować

Kompleksy fosforylacji oksydacyjnej składają się z podjednostek kodowanych przez oba genomy. Jądro koduje także polimerazę mtDNA, czynniki transkrypcyjne, rybosomalne białka mitochondrialne, system importu, dynamikę i mitofagię.

Wewnątrzgatunkowa różnica haplotypów zwykle nie prowadzi automatycznie do choroby. Może jednak zmienić subtelne parametry metabolizmu, szczególnie gdy genom jądrowy i mtDNA pochodzą z odległych linii. W międzygatunkowym transferze jądra problem staje się większy: niezgodność sekwencji, komunikacji jądrowo-mitochondrialnej i czasu rozwoju nakłada się na wszystkie inne bariery.

Termin „niedopasowanie” powinien być poparty funkcją. Sama odmienność haplotypu jest hipotezą, nie dowodem defektu.

SCNT nie jest tym samym co mitochondrial replacement therapy

W obu procedurach przenosi się materiał jądrowy do cytoplazmy innego oocytu, lecz substrat i cel są inne. W mitochondrial replacement therapy, MRT, przenoszony karyoplast pochodzi z oocytu lub zygoty i zawiera stosunkowo dużo otaczającej cytoplazmy. W SCNT przenosi się jądro albo komórkę somatyczną i dodatkowo wymusza przeprogramowanie tożsamości.

Badania ludzkich rekonstruktów pokazały, że somatyczne komórki dawcy mogą wnosić mało mtDNA, a w wielu zarodkach udział pozostaje poniżej progu oznaczenia. Nie wyklucza to preferencyjnej replikacji rzadkiego wariantu później.⁹

Doświadczenia z MRT są użyteczne dla mechaniki carry-over i dryfu, ale nie dowodzą pełnej kompetencji rozwojowej SCNT.

ntESC dziedziczą mitochondria inaczej niż jądro

Linia zarodkowych komórek macierzystych wyprowadzona z blastocysty SCNT ma jądrowy genom dawcy komórki, lecz jej mtDNA zwykle pochodzi przede wszystkim z oocytu. Podczas wyprowadzania linii zachodzi kolejna selekcja komórek i mitochondriów.

W ludzkim SCNT prowadzącym do ntESC wykazano możliwość uzyskania stabilnych linii z genomem jądrowym dawcy i mitochondrialnym wkładem oocytu.¹⁰ Potencjalna zgodność immunologiczna nie jest zatem absolutna: białka kodowane przez mtDNA i różnice metaboliczne pozostają osobnym wymiarem.

Nie oznacza to, że każda różnica mtDNA wywoła odrzucenie. Oznacza, że określenie „autologiczna linia” trzeba rozbić na zgodność jądrową, mitochondrialną, immunologiczną i funkcjonalną.

Jak mierzyć mtDNA bez fałszywej pewności

Do wykrycia niskiej heteroplazmii potrzebna jest metoda o znanym błędzie tła. Zwykłe sekwencjonowanie o umiarkowanym pokryciu może nie odróżnić 0,2% wariantu od błędów polimerazy i aparatu. UMI, replikaty, sekwencjonowanie dupleksowe lub cyfrowy PCR mogą obniżyć granicę oznaczalności.

Trzeba też uważać na NUMT — fragmenty mitochondrialnego DNA wbudowane do genomu jądrowego. Nieswoisty starter lub krótki odczyt może przypisać je mtDNA. Kontrola obejmuje długie amplikony, mapowanie do obu genomów i próbki dawcy jądra oraz oocytu.

Minimalny zestaw próbek to:

• komórka lub linia dawcy;
• oocyt albo dawczyni oocytu;
• rekonstrukty na kilku etapach;
• kilka tkanek potomstwa lub linii ntESC;
• pomiar powtórzony w czasie.

Chromosom X stawia problem dawki, nie tylko płci

Chromosom X zawiera wiele genów niezwiązanych bezpośrednio z determinacją płci. Samice ssaków mają zwykle dwa X, a samce jeden. Bez kompensacji komórki XX otrzymywałyby podwójną dawkę wielu produktów względem XY i autosomów.

Inaktywacja X, XCI, wycisza dużą część jednego chromosomu w komórkach XX. Nie jest jednak całkowitym wyłączeniem:

• część genów ucieka inaktywacji;
• zakres ucieczki zależy od gatunku, tkanki i osobnika;
• aktywny X może podlegać regulacji względem autosomów;
• wczesny zarodek i tkanki pozazarodkowe mają odmienne programy.

Stwierdzenie „jeden X jest wyłączony” jest użytecznym skrótem, nie kompletnym modelem dawkowania.

Xist tworzy domenę w cis

Xist koduje długie niekodujące RNA. Cząsteczka pozostaje w sąsiedztwie chromosomu, z którego została przepisana, rozprzestrzenia się po nim i rekrutuje białka wyciszające. SPEN uczestniczy we wczesnym ograniczeniu transkrypcji, a kompleksy Polycomb ustanawiają między innymi H2AK119ub i H3K27me3. Z czasem utrwalają się zmiany dostępności, replikacji i organizacji przestrzennej.

RNA Xist nie wycisza dowolnie wszystkich chromosomów w jądrze. Działa zasadniczo w cis, ale jego ekspresja musi rozpocząć się z właściwego X, w odpowiedniej liczbie kopii i czasie.

Pomiar samej ilości RNA bez lokalizacji jest słaby. Niski sygnał rozproszony, punkt transkrypcji i chmura pokrywająca chromosom oznaczają inne etapy.

Myszy najpierw inaktywują, potem reaktywują i wybierają ponownie

W mysim zarodku wczesna inaktywacja jest imprintowana: w komórkach samicy wyciszany jest przede wszystkim ojcowski X. W komórkach węzła zarodkowego następuje jego reaktywacja, a następnie podczas różnicowania epiblastu losowy wybór jednego X do inaktywacji. W liniach pozazarodkowych imprintowany program utrzymuje się dłużej.

Somatyczna komórka dawcy XX wnosi już jeden aktywny i jeden nieaktywny X. Oocyt musi usunąć utrwalony stan Xi w odpowiedniej linii, przejść przez etap wczesnego programu i później ustanowić XCI od nowa. Komórka XY wnosi jeden aktywny X, który nie powinien zostać globalnie wyciszony.

To pokazuje, dlaczego SCNT nie polega na zachowaniu somatycznej inaktywacji. Prawidłowy stan dawcy jest niewłaściwym stanem dla wczesnego zarodka.

Ektopowe Xist jest przyczynową barierą mysiego SCNT

W mysich zarodkach SCNT obserwowano nieprawidłową ekspresję Xist z chromosomu, który powinien pozostać aktywny. Towarzyszyło jej szerokie obniżenie ekspresji genów X. Genetyczne uniemożliwienie takiej aktywacji poprawiło rozwój klonów.¹¹

Kolejne doświadczenia z przejściowym RNAi przeciw Xist poprawiały przeżycie po implantacji i w konkretnym układzie zwiększyły odsetek urodzeń z około 1% do 12%.¹² Łańcuch przyczynowy obejmował:

ektopowe RNA → wyciszenie chromosomu → korekta RNA → przywrócenie dawki → poprawa rozwoju

Nie dowodzi to, że każda strata SCNT wynika z X ani że trwałe wyłączenie Xist jest bezpieczne. Prawidłowa XCI będzie potrzebna później.

Płeć dawcy zmienia szczegóły, ale nie usuwa problemu

W rekonstrukcie XY ektopowe pokrycie jedynego X może obniżyć dawkę bez zapasowego allelu. W XX można nieprawidłowo wyciszyć oba chromosomy, nie reaktywować starego Xi albo ustanowić mozaikę różnych błędów.

Analiza powinna raportować:

• kariotyp i płeć chromosomową dawcy;
• płeć każdego zarodka, jeżeli kohorta jest mieszana;
• pochodzenie aktywnego i nieaktywnego X;
• udział komórek z zerem, jedną lub dwiema chmurami Xist;
• ekspresję wielu genów X, w tym genów uciekających XCI.

Średnia z zarodków XX i XY może ukryć przeciwne mechanizmy.

Imprint Xist łączy dwa systemy

U myszy matczyny H3K27me3 wycisza Xist na allelu matczynym we wczesnym zarodku. Utrata tego znaku może uruchomić matczyny Xist i spowodować niewłaściwą inaktywację matczynego X.¹³ Jest to punkt, w którym imprinting i regulacja X rzeczywiście się przecinają.

Nie znaczy to, że wszystkie geny imprintowane są regulowane jak X ani że XCI jest zwykłym imprintingiem. To jeden locus wykorzystujący informację o pochodzeniu do uruchomienia chromosomowego programu dawkowania.

W SCNT somatyczne jądro nie wnosi matczynego, oocytowego H3K27me3 w locus Xist. Oocyt musi poradzić sobie z chromosomem, którego historia nie odpowiada historii przedjądrza.

Człowiek nie realizuje kopii mysiego programu

Wczesna regulacja X u człowieka pozostawała przedmiotem sporów, ponieważ różne metody dawały obrazy pełnej inaktywacji, częściowego wyciszenia albo obniżenia ekspresji z dwóch aktywnych X. Nowsze eksperymenty w naiwnych ludzkich komórkach pluripotentnych wskazują, że XIST może pokrywać aktywne X, rekrutować Polycomb i przez SPEN tłumić ekspresję wielu genów przed pełną XCI.¹⁴

Wniosek praktyczny nie brzmi „człowiek używa dampeningu zamiast inaktywacji” jako raz na zawsze zamknięta reguła. Brzmi:

• obecność XIST nie wystarcza do ogłoszenia pełnej XCI;
• liczba aktywnych alleli musi być mierzona gen po genie i komórka po komórce;
• modele z naiwnych hESC odwzorowują część wczesnego rozwoju, ale nie cały zarodek;
• mysia interwencja przeciw Xist nie może być automatycznie przeniesiona na ludzkie SCNT.

Makak, człowiek i mysz wymagają osobnych osi czasu

Gatunki różnią się terminem ZGA, długością rozwoju przedimplantacyjnego, regulacją Xist/XIST, reaktywacją X oraz zachowaniem trofoblastu. Nawet homologiczny gen może uciekać XCI w jednym gatunku, a podlegać jej w drugim.

Porównanie powinno używać czasu biologicznego:

ZGA → specyfikacja linii → implantacja → różnicowanie tkanek

Zestawienie „dzień 4 u myszy” z „dniem 4 u człowieka” nie jest dopasowaniem stadium. Podobna morfologia również nie gwarantuje podobnej dynamiki chromosomu X.

Trzy systemy wymagają trzech paneli pomiarowych

Pytanie	Imprinting	Mitochondria	Chromosom X
pochodzenie	fazowane SNP rodziców	warianty mtDNA dawcy i oocytu	haplotyp X dawcy
stan molekularny	ICR, H3K27me3, RNA alleliczne	kopie mtDNA, heteroplazmia, organelle	RNA-FISH Xist, H3K27me3, dostępność
rozkład	tkanka i allel	komórka, tkanka i czas	komórka, linia i płeć
funkcja	dawka genu, wzrost, łożysko	OXPHOS, metabolizm, zdrowie	ekspresja X względem autosomów, rozwój

Kariotyp widzi liczbę chromosomów, ale nie alleliczny imprint. STR potwierdza pochodzenie jądra, ale nie mtDNA. Bulk RNA-seq pokazuje średnią ekspresję X, ale może ukryć komórki z dwoma skrajnymi stanami.

Słowo „matczyny” ma tu trzy różne znaczenia

W jednym akapicie można spotkać:

1. matczyny allel genu imprintowanego — pochodzący z oocytu, z którego powstał dawca jądra;
2. mtDNA dawczyni oocytu użytego jako cytoplast w SCNT;
3. organizm nosicielki ciąży, który nie przekazuje genomu zarodkowi.

To mogą być trzy różne osobniki. Dodatkowo dawczyni komórki somatycznej może być samicą, ale jej dwa allele autosomalne nadal mają własne pochodzenie matczyne i ojcowskie.

Precyzyjny opis powinien używać określeń „rodzic dawcy jądra”, „dawczyni cytoplastu” i „nosicielka”, a nie jednego słowa „matka”.

Układy mogą oddziaływać, lecz nie wolno sklejać przyczyn

Metabolity mitochondrialne wpływają na enzymy modyfikujące chromatynę. Nieprawidłowy trofoblast może zmienić tlenowanie i wtórnie mitochondria płodu. Xist rekrutuje modyfikacje histonów, a jego własna regulacja może zależeć od imprintu H3K27me3.

Zależność biologiczna nie oznacza, że jeden odczyt zastępuje drugi. Niska acetylacja może być skutkiem metabolizmu, a nie dowodem niezgodności mtDNA. Powiększone łożysko może wynikać z imprintingu, różnicowania trofoblastu, hodowli, unaczynienia lub kilku przyczyn.

Najlepszy model wskazuje kolejność:

zmienna wejściowa → mechanizm pośredni → mierzalna dawka → tkanka → fenotyp

Jeżeli brakuje ogniwa, należy mówić o związku albo hipotezie.

Projekt doświadczenia powinien rozdzielać dawców

SCNT ma co najmniej trzy biologiczne źródła zmienności: linię komórki dawcy, partię oocytów i nosicielkę. Aby oddzielić jądro od cytoplazmy, warto stosować krzyżowy projekt:

• ta sama linia jąder w oocytach kilku dawczyń;
• kilka linii jąder w oocytach tej samej partii;
• warianty mtDNA umożliwiające śledzenie;
• płeć dawcy i zarodka jako jawna zmienna;
• kontrole IVF lub ICSI dopasowane do dawczyni oocytu;
• rozdzielenie zarodków między kilka nosicielek.

Jedna udana ciąża nie pozwala przypisać wyniku konkretnemu układowi. Jednostką biologiczną nie zawsze jest pojedynczy blastomer: komórki jednego zarodka dzielą historię rekonstrukcji.

Jak czytać twierdzenie „klon jest genetycznie identyczny”

Przed zaakceptowaniem takiego zdania warto zapytać:

1. Czy porównano cały genom jądrowy, panel STR czy kilka markerów?
2. Czy zbadano mozaikowość i aberracje powstałe w hodowli?
3. Czy „identyczność” obejmuje mtDNA, czy świadomie tylko jądro?
4. Jaka była granica wykrycia mtDNA dawcy?
5. Czy sprawdzono imprinting alleloswoisty, a nie tylko sekwencję?
6. Czy zbadano ekspresję i dawkowanie X?
7. W ilu tkankach i w jakim wieku wykonano pomiary?
8. Czy podobieństwo molekularne połączono z funkcją?

Najbardziej precyzyjne zdanie zwykle brzmi: „zwierzę ma genom jądrowy pochodzący od komórki dawcy, mtDNA głównie od dawczyni oocytu i własny, rozwojowo ukształtowany epigenom”.

Najkrótsza mapa różnic

Imprinting pyta, który allel jądrowy powinien działać. Mitochondria pytają, jaka populacja cytoplazmatycznych genomów zasila komórki. Regulacja X pyta, ile produktów całego chromosomu ma powstać w określonej linii i czasie.

W SCNT:

jądro dawcy nie równa się całemu dziedziczeniu

zgodna sekwencja nie równa się właściwej dawce

niewykryty wariant nie równa się absolutnej nieobecności

prawidłowa blastocysta nie równa się prawidłowemu łożysku i zdrowiu

Kolejny artykuł, Łożysko, ciąża i large offspring syndrome, pokazuje, jak błędy dawki, przeprogramowania i trofoblastu stają się problemem całego organizmu oraz nosicielki. Artykuł Genom to nie cały organizm umieszcza te trzy systemy w szerszym modelu fenotypu.